兩株代謝咖啡酸人腸道來源菌株的篩選、鑒定及其代謝過程初探

楊 雯，胡海明，劉洪濤，魏曉博，劉慧燕, ，方海田,

（1.寧夏大學食品科學與工程學院，寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏銀川 750021；2.湖北中醫藥大學基礎醫學院，湖北武漢 430065）

咖啡酸（Caffeic acid，CA）又叫做3,4-二羥基肉桂酸，是一類天然的酚類化合物[1]。咖啡酸廣泛存在于多種物質中，包括水果、豆類、葡萄酒、橄欖油和咖啡等[2]。而近年來開展的科學研究也證實，咖啡酸有抗氧化[3]、清除自由基[4]、抗癌細胞[5]、抗病毒[6]、熱耐受性強[7]、降血糖[8]等各種生理作用，在人體保健發揮著特殊的作用，是一類純天然的活性物質。此外，作為一種金屬的螯合體，咖啡酸也能夠避免由紫外線造成的細胞損傷[9-10]。

目前的研究多集中于咖啡酸的生物活性功能研究，然而對咖啡酸是如何在人體內代謝進而發揮作用機制尚不明晰。人體腸道是發酵和消化的場所[11]，其中的腸道菌群組成復雜，數量巨大，包括擬桿菌、腸桿菌科、芽孢桿菌等。然而，人體腸道菌群并非絕對恒定的，與年齡、環境、性別、飲食等多種因素相關，其中飲食是改變腸道菌群最直接可行的方法之一[12-14]。腸道是藥物代謝的主要器官之一，多種化學功能物質都在腸道菌群的共同作用下進行新陳代謝過程，其中腸道菌群和腸壁酶起著十分關鍵的作用，利用藥效學活性成分和糞便懸浮液與腸道菌群在厭氧條件下孵育，是研究中藥物質代謝的最有效方法之一[15-17]。經科學研究的證實，咖啡酸在胃和小腸中的吸收率僅為30%左右，其主要吸收和代謝部位是結腸[18]。但腸道微生物與咖啡酸如何相互作用，參與咖啡酸代謝的腸道微生物以及代謝產物尚不清楚。

本研究旨在明確參與咖啡酸代謝的腸道微生物及它們之間的相互作用，并借助形態學研究，生理生化實驗以及16S rRNA 基因對兩株腸道單菌株進行鑒定，將該菌直接運用于咖啡酸體外發酵中，并通過對咖啡酸發酵過程中指標研究，采用薄層層析法和高效液相分析法鑒定咖啡酸代謝產物，進一步闡明了咖啡酸的主要代謝方式以及代謝過程，為營養物質的靶向代謝的科學研究提供了必要的參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人體腸道糞便 聯系5 名志愿者（3 男2 女），要求無消化系統疾病，3 個月內未服用抗生素或益生菌；咖啡酸（AR，98%）、間香豆酸（≥98%）、3-（3-羥基苯基）丙酸（≥98%）上海源葉生物科技有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、瓊脂粉 北京索萊寶科技有限公司；切膠回收試劑盒 OMEGA 公司；Taq 酶PCR 試劑盒 武漢康為世紀生物科技有限公司；甲醇（≥99.5%）、甲酸（88%）、冰乙酸、氯仿國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖 北京擎科生物科技有限公司；BHI 液體培養基 青島高科技工業園海生物技術有限公司。

薄層色譜鋁箔板 青島邦凱高新技術材料有限公司；BXM-30R 壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；V-5100 紫外分光亮度計 上海精科實業有限公司；LRH-250 生化培養箱 廣東省醫療器械廠；凝膠成像系統、BioRad CFX 96 梯度PCR 儀 Eppendorf 公司；Spectra Max iD3 多功能酶標儀 美谷分子儀器上海有限公司；S210 pH 計上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 BHI 液體培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，牛心浸粉17.5 g/L，氯化鈉5.0 g/L，葡萄糖2.0 g/L，磷酸氫二鈉（12H2O）2.5 g/L，調pH 在7.4±0.2 之間，高溫高壓115 ℃滅菌15 min。使用的BHI固體培養基所需瓊脂粉量：20 g/L。

1.2.2 人體糞便樣品預處理 稱取1.00 g 新鮮糞便，在超凈臺中加入10 mL 無菌PBS，渦旋1～3 min，以1000 r/min 離心5 min，將上清液移到無菌EP 管中，加入無菌PBS 5000 r/min 離心3 min，棄去上清液，洗滌兩次并用無菌PBS 重懸沉淀。部分糞便懸浮液用于實驗，其余部分加入無菌厭氧甘油（0.04% L-半胱氨酸）中，等分并儲存于-80 ℃以備用[19]。

1.2.3 咖啡酸貯存液的配制 準確稱取50.0 mg 咖啡酸粉末到2 mL 無菌EP 管中，加入1.0 mL 80%甲醇并倒置混合，在超凈工作臺中用無菌0.22 μm 濾膜過濾滅菌，以獲得50 mg/mL 無菌咖啡酸儲存溶液。保存在-40 ℃備用。

1.2.4 人體糞便菌的富集 取一定量糞便懸液，以5000 r/min 離心5 min，棄去上清，再用PBS 洗滌兩次后，離心重懸，并按1:50 的體積比例，接種至BHI液體培養基中，然后置于厭氧罐中放在37 ℃搖床上，200 r/min，厭氧培養24 h。

1.2.5 人類糞便菌代謝咖啡酸實驗

1.2.5.1 咖啡酸體外發酵實驗 將29.1 mL BHI 液體培養基、300 μL 咖啡酸母液（終濃度0.5 mg/mL）和600 μL 人糞便細菌懸浮液加入到50 mL 的錐形瓶中（未加咖啡酸的人糞便細菌懸浮液作為陰性對照）。之后將混合發酵液置于厭氧罐中，37 ℃下在200 r/min 轉速的振蕩培養箱中避光發酵，在0、12、24、48、72 h 時采樣。將每個樣品以13000 r/min 離心3～5 min，然后將發酵液轉移到1.5 mL EP 管中并儲存在-20 ℃。動態監測在發酵過程中細菌繁殖含量（OD600）和pH 變化。

1.2.5.2 薄層層析法檢測咖啡酸糞便體外發酵代謝產物 將1.2.5.1 中體外發酵培養基解凍，利用薄層色譜法定性測定咖啡酸代謝情況[20]，展開劑為氯仿:甲醇:水:甲酸:冰醋酸（15:5:0.5:1:1，V/V），以濃度為0.5 mg/mL 咖啡酸、間香豆酸和5 mg/mL 3-（3-羥基苯基）丙酸為對照，在254 nm 的紫外波長顯色，比較比移值（Rf 值）。如果樣品的Rf 值等于咖啡酸，間香豆酸和3-（3-羥基苯基）丙酸的標準品，則表明樣品含有咖啡酸，間香豆酸和3-（3-羥基苯基）丙酸。

1.2.6 代謝咖啡酸腸道菌分離 根據1.2.5.2 中的檢測結果，將12 h 的發酵液用BHI 液體培養基稀釋至10-4～10-6的梯度，于BHI 固體培養基上進行涂布，置于恒溫37 ℃的培養箱中厭氧培養12 h。將培養基中不同顏色、形態和大小的菌株挑至BHI 液體培養基中，并在37 ℃下厭氧孵育12 h。將液體培養基中獲得的菌株在BHI 固體培養基中重復劃線，以保證得到純度較好的菌株，同時將得到的單菌落用50%厭氧甘油保存并儲存在-80 ℃的冰箱中。

1.2.7 代謝咖啡酸菌株的篩選 將分離純化的單個細菌以1:50 的比例加入含有咖啡酸的BHI 液體培養基中，咖啡酸的終濃度為0.5 mg/mL，置于37 ℃振蕩器中厭氧孵育24 h，用薄層層析法測定咖啡酸代謝情況。

1.2.8 代謝咖啡酸菌株的鑒定

1.2.8.1 形態鑒定 將1.2.7 中得到的可以代謝咖啡酸的菌株10、20 號菌進行鑒定。根據《常見細菌系統鑒定手冊》[21]和《伯杰氏細菌系統分類學手冊》[22]對分離出的細菌進行細菌形態鑒定。

1.2.8.2 16S rRNA 基因分子生物學鑒定，以菌株10 和20 的基因組作為PCR 擴增模板，正向和反向引物分別為8F：5'-AGAGTGATCCTGGCTCAG-3'/1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應（20 μL）如下：模板DNA 2 μL，KOD 酶（1 unit/μL）0.4 μL，10×KOD 緩沖液2 μL，dNTP（2 mmol/L）2 μL，引物（F+R）1.2 μL，MgSO4（25 mmol/L）1.2 μL，雙蒸水（ddH2O）11.2 μL。PCR 擴增參數設置為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s 持續35 個循環，72 ℃再延伸2 min。將所得PCR 擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。PCR 擴增產物約為1600 bp，送往上海生工進行測序，16S rDNA 序列在NCBI 中進行BLAST 同源序列檢索，可以比較篩出菌株與已知菌株的系統發育關系和系統發育狀態，如果同源性大于99%，則確認它們是同一類型的細菌，并使用Mega X 軟件創建系統發育樹。

1.2.9 篩選菌株代謝咖啡酸能力 將10、20 號菌劃線活化后接至BHI 液體培養基中，在37 ℃厭氧環境下孵育24 h，最后再按1:50（v/v）的比例加入到含有咖啡酸的BHI 液體培養基中，咖啡酸的最終濃度為0.5 mg/mL。將其置于厭氧罐中，37 ℃下進行厭氧發酵，并在發酵過程中動態監測細菌生長含量（OD600）和pH 的變化。最后通過薄層層析法和高效液相法鑒定咖啡酸的代謝產物。

1.2.9.1 發酵過程中菌株生長曲線的測定 將菌株以1:50 的比例加入到含有咖啡酸的BHI 液體培養基中，置于37 ℃搖床上厭氧培養，在0、6、12、24、48 h 取樣，用紫外分光亮度計測定OD600，并在相同條件下重復實驗3 次。

1.2.9.2 發酵過程中pH 測定 將菌株以1:50 的比例加入含咖啡酸的BHI 液體培養基中，置于37 ℃搖床中厭氧培養，在0、6、12、24、48 h 取樣，以1:50比例接種菌株的BHI 液體培養基為對照，用pH 計測定pH，在相同條件下重復實驗3 次。

1.2.9.3 發酵過程中咖啡酸代謝情況測定 用薄層層析法測定咖啡酸代謝情況，參照張學佳[23]的方法稍作修改。以氯仿:甲醇:水:甲酸:冰乙酸（15:5:0.5:1:1，V/V）為展開劑，濃度為0.5 mg/mL 的咖啡酸、間香豆酸和5 mg/mL 標準品3-（3-羥基苯基）丙酸為對照，在254 nm 的紫外波長顯色，比較比移位值（Rf 值）。如果樣品的Rf 值等于咖啡酸，間香豆酸和3-（3-羥基苯基）丙酸的標準品，則表明樣品含有咖啡酸，間香豆酸和3-（3-羥基苯基）丙酸。

1.2.9.4 發酵過程中咖啡酸代謝產物的測定 咖啡酸代謝產物的測定參照張硯壘[24]的方法略作修改。利用高效液相色譜法檢測咖啡酸代謝產物，取2 mL 發酵液樣品13000 r/min 離心2 min，取上清過0.45 μm 濾膜。高效液相色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A 為甲醇，流動相B 為0.1%甲酸，流速為0.8 mL/min；梯度洗脫表見表1，柱溫20 ℃，進樣量20 μL，檢測波長280 nm。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.3 數據處理

實驗均重復三次取平均值，所有實驗結果均用平均值±標準差來表示，采用Mega X 軟件建立系統發育樹，用統計學分析軟件SPSS 進行實驗結果顯著性分析，Excel 2019 進行數據統計并分析，由Graph Pad Prism 8 軟件進行實驗數據作圖。

2 結果與分析

2.1 人糞便菌群體外發酵咖啡酸動態變化

OD600可以用于評價細菌在培養基中的繁殖能力[25]。如圖1A 所示，體外培養條件下，人體糞便菌群在前12 h 快速增殖，在48～72 h 之間逐漸趨于平臺期。人體糞便菌群達到平臺期時，菌液的OD600為0.89。當培養基中添加咖啡酸后，人體糞便菌群在前12 h 同樣呈現快速增殖趨勢，但是12 h 后，菌群生長速率緩慢。發酵72 h 后，人體糞便菌群的OD600為0.69，最大吸光值低于無咖啡酸添加的對照組（圖1A）。結果表明，濃度為0.5 mg/mL 的咖啡酸會抑制人體糞便菌群體外增殖。

圖1 腸道菌群發酵咖啡酸生長曲線和pH 動態變化Fig.1 Dynamic changes of growth curve and pH in fermentation of caffeic acid in the intestinal flora

pH 是監測微生物發酵過程的一個重要參數，因此檢測了培養基pH 的動態變化[26-27]。如圖1B 所示，在0～12 h，糞便菌組和糞便菌+咖啡酸組的pH都呈現下降趨勢。其中，糞便菌組的pH 從7.28 下降至6.85，而糞便菌+咖啡酸組的pH 從7.26 降至6.78。從12～72 h，兩組的pH 均逐漸上升。其中，糞便菌組的pH 升高至8.36，糞便菌+咖啡酸組的pH升高至7.98。然而在整個發酵過程中，糞便菌組的pH 一直比糞便菌+咖啡酸組的pH 高，和OD600的實驗現象吻合，咖啡酸對人體糞便菌發酵有抑制效果，這與駱成堯等[28-29]研究結果相似。而0～12 h 出現下降的原因推測是生成了代謝產物，且代謝產物為酸性從而使pH 下降。

圖1C 可以看出，咖啡酸糞便發酵液第12 h 已經開始代謝直至24 h 咖啡酸被完全代謝。代謝產物在與間香豆酸標準品相同的Rf 值處出現斑點，并且隨著發酵時間的延長，顏色逐漸加深，在12 h 顏色最深，但12 h 之后顏色又逐漸減少。

2.2 參與咖啡酸代謝的腸道微生物篩選

將人類糞便菌懸液進行梯度稀釋，涂布在BHI固體培養基平板上，然后再挑取26 個單克隆，接種到含有咖啡酸的液體培養基中進行發酵。厭氧發酵12 h 后，收集培養基，并利用薄層層析法分析培養液中咖啡酸及其代謝產物的改變。如圖2A 和2B 所示，第10 號、20 號腸道菌可以代謝咖啡酸。

圖2 參與咖啡酸代謝的腸道微生物篩選Fig.2 Screening of gut microbes involved in caffeic acid metabolism

2.3 咖啡酸代謝菌株的形態及鑒定

2.3.1 菌株形態學觀察 采用梯度稀釋法將10 號菌和20 號菌在BHI 固體培養基上劃線。10 號菌的形態如圖3A 所示。菌落呈圓形，濕潤，邊緣光滑，中間凸起為白色，邊緣略帶黃色。20 號菌的形態如圖3B所示。菌落透明或半透明，灰白色，邊緣整齊，中間凸起。根據菌落形態特征，初步判斷兩種菌株均為細菌。利用革蘭氏染色初步確認了10 號菌為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡下成葡萄狀球菌，而20 號菌為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡下成桿型。

圖3 菌株形態學特征Fig.3 Morphological characteristics of strains

2.3.2 分子生物學鑒定 利用引物對所提取的基因組DNA 進行擴增，所擴增的結果如圖4 所示，在1500 bp 左右出現了目的條帶，條帶整齊，能夠進行測序分析。利用Snap Gene Viewer 軟件對測序序列進行拼接，借助NCBI 中的BLAST 和數據庫中已知菌株的16S rRNA 基因進行序列比對，選擇相似度最高的菌株來判斷10 號和20 號的種屬狀況。結果表明，10 號菌株的16S rRNA 基因序列與數據庫中已知腐生葡萄球菌的16S rRNA 基因的相似性大于99%。20 號菌株的16S rRNA 基因序列與數據庫中已知奇異變形桿菌的16S rRNA 基因的相似性大于99%。為更加清楚該菌株與已知菌株的親緣關系及分類地位，構建系統發育樹，結果顯示10 號菌與Staphylococcus xylosusstrain Fop 108A 和Staphylococcus xylosusstrain JCM 2418 在系統發育樹聚為一支（圖5A），20 號菌與Proteus mirabilisstrain ATCC 29906 在系統發育樹聚為一支（圖5B）。

圖4 菌株16S rDNA 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Strain 16S rDNA agarose gel electrophoresis

圖5 菌株的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strains

2.4 腸道菌株代謝咖啡酸分析

2.4.1 菌株生長曲線和發酵液pH 變化分析 在發酵過程中監測篩選菌株代謝咖啡酸的生長情況和pH 的動態變化。如圖6A 所示，腐生葡萄球菌組在前6 h 快速增殖，36 h 到達最高時，菌液的OD600為0.77。加入咖啡酸后，腐生葡萄球菌在前6 h 呈現快速增長趨勢，36 h 之后到達平臺期時菌液OD600為0.85。如圖6C 所示，奇異變形桿菌組同樣在前6 h呈現快速增長趨勢，24 h 菌液OD600為0.62，36 h 突然增長達到峰值0.84 后又隨著發酵時間的增加，培養基中的營養成分減少，菌株的生存能力降低。加入咖啡酸后，在24 h 到達平臺期時菌液OD600為0.56，同樣也在36 h 增長達到峰值0.69 后恢復到平臺期。結果顯示，咖啡酸抑制腐生葡萄球菌和奇異變形桿菌的體外增殖，對奇異變形桿菌的抑制效果大于腐生葡萄球菌。

圖6 代謝菌株發酵過程中不同時間點生長曲線和pH 變化Fig.6 Growth curves and pH changes at different time points during fermentation of metabolic strains

根據研究，咖啡酸會被菌株分解產生間香豆酸等代謝產物，從而導致pH 的改變，所以，pH 的變化是反應發酵過程中一項關鍵參數[30]。從圖6B 中可以看出，腐生葡萄球菌代謝咖啡酸發酵6 h 時pH 下降至6.11，推測可能生成了酸性代謝產物，而6 h 之后pH 又出現回升直至48 h 到達7.19，可能生成的酸性代謝產物進一步代謝生成了堿性代謝產物。而圖6D 中奇異變形桿菌代謝咖啡酸12 h 之后pH才出現回升直至48 h 到達7.54，推測可能奇異變形桿菌代謝咖啡酸的能力可能沒有腐生葡萄球菌強。

2.4.2 菌株發酵過程中代謝產物的檢測 對腐生葡萄球菌和奇異變形桿菌發酵咖啡酸不同時間的發酵液進行薄層層析檢測。從圖7A 可以看到，腐生葡萄球菌從6 h 開始已經將咖啡酸代謝，12 h 之后咖啡酸代謝完全，代謝產物12 h 之后也沒有出現增加現象。圖7B 中，奇異變形桿菌也在第6 h 就可以將咖啡酸代謝，24 h 時咖啡酸就已經代謝完全，代謝產物24 h 之后也沒有出現增加的現象。但從圖中可以看出，腐生葡萄球菌代謝咖啡酸的效果優于奇異變形桿菌。

圖7 代謝菌株發酵咖啡酸產物TLC 分析Fig.7 TLC analysis of fermented caffeic acid products of metabolic strains

2.4.3 菌株發酵過程中代謝產物確定 采用HPLC法更精確反映咖啡酸變化及其確定代謝產物。由圖8 和圖9 可知，根據三種標準品的出峰時間不同確定腐生葡萄球菌和奇異變形桿菌可以將咖啡酸代謝為間香豆酸。

圖8 咖啡酸標準品及其代謝產物標準品HPLC 圖Fig.8 Caffeic acid standard and its metabolite standard HPLC diagram

圖9 菌株發酵液中咖啡酸及代謝產物HPLC 分析Fig.9 HPLC analysis of caffeic acid and metabolites in fermentation broth of strains

對HPLC 結果進行定量分析，從圖10A 中看出咖啡酸6 h 含量從0.539 mg/mL 降至0.087 mg/mL，12 h 之后基本被完全代謝。圖10C 中看到咖啡酸在第6 h 含量從0.543 mg/mL 降至0.352 mg/mL，第12 h 含量降至0.030 mg/mL，24 h 之后被完全代謝。從中可以看出，腐生葡萄球菌代謝咖啡酸的能力比奇異變形桿菌好。

圖10 菌株發酵液中咖啡酸及代謝產物HPLC 定量分析Fig.10 Quantitative analysis of caffeic acid and metabolites in fermentation broth of strains by HPLC

代謝產物間香豆酸的變化可以從圖10B 中看出，腐生葡萄球菌發酵咖啡酸第6 h 間香豆酸生成，第12 h 間香豆酸濃度達到峰值0.045 mg/mL，12 h之后間香豆酸含量開始降低，直至48 h 降至0.029 mg/mL。奇異變形桿菌發酵咖啡酸從圖10D 中可以看到間香豆酸從第6 h 開始生成，第24 h 濃度達到峰值0.044 mg/mL，24 h 之后間香豆酸含量開始降低，直至48 h 為0.035 mg/mL。可以看出腐生葡萄球菌代謝咖啡酸的能力優于奇異變形桿菌，但是兩株菌代謝的間香豆酸都在24 h 后逐漸降低，推測間香豆酸有可能進一步代謝生成了其它代謝產物。

通過薄層層析法和高效液相色譜法檢測可以看到腐生葡萄球菌和奇異變形桿菌在代謝咖啡酸過程中代謝產物為間香豆酸。這與魏玲[31]的研究相同，在大鼠體內代謝咖啡酸產物中檢測出13 種代謝產物中就有間香豆酸。腐生葡萄球菌和奇異變形桿菌在自然界中廣泛存在，具有豐富的生物學功能，周華書[32]和閆建英等[33]只對其安全性和耐藥性進行研究并未研究其它藥用作用。本實驗通過對其代謝途徑進行研究為兩株菌以及咖啡酸新的研究方向奠定了基礎。

3 結論

本研究通過對人體糞便樣品中分離出兩株腸道單菌各項指標的檢測，發現隨著發酵過程的進行，咖啡酸代謝為間香豆酸，間香豆酸又進一步代謝生成其他酚酸類化合物導致pH 呈現先下降后上升趨勢。發酵12 h 后，咖啡酸被腐生葡萄球菌完全代謝，同時在發酵12 h 時，間香豆酸濃度達到峰值0.045 mg/mL；而奇異變形桿菌在發酵24 h 后完全代謝咖啡酸，間香豆酸的濃度在發酵24 h 達到峰值0.044 mg/mL。綜上，咖啡酸抑制了腸道菌的增殖，人腸道來源的腐生葡萄球菌和奇異變形桿菌可代謝咖啡酸，且腐生葡萄球菌代謝能力優于奇異變形桿菌，對咖啡酸在腸道微生物作用下代謝機制的研究具有指導意義，但詳細的機制還需要進一步研究。