硒化天麻多糖的制備、結構表征及其抗氧化活性評價

溫啟華，陸逸昊，楊露芳，陳江旭，程永友，劉 瑩，許 粟，馬風偉

（貴陽學院食品科學與工程學院，貴州貴陽 550005）

天麻（Gastrodia elataBlume）為蘭科真菌營養型多年生草本植物天麻的干燥塊莖，是我國一種傳統珍貴的中藥材，最早記載于《神農本草經》[1-2]。天麻主產于我國貴州、云南、湖北、陜西等地，在我國已有2000 多年的應用歷史，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡等功效，主要用于治療頭痛、小兒驚風、肢體麻木、癲癇等病癥[3]，同時還具有健腦、抗衰老等作用[4]。除了有藥用價值外，天麻還被國家衛生健康委員會列為藥食兩用資源植物[5]，因此天麻及其多糖在藥品、食品、保健品等領域具有廣泛的應用前景。天麻多糖為天麻的活性成分之一，研究表明天麻多糖具有抗氧化[6]、免疫調節[7]、抗腫瘤[8]、神經保護[9]、抑菌[10]等作用。

硒（Selenium，Se）是人體內必需的微量元素，在抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、降血糖等方面都發揮著重要的作用[11-13]。缺硒會導致人體生殖功能下降，免疫力低下，還會引起糖尿病、高血壓、心腦血管病等多種疾病，嚴重缺硒還可引起克山病和大骨節病[14]。我國是一個缺硒大國，約占國土面積的2/3 地區為缺硒地區，其中30%地區為嚴重缺硒地區，約7 億人生活在低硒地區[15]。有報道指出，我國居民硒平均攝入量只有44.4 μg/d[16]，遠低于《中國居民膳食營養素參考攝入量第3 部分：微量元素（WT/T 578.3-2017）》中成人推薦硒的攝入量60 μg/d[17]。硒在人體內無法合成，只能通過外源攝取，因此補硒劑越來越受到人們的關注。補硒劑主要有兩類：一是無機硒，如亞硒酸鈉、硒酸鈉，但其毒性大，人體吸收利用率低[18]；二是有機硒，包括有機硒制劑、富硒地區出產的天然產品以及人工生物轉化的各種動、植物和微生物產品。與無機硒相比，有機硒通常以硒蛋白或硒多糖等形式存在，具有生物活性高、毒性低、易被吸收等特點[19-20]。

目前除少數富硒區出產的個別產品中硒多糖含量較高外，大部分地區產品中硒多糖含量較低[21]，無法滿足人們補硒的需求。人工干預方法是提高硒多糖產量的便捷途徑之一，已經成為了補硒制劑研究的熱點[22]。目前，人工合成硒多糖的方法有：植物轉化法、化學合成法和微生物轉化法[23]等，硒多糖的化學合成法主要是利用多糖鏈上的羥基等活性基團與硒化試劑中的硒結合，從而使硒共價結合到多糖分子上，形成硒多糖[24-25]。其中硝酸－亞硒酸鈉法具有反應過程簡單、操作性強、環境污染小、安全性高、產物回收方便的優點，在硒多糖的制備合成中廣泛應用[26]。許多國內外學者采用硝酸-亞硒酸鈉法合成出硒化多糖，如硒化冬蟲夏草多糖[27]、硒化梅花馬尾藻多糖[28]、硒化食用灰樹花多糖[29]、硒化紫花苜蓿根多糖[30]、硒化黃大棗多糖[31]等。

目前關于硒化天麻多糖的研究還未見相關報道，研究天麻多糖的硒化修飾工藝和抗氧化活性，可為天麻資源的綜合利用和補硒產品的進一步開發提供科學依據。本研究采用硝酸-亞硒酸鈉法合成硒化天麻多糖SeGEP，采用響應面法優化天麻多糖的硒化修飾制備工藝，并研究硒化修飾前后天麻多糖的結構變化以及GEP、SeGEP 的抗氧化活性，為開發研制硒化天麻多糖相關的補硒制劑、功能食品開發等提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天麻 購自貴州烏蒙騰菌業有限公司，并經貴州師范大學陳華國教授鑒定為蘭科植物天麻（Gastrodia elataBlume）的塊莖，樣本保存在貴陽學院食品科學與工程學院，編號2021 060263；石油醚、無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、丙酮、甲苯 分析純，天津市富宇精細化工有限公司；活性炭 分析純，天津市光復科技發展有限公司；硝酸、高氯酸 分析純，成都市科隆化學品有限公司；鹽酸、三氯化鐵分析純，國藥集團化學有限公司；亞硒酸鈉 分析純，山東西亞化學股份有限公司；碳酸氫鈉 分析純，天津市永大化學試劑有限公司；抗壞血酸（Vitamin C，VC）、剛果紅、碘、碘化鉀、三氯乙酸 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；鄰苯二胺、過硫酸鉀分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，DETA-2Na）分析純，天津市登峰化學試劑廠；重水（D2O）分析純，上海泰坦科技股份有限公司；2,2-聯苯基-1-苦基肼基（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）分析純，上海麥克林生化科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液 標準物質，壇墨質檢科技股份有限公司；鐵氰化鉀 分析純，成都金山化學試劑有限公司；MD44（8000～14000 D）透析袋 北京索萊寶科技有限公司。

XMTD-204 恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司；DF-101S 恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司；RE-52A 旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；FA124 電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TDZ25-WS 離心機 湖南平凡科技有限公司；LC-12N-50A 真空冷凍干燥機 上海力辰邦西儀器科技有限公司；Cary 60 UV-Vis 紫外光譜儀 安捷倫科技有限公司；PerkinElmer Spectrum Two 傅里葉變換衰減全放射紅外光譜儀 珀金埃爾默企管理（上海）有限公司；NS-90Z 納米粒度及電位分析儀珠海歐美克儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 天麻多糖的提取 參考文獻[32]，稍作改動。稱取干燥至恒重的天麻粉末10.0 g，依次經石油醚、無水乙醇50 mL 回流脫脂60 min，用活性炭進行脫色素處理。濾渣加水300 mL 在80 ℃下提取2 h 后過濾，重復多次提取。濾液收集后，減壓濃縮至20 mL，重復多次加入Sevag 試劑（氯仿:正丁醇=4:1）10 mL以除去游離蛋白質直至無白色沉淀。取上清液加入4 倍無水乙醇，靜置過夜，離心（4000 r/min）5 min 過濾。用乙醇、丙酮洗滌沉淀，然后加蒸餾水溶解，冷凍干燥，得到天麻多糖提取物（GEP）。

1.2.2 硒化天麻多糖的制備 參考胡潤峰等[33]和王峙力等[34]的方法，稍作改動。稱取0.5 g 天麻多糖放入錐形瓶中，加入一定濃度的硝酸溶液50 mL，加熱攪拌溶解多糖，得到10 mg/mL 的天麻多糖溶液。加入一定量的亞硒酸鈉，在一定的溫度、時間條件下攪拌反應。反應結束后冷卻至室溫，用碳酸氫鈉調pH 至5～6。反應液離心（4000 r/min）5 min、抽濾，濾液用純凈水透析72 h。取少量的透析液加入抗壞血酸進行顯色檢測，若無紅色時則停止透析。透析液減壓濃縮至20 mL、冷凍干燥得到硒化天麻多糖（SeGEP）。稱重，計算硒含量和硒化多糖得率。

1.2.3 硒化天麻多糖中硒含量的測定

1.2.3.1 硒含量標準曲線的繪制 參考李麗彩等[35]的方法，采用鄰苯二胺法檢測SeGEP 的硒含量。用Na2SeO3配制0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.3 μg/mL 不同濃度系列的硒標準溶液25 mL，分別加入10 g/L EDTA-2Na 溶液2 mL，用1 mol/L 的鹽酸調節pH2，加入10 g/L 鄰苯二胺2.5 mL，暗處反應40 min，加入10 mL 甲苯，振蕩萃取5 min 取上層甲苯層，在波長334 nm 處測定吸光值。以硒的質量濃度為橫坐標X，以吸光值A 為縱坐標Y 繪制標準曲線。

1.2.3.2 硒含量測定與計算 取20 mg 硒化天麻多糖置于錐形瓶中加入10 mL 濃硝酸、4 mL 高氯酸，常溫放置18 h 以上，在電熱爐上加熱消化，等溶液變無色或微黃色時，加入4 mol/L 鹽酸10 mL，加熱至溶液為10 mL 左右，冷卻定容至25 mL，后續操作按照硒含量標準曲線的測定方法，得到吸光值并代入標準曲線計算硒含量，硒含量計算公式如式（1）：

式中：c 表示根據吸光度值計算出的硒質量濃度，μg/mL；V 表示消化液定容體積，mL；m 表示硒化天麻多糖的質量，g。

1.2.4 硒化天麻多糖中得率的計算 得率計算公式如式（2）：

式中：m1表示天麻多糖的質量，g；m2表示硒化修飾天麻多糖的質量，g。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 反應溫度對天麻多糖硒化修飾的影響 按照1.2.2 的方法，硝酸濃度0.05%、反應時間8 h、亞硒酸鈉用量（亞硒酸鈉:天麻多糖）為1:1，改變反應溫度分別為50、60、70、80、90 ℃測定硒化多糖硒含量及其得率，考察反應溫度對天麻多糖硒化修飾的影響。

1.2.5.2 硝酸濃度對天麻多糖硒化修飾的影響 按照1.2.2 的方法，在反應溫度70 ℃、反應時間8 h 亞硒酸鈉用量為1:1 條件下，改變硝酸濃度分別為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%制備硒化天麻多糖，測定硒化多糖硒含量及其得率，探究硝酸濃度對天麻多糖硒化修飾的影響。

1.2.5.3 反應時間對天麻多糖硒化修飾的影響 按照1.2.2 的方法，固定反應溫度70 ℃、硝酸濃度0.05%、亞硒酸鈉用量為1:1，改變反應時間分別為4、6、8、10、12 h，制備硒化天麻多糖，測定硒化多糖硒含量及其得率，探究反應時間對天麻多糖硒化修飾的影響。

1.2.5.4 亞硒酸鈉的用量對天麻多糖硒化修飾的影響 按照1.2.2 的方法，在反應溫度70 ℃、硝酸濃度0.05%，反應時間8 h，改變亞硒酸鈉的用量分別為0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.4:1，制備硒化天麻多糖，測定硒化多糖硒含量及其得率，探究亞硒酸鈉的用量對天麻多糖硒化修飾的影響。

1.2.6 響應面試驗 在單因素實驗結果分析的硒含量和顯著水平的基礎上，采用Box-Behnken（BBD）法進行響應面設計。選擇反應溫度（℃）、硝酸濃度（%）、反應時間（h），以硒化天麻多糖的硒含量作為響應值，進行響應面法工藝優化試驗，因素水平見表1。

表1 響應面法試驗的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.7 硒化天麻多糖的表征

1.2.7.1 紫外光譜分析 配制0.1 mg/mL 的Na2SeO3、GEP、SeGEP 溶液，以蒸餾水作空白，于200～400 nm范圍掃描測定。

1.2.7.2 紅外光譜分析 稱取干燥恒重的Na2SeO3、GEP、SeGEP 100 mg 研磨壓片，于紅外光譜儀中，4000～400 cm-1范圍內掃描測定。

1.2.7.3 核磁共振分析 稱取20 mg 的SeGEP，溶解于0.5 mL 重水（D2O）中，冷凍干燥，再用0.5 mL的D2O 復溶，加入到核磁管中，測定其1H-NMR、13CNMR。

1.2.7.4 粒徑及Zeta 電位分析 取適量GEP 和SeGEP溶于去離子水中，配制成濃度為2 mg/mL 的多糖溶液，在25 ℃的條件下，使用納米粒度及電位移儀測量多糖樣品的粒徑分布和Zeta 電位，每個樣品測3 次。

1.2.7.5 剛果紅實驗 通過剛果紅（Congo red）實驗測定GEP 和SeGEP 是否具有三股螺旋[36]。分別用蒸餾水配制2.5 mg/mL 的GEP、SeGEP 溶液，移取2 mL 多糖溶液與2 mL 80 μmol/L 的剛果紅溶液混合，逐漸加入NaOH 溶液，使溶液中NaOH 的濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L 避光反應5 min，在190～600 nm 波長范圍掃描，測定最大吸收波長，繪制最大吸收波長與NaOH 濃度變化曲線。

1.2.7.6 碘-碘化鉀試驗 稱取0.2 g KI，定容到100 mL，加入0.02 g I2，充分溶解后，稱取GEP 與SeGEP 各2 mg，分別溶解在1.2 mL 配制好的溶液中，稀釋至一定濃度，在300～700 nm 范圍進行紫外光譜掃描[37]。

1.2.7.7 掃描電鏡（SEM）分析 分別取干燥的GEP和SeGEP 均勻分散在鋁板上，在真空環境下鍍金。噴金后將樣品置于掃描電鏡下室溫掃描，觀察硒化前后多糖的表面形狀。

1.2.8 體外抗氧化實驗

1.2.8.1 DPPH 自由基清除能力的測定 參考文獻[38]中的方法，分別配制成每組2、4、6、8、10 mg/mL 的VC、GEP 和SeGEP 溶液、取1 mL 樣品溶液加入0.01% DPPH-乙醇溶液2 mL，搖勻，在暗處反應30 min，用紫外分光光度計測定517 nm 處的吸光值。DPPH 自由基清除率計算方法如式（3）：

式中：A1，多糖與DPPH 溶液混合的吸光值；A2，多糖與無水乙醇混合后的吸光值；A0，DPPH 溶液與無水乙醇混合后的吸光值。

1.2.8.2 ABTS+自由基清除能力的測定 根據文獻[33,39]的方法，適量修改后，制備ABTS 自由基溶液，將7 mmol/L ABTS 母液與2.45 mmol/L 過硫酸鉀混合，在室溫下暗反應16 h，用10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.6）稀釋，直至在734 nm 處的吸光度為0.70±0.02 Abs，得到ABTS 工作液。配制VC、GEP、SeGEP 溶液（0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL）置于試管中1 mL，每組加入2 mL ABTS 工作液，室溫暗反應反應6 min，用紫外分光光度儀在734 nm 處測定吸光度。ABTS+自由基清除率計算方法如式（4）：

式中：Aa，樣品與ABTS 工作液混合的吸光值；Ac，樣品與水混合后的吸光值；Ab，ABTS 工作液與水混合后的吸光值。

1.2.8.3 鐵還原能力 參考文獻[40]中的方法，適量修改后，將待測樣品（VC、GEP、SeGEP）配制為2、4、6、8、10 mg/mL 的溶液，分別取1 mL 于試管中，加入0.2 mol/L pH6.6 磷酸鹽緩沖液2.5 mL，1%鐵氰化鉀1 mL，于50 ℃下反應20 min，加入10%三氯乙酸5 mL，4000 r/min 條件下離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水，0.1%三氯化鐵0.5 mL，靜置10 min。于波長700 nm 處測定吸光度。鐵還原力計算如式（5）：

式中：A1，樣品與反應溶液體系混合的吸光值；A2，樣品與用去離子水代替0.1%三氯化鐵的反應溶液體系混合的吸光值。

1.3 數據處理

實驗數據用3 次獨立重復實驗結果的平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 26 軟件進行方差分析，P<0.05 表示差異顯著，采用OMNIC 軟件處理紅外數據和繪圖，采用MestReNova 軟件處理核磁共振數據和繪圖，其他數據采用Origin 2021 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 硒含量標準曲線繪制

以硒的質量濃度為橫坐標X，以吸光值A 為縱坐標Y 繪制標準曲線并建立回歸方程：Y=0.3417X+0.0225（R2=0.9960）（圖1）。

圖1 硒含量標準曲線Fig.1 Standard curve of selenium content

2.2 單因素實驗

2.2.1 反應溫度對天麻多糖硒化修飾的影響 結果如圖2a 所示，當反應溫度在50～70℃范圍內，硒含量，得率顯著增加（P<0.05）；在60 ℃時，得率達到最大值53.72%±0.96%；在70 ℃時，硒含量達到最大值為3521.65±79.81 μg/g，此時得率為53.04%±0.89%；當反應溫度大于70 ℃，硒含量、得率下降。這可能由于硒多糖在高溫度條件下易分解[41]，硒與多糖解離速度大于結合速度。因此，選擇60、70、80 ℃進行響應面優化。

圖2 天麻多糖的硒化修飾單因素實驗Fig.2 Effect of influence factors on selenylation modification of Gastrodia elata polysaccharides

2.2.2 硝酸濃度對天麻多糖硒化修飾的影響 結果如圖2b 所示，當SeGEP 在硝酸濃度0.01%～0.05%范圍內時，SeGEP 的硒含量、得率隨著硝酸濃度的增加而顯著增加（P<0.05）；在濃度為0.03%時，得率達到最大值51.84%±1.18%；在濃度為0.05%時，硒含量達到最大值3511.645±128.95 μg/g，此時得率為48.46%±2.04%；當硝酸濃度大于0.05%時，硒化天麻多糖的硒含量、得率下降，這可能是因為過高的硝酸濃度會導致已經結合在多糖上的硒氧鍵C-O-Se斷裂而發生解離作用，進而導致硒含量下降[42]。因此，選擇0.03%、0.05%、0.07%進行響應面優化。

2.2.3 反應時間對天麻多糖硒化修飾的影響 結果如圖2c 所示，當硒化天麻多糖的反應時間小于8 h，硒含量、得率隨著反應時間的增加而逐漸顯著增大（P<0.05）；在反應時間為8 h 時，硒含量達到最大值為3894.72±164.28 μg/g，此時得率為55.46%±1.00%；在反應時間為10 h 時，有最大的得率57.8%±0.9%；當反應時間大于8 h 和10 h，硒含量、得率分別隨著反應時間的增加而緩慢減小，當硒化時間過長時，GEP 在高溫和酸性條件下發生降解，影響硒化反應進行。因此，選擇6、8、10 h 進行響應面優化。

2.2.4 亞硒酸鈉的用量對天麻多糖硒化修飾的影響

結果如圖2d 所示，當GEP 與Na2SeO3質量比低于1:1 時，隨著Na2SeO3用量的增加，SeGEP 中硒含量、得率呈現顯著上升趨勢（P<0.05）；當用量比為1:1 時，硒含量達到最大為3289.79±21.26 μg/g，得率為54.22%±2.02%；當Na2SeO3用量大于1:1和1.2:1 時，隨著Na2SeO3用量的增加，硒含量、得率分別呈下降趨勢，這可能硒與多糖的鍵合達到飽和狀態，Na2SeO3的用量比的增大可能導致其平衡狀態被破壞，從而導致硒含量下降[43]。

2.3 響應面試驗結果與分析

2.3.1 回歸方程的建立與方差分析 響應面試驗設計與結果見表2。以硒含量為響應值，利用Design-Expert 11 軟件分析擬合得到硒化天麻多糖的硒含量的二次多元回歸方程：Y=3736.73+308.25A-241.56B+634.45C-83.37AB+196.70AC-12.22BC-531.47A2-359.40B2-1649.24C2，并對此設計的模型進行方差分析，結果見表3。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and result of response surface method test

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

如表3 所示，對回歸模型進行方差分析，該回歸模型極顯著（P<0.01），失擬項不顯著（P>0.05），模型決定系數R2=0.9909，校正后決定系數R2adj=0.9792，說明模型擬合度較高，能預測97.92%的響應值，可以利用此模型對硒化天麻多糖的制備工藝的優化。由回歸模型的顯著性可知，一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2的影響極顯著（P<0.01），交互項AC 的影響顯著（P<0.05），交互項AB、BC 的影響不顯著（P>0.05）。由F值可知，各因素對硒化天麻多糖的硒含量的影響順序：C>A>B。

2.3.2 響應面曲面結果分析 根據分析軟件擬合得到的三維圖來反映出反應溫度、硝酸濃度、反應時間三個因素兩兩交互作用對天麻多糖的硒化修飾影響。由圖3 看出，AB 響應面不陡峭，等高線接近圓形，說明AB 交互作用相對不顯著；AC、BC 響應面陡峭，等高線呈橢圓形，說明AC、BC 交互作用顯著，這與方差結果分析較為一致。

圖3 各因素交互作用的響應面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction of various factors

2.3.3 驗證試驗 通過分析軟件模型的建立，當反應溫度為73.91 ℃、硝酸濃度為0.041%、反應時間為8.42 h 時，預測硒化天麻多糖的硒含量為3904.07 μg/g。考慮實際操作，將最佳硒化天麻多制備工藝改為反應溫度74 ℃、硝酸濃度0.041%、反應時間8.4 h，重復3 次。在此條件下得到的硒含量為3891.05±10.86 μg/g，得率為49.63%±1.49%，與預測值硒含量對比僅相差0.33%，表明模型準確可靠。

2.4 紫外光譜結果分析

如圖4 所示，Na2SeO3在208 nm 處有較強的吸收峰，這與張春嶺等[44]的研究相符合。GEP 和SeGEP 在260、280 nm 沒有明顯的核酸和蛋白質的特征吸收峰，說明多糖中大部分蛋白質和核酸已經除去[45]。

圖4 Na2SeO3、GEP、SeGEP 的紫外光譜圖Fig.4 UV spectrogram of Na2SeO3,GEP and SeGEP

2.5 紅外光譜結果分析

亞硒酸鈉、天麻多糖硒化前后的紅外光譜如圖5 所示。在717、445 cm-1處有吸收峰為Na2SeO3的特征吸收峰[46]。其中3292 cm-1（GEP）、3307 cm-1（SeGEP）處的特征峰為-OH 的伸縮振動特征吸收峰（3600～3200 cm-1），2902 cm-1（GEP、SeGEP）處的吸收峰為C-H 的伸縮振動（2900 cm-1），1591 cm-1（GEP）、1645 cm-1（SeGEP）處的吸收峰為C=O 的伸縮振動（2200～1350 cm-1），1406 cm-1（GEP、SeGEP）處的吸收峰為C-H 的變形振動（1450～1360 cm-1），1230 cm-1（GEP）、1246 cm-1（SeGEP）處的吸收峰為C-O-C 的伸縮振動[47]，1149 cm-1（GEP）、1148 cm-1（SeGEP）處的吸收峰為β-型糖苷鍵的特征吸收峰[34]，760 cm-1（GEP）、759 cm-1（SeGEP）為吡喃環骨架的特征吸收峰[48]，以上特征吸收峰說明了天麻多糖和硒化天麻多糖都具有含β-型糖苷鍵連接以吡喃環為骨架的多糖結構。而硒化天麻多糖在1016、896、605 cm-1處產生新的弱吸收峰，其中1016 cm-1處的吸收峰為O-Se-O 的特征吸收峰[49]（1040～1010 cm-1），896 cm-1處的吸收峰為Se=O 特征吸收峰[50]（900～850 cm-1），605 cm-1處的吸收峰為C-O-Se 特征吸收峰[51]（700～600 cm-1），這說明硒以亞硒酸酯的形式與天麻多糖上的羥基結合生成硒化天麻多糖。

圖5 Na2SeO3、GEP 和SeGEP 的紅外光譜分析Fig.5 Infrared spectrum analysis of Na2SeO3,GEP and SeGEP

2.6 核磁共振結果分析

如圖6 所示，SeGEP 的1H-NMR 譜圖的化學位移有3.28、3.50、3.70、3.83、5.27 ppm，這些信號可以指征為多糖的特征峰[28]，其中3.28、3.50、3.70、3.83 ppm 來源于單糖上的H-2～H-6[52]。在一般情況下，異頭氫H-1 在5.50～4.90 ppm 范圍內屬于α-構型，在4.90～4.0 ppm 范圍內屬于β-構型，SeGEP 在這兩個范圍內只有信號5.27 ppm，通過1H-NMR 譜說明硒化天麻多糖的糖苷鍵主要為α構型。

圖6 SeGEP 的1H-NMR（a）和13C-NMR（b）圖譜Fig.6 1H-NMR (a) and 13C-NMR (b) spectra of SeGEP

SeGEP 的13C-NMR 譜圖的化學位移有60.39、69.23、71.09、71.46、73.28、76.75、99.67 ppm。其中60.39 ppm 處為C-6 信號，69.23 ppm 處為C-5 信號，71.09、71.46 ppm 處為C-2 信號，出現裂峰，73.28 ppm 處為C-3 信號，76.75 ppm 處為C-4 信號，99.67 ppm 處為異頭碳C-1 信號，異頭碳信低于100 ppm 也驗證了SeGEP 的構型為α構型[53]。

2.7 粒徑及Zeta 電位結果分析

多糖的流體力學性質如粒徑分布和電勢電位可以在一定程度上反映其穩定性，一般來說，多糖分子的粒徑越小、Zeta 電位的絕對值越大，說明多糖分子在體系中越容易分散或溶解，反之則多糖分子越容易聚集[54]。如圖7a 所示，在2 mg/mL 的濃度下，GEP的平均粒徑為647.33±43.11 nm，SeGEP 的平均粒徑為486±60 nm，SeGEP 的粒徑比GEP 減少了24.92%。該結果顯示天麻多糖在硒化反應過程中，因亞硒酸酯基團的引入使天麻多糖高級結構發生改變，更易緊密聚合成粒徑更小的形態；圖7b 中GEP 的平均Zeta電位為-12.92±2.42 mV，SeGEP 的平均Zeta 電位-15.83±0.53 mV，SeGEP 的Zeta 電位絕對值比GEP大22.52%。結果顯示硒化多糖形成后，因SeGEP 表面的亞硒酸酯基團的羥基比GEP 表面的羥基基團電離程度強，使SeGEP 表面帶的負電荷增加，表現出SeGEP 的Zeta 電位絕對值比GEP 大。這與Ru 等[55]研究結果一致，表明硒化修飾能提高天麻多糖在溶液體系的穩定性、分散性。

圖7 GEP 和SeGEP 的粒徑分析（a）和Zeta電位（b）Fig.7 Particle size (a) and Zeta potential (b) of GEP and SeGEP

2.8 剛果紅實驗結果分析

剛果紅是一種酸性染料，其可與具有三股螺旋鏈構象的多糖形成絡合物，該絡合物在一定的堿性溶液中保持穩定，但當氫氧化鈉溶液濃度大于某一數值后，由于堿性過高使多糖高級結構開始破壞導致最大吸收波長急劇下降，由此可對多糖中是否含有三股螺旋結構進行判斷[56]，并推斷硒化修飾是否對多糖的三股螺旋結構產生影響。由圖8a 可知，隨著NaOH 濃度的增大，剛果紅的最大吸收波長在下降，發生藍移現象。GEP 和SeGEP 的最大吸收波長相比于剛果紅的最大吸收波長有發生紅移現象，但變化程度較少，最大吸收波長整體處于藍移趨勢。綜上所述，天麻多糖和硒化天麻多糖可能具備三股螺旋結構[57]，且硒化修飾過程不會對天麻多糖的螺旋結構產生影響。

圖8 GEP、SeGEP 與剛果紅復合物隨NaOH 濃度變化趨勢（a）及GEP、SeGEP 和碘-碘化鉀反應后的紫外掃描（b）Fig.8 Trend diagram of GEP,SeGEP and Gongo red complex with NaOH concentration (a) and UV spectrogram of GEP,SeGEP and I2-KI (b)

2.9 碘-碘化鉀試驗結果分析

當多糖與碘試劑混勻后，碘與分支較少或側鏈較短的多糖的結合位點少，無法絡合，通過紫外掃描只有碘在565 nm 處的最大吸收峰，碘與分支較多或側鏈較長的多糖的結合位點多，能使碘與多糖形成絡合物，紫外掃描發生藍移現象[58]，通過碘-碘化鉀實驗推斷硒化修飾是否對天麻多糖的分支結構產生影響。如圖8b 所示，在330～380 nm 范圍內，天麻多糖和硒化天麻多糖都有一個明顯的吸收峰，說明天麻多糖和硒化天麻多糖都具有分支結構，但565 nm 處無最大吸收峰，說明天麻多糖和硒化天麻多糖均存在較長的側鏈和支鏈，這與于闖[59]和蔡佳欣[60]研究結果相似。

2.10 掃描電鏡（SEM）結果分析

掃描電子顯微鏡主要是利用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態，即用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過電子束與樣品的相互作用產生各種效應，其中主要是樣品的二次電子發射。二次電子能夠產生樣品表面放大的形貌像，從而獲得形貌、結構、成分和結晶學信息等優點，通過SEM 分析推斷硒化修飾是否對天麻多糖的微觀結構產生影響。圖9a、b分別為GEP 和SeGEP 掃描電鏡圖。由圖9a 可知，GEP 的表面比較光滑、規則，具有棱角的團狀晶體結構；由圖9b 可知，SeGEP 的表面粗糙，有大小不一，產生更小的粒徑、致密的球狀物聚集存在，這與粒徑分析的結果一致。這種變化可能是硒化修飾對天麻多糖的高級結構產生較大的影響，改變了天麻多糖的微觀表觀形態。

圖9 GEP（a）和SeGEP（b）的掃描電鏡圖（10000×）Fig.9 Scanning electron microscope pictures of GEP (a) and SeGEP (b) (10000×)

2.11 清除DPPH 自由基能力結果分析

DPPH 是一種穩定的自由基，分子內部存在有非共有電子的氮原子中心（N·），當抗氧化劑向DPPH自由基轉移一個氫原子或一個電子，氮原子中心會轉化為穩定的結構（N-H），這樣使DPPH 自由基性質不再存在[61]。通過DPPH 自由基清除實驗，推斷硒化修飾是否對天麻多糖清除DPPH 自由基的影響。如圖10a 所示，GEP 和SeGEP 對DPPH 自由基的清除率均表現出劑量依賴關系，隨著多糖濃度的增加，DPPH 自由基清除率越高。在濃度>3 mg/mL 時，相同的濃度下，SeGEP 的DPPH 自由基清除率顯著大于GEP（P<0.05）。在濃度10 mg/mL 時，SeGEP 有最大的DPPH 自由基清除率為98%±1.52%，這與陽性對照的VC清除率為100%接近。SeGEP 上的亞硒酸酯基團比GEP 表面的羥基基團更活潑，更有利于與DPPH 的氮原子中心孤對電子配對，使DPPH自由基性質不再存在。綜上所述，說明硒化修飾可以增加天多糖對DPPH 自由基的清除效果。

圖10 VC、GEP 和SeGEP 對DPPH 自由基（a）、ABTS+自由基（b）的清除能力及還原力測試（c）Fig.10 Scavenging ability of VC,GEP and SeGEP to DPPH radical (a),ABTS+ radical (b) and iron reduction ability test (c)

2.12 清除ABTS+自由基能力結果分析

ABTS 作為一種過氧化氫酶底物，能與氧化物反應生成穩定的綠色ABTS+自由基，并在734 nm 處有最大紫外吸收。其與抗氧化劑反應時，ABTS+自由基與一個游離電子配對變成非自由基形式，溶液由綠色變為無色[62]。通過此試驗，考察硒化修飾對天麻多糖清除ABTS+自由基的影響。如圖10b 所示，GEP、SeGEP 都具有對ABTS+自由基清除作用。濃度在1 mg/mL 時SeGEP 的清除作用顯著比GEP 強（P<0.05），在硒化天麻多糖濃度為1 mg/mL 時SeGEP的清除率為97.49%±1.16%，這與陽性對照的VC清除率為100%接近。天麻多糖的中羥基基團比較活潑，其易向ABTS+自由基提供氫原子，使天麻多糖具有抗氧化活性，且活性的強弱直接和供氫能力相關，硒化修飾后硒基團的存在可以進一步激活天麻多糖中的氫原子，從而增強其清除自由基的能力。綜上所述，表明硒化修飾后的天麻多糖在一定的濃度范圍內提高抗氧化能力。

2.13 鐵還原能力結果分析

抗氧化試劑可以使鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）的三價鐵變為二價鐵，K3Fe（CN）6中二價鐵和三氯化鐵反應生成普魯士藍，在700 nm 處有特定的吸收值[63]。如圖10c 所示，GEP 和SeGEP 的鐵還原能力均表現出劑量依賴關系，隨著多糖濃度的增加，還原能力越高，但上升的趨勢緩慢。相同的濃度下，SeGEP 的還原能力顯著強于GEP（P<0.05）。在濃度10 mg/mL時，GEP 有最大的還原力為0.73±0.17，而SeGEP 還原力為0.99±0.24。SeGEP 中的硒基團的存在可提供電子的能力更強，還原鐵氰化鉀中三價鐵生成二價鐵的能力也更強，表現為SeGEP 的鐵還原力比GEP 強，這說明硒化修飾可以增強天麻多糖的鐵還原能力。

3 結論

本研究以硒含量為指標，采用HNO3-Na2SeO3法制備硒化天麻多糖，并通過單因素和響應面法優化制備工藝，得出最佳的硒化天麻多糖的制備工藝條件為反應溫度74 ℃、硝酸濃度0.041%、反應時間8.4 h，在此條件下的硒含量為3891.05±10.86 μg/g；紅外光譜顯示，天麻多糖和硒化天麻多糖均有吡喃環的多糖，在硒化修飾后在1016、896、605 cm-1處產生新的吸收峰，分別為O-Se-O、Se=O、C-O-Se 特征吸收峰。核磁共振顯示，SeGEP 主要為有α構型、吡喃環的硒化天麻多糖；硒化修飾使粒徑變小、Zeta 電位的絕對值變大、改變了天麻多糖的微觀形態，并提高了天麻多糖在溶液體系中的穩定性；剛果紅試驗和碘-碘化鉀試驗表明，天麻多糖和硒化天麻多糖可能具備三股螺旋結構并含有較長的側鏈和支鏈結構，且硒化修飾過程不會對天麻多糖的螺旋結構、側鏈、支鏈結構產生影響。抗氧化結果顯示，硒化天麻多糖對DPPH 自由基最大清除率為98%±1.52%、對ABTS+自由基最大清除率為97.49%±1.16%，均與VC相當，最大鐵還原能力為0.99±0.24。以上三種抗氧化測試發現硒化天麻多糖的自由基清除率、鐵還原力比天麻多糖高，表明硒化修飾提高了天麻多糖的抗氧化能力。