CircRTN4調節miR-224-5p/MYT1L軸對膠質母細胞瘤細胞惡性生物學行為的影響

劉應剛, 李維民, 龍 勇, 向城衛, 張施遠, 陳星宇

(四川省遂寧市中心醫院, 四川 遂寧 629018)

神經膠質瘤仍然是全球最常見的原發性腦惡性腫瘤,膠質母細胞瘤(GM)是膠質瘤中惡性程度最高的病理類型,盡管治療方法有所進步,但患者的預后仍然很差。因此,探索GM的發病機制,尋找新的治療靶點和治療方法意義重大[1]。環狀RNAs(circRNAs)大部分由外顯子通過頭尾連接產生,在膠質瘤的發展過程中可通過微小RNA(miRNAs)調節基因表達[2]。CircRTN4也稱hsa_circ_0001006,在許多癌癥中異位表達,如胃癌、胰腺癌等,但其在GM中研究甚少[3]。生物信息學發現miR-224-5p分別與CircRTN4、髓磷脂轉錄因子1樣(MYT1L)存在結合位點,沉默MYT1L表達或上調miR-224-5p顯著降低神經膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[4-5]。但CircRTN4能否通過miR-224-5p/MYT1L軸影響GM細胞惡性生物學行為尚未報道。本研究旨在探索CircRTN4對GM細胞惡性生物學行為影響及相關作用機制的研究。

1 材料與方法

1.1細胞來源和培養：中國科學院提供人GM細胞系U118、U87、U251和LN229以及正常人星形膠質細胞細胞系NHA;然后在含有100 U/mL青霉素、10%胎牛血清和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中培養上述細胞,并在37℃下、5% CO2中孵育,當細胞融合達到70-90%時,使用0.25%胰蛋白酶消化并進行傳代。

1.2主要試劑與儀器：RPMI-1640培養基、胎牛血清(賽默飛世爾科技公司);青霉素、鏈霉素(Hyclone);RNAiso Plus試劑(Takara公司);逆轉錄酶試劑盒(Takara公司);沉默circRTN4 shRNA(sh circRTN4)序列及陰性對照(sh NC)、miR-224-5p抑制劑(miR-224-5p inhibitor)及抑制劑陰性對照(inhibitor NC)、miR-224-5p過表達(miR-224-5p mimics)及過表達陰性對照(mimics NC)(上海基因制藥有限公司);CCK-8試劑(天根生物技術有限公司);膜聯蛋白V-FITC凋亡試劑盒(BD Biosciences公司);Transwell室(Millipore公司);增殖蛋白(ki-67)、凋亡蛋白(cleaved Caspase-3)、MYT1L一抗(Abcam公司);轉膜儀、凝膠成像分析儀、iMark酶標儀(Bio-Rad公司);FACSVia流式細胞儀(美國BD公司);7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司);光學顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)。

1.3方 法

1.3.1qRT-PCR檢測GM細胞系及NHA細胞中CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表達水平：從人GM細胞系U118、U87、U251和LN229細胞及NHA細胞中采用RNAiso Plus試劑提取總RNA,隨后用逆轉錄酶試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA。SYBR Green Master Mix用作熒光指示劑,擴增反應在ABI7300系統上進行。以GAPDH和U6作為本研究中的內源對照。以2-△△Ct計算CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA相對基因表達。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2細胞分組及處理：取對數生長期的U251進行如下分組處理：空白組、sh NC組、sh circRTN4組、sh circRTN4+inhibitor NC組、sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組;其中空白組不做處理,sh NC組、sh circRTN4組、sh circRTN4+inhibitor NC組、sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組分別使用Lipofectamine 3000轉染試劑盒轉染或共轉染上述質粒和小RNA至U251細胞,轉染48h后進行指標分析。

1.3.3CCK-8法檢測細胞增殖：收集細胞并將濃度調節至2×103細胞/孔并接種至96孔板中,然后按照上述分組將細胞在培養箱中孵育0、24、48h,向每孔中加入10 μL CCK-8,并在37℃下保持2h。然后使用酶標儀檢測每個孔在450nm處的吸光度(A)值。

1.3.4qRT-PCR檢測各組U251細胞中CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表達水平：操作步驟同1.3.1。

1.3.5流式細胞術檢測細胞凋亡：將各組U251細胞接種在6孔板中,然后在室溫下以1000×g離心3min,收集U251細胞(1×105)用冷PBS沖洗兩次,以1×結合緩沖液重新懸浮細胞,然后加入5 μL異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V和5 μL PI,于25℃黑暗中孵育20min,最后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡,FlowJo v10軟件用于細胞凋亡分析。

1.3.6Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲：細胞侵入實驗：預先涂覆Matrigel并在4℃預冷卻過夜,然后200 μL U251細胞懸液(細胞重懸于無血清培養基中,1×105細胞/mL)加入到上室中,并600 μL 10% FBS的培養基加入到下室中。在37℃的細胞培養箱中培養24h,然后移去上室,用4%多聚甲醛固定細胞,并用0.1%結晶紫溶液染色,PBS沖洗細胞3次后,于光學顯微鏡下隨機選擇五個視野分析細胞侵入。但對于遷移分析,不使用Matrigel,其他步驟同侵入實驗。

1.3.7驗證miR-224-5p分別與CircRTN4、MYT1L的靶向關系：將含有特定的野生型(WT)或突變型(MUT)miR-224-5p結合位點的CircRTN4或MYT1L 3’UTR序列克隆到熒光素酶載體中,以構建CircRTN4-WT、MYT1L-WT或CircRTN4-MUT、MYT1L-MUT載體。將上述載體與miR-224-5p mimics及mimics NC共轉染至U251細胞,48h后收獲細胞,使用雙熒光素酶報告試劑盒測量熒光素酶活性。

1.3.8Western blot檢測cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L蛋白表達水平：將各組U251細胞用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取總蛋白,然后高速離心20min(13000 r/min,4℃),離心后收集上清液,BCA蛋白檢測試劑盒進行濃度定量。將蛋白質樣品在100℃煮沸并變性5min,將蛋白質在10% SDS-PAGE上分離并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h后,隨后加入稀釋的第一抗體(cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L),并將膜在4℃孵育過夜,然后與結合HRP的第二抗體相互作用2h,軟件分析目的蛋白表達。

1.3.9動物體內實驗：將6周齡的BALB/c裸鼠(廈門大學,許可證號：SCXK(閩)2018-0003)隨機分為敲除CircRTN4(sh CircRTN4)組、陰性對照(sh NC)組、空白組,每組10只裸鼠。分別將轉染的sh CircRTN4或sh NC U251細胞(3×106細胞)皮下注射到裸鼠中,注射后30d,對裸鼠實施安樂死,并切除腫瘤、稱重。

2 結 果

2.1GM細胞系及NHA細胞中CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表達水平：與NHA細胞相比,U118、U87、U251和LN229細胞中CircRTN4、MYT1L mRNA表達增加,miR-224-5p表達下降(P<0.05),且U251細胞中變化最為顯著,故作為后續研究對象,見表2。

表2 CircRTN4 miR-224-5p MYT1L mRNA表達水平比較

2.2各組U251細胞增殖變化：sh circRTN4組24h、48h A450值低于空白組、sh NC組(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組24h、48h A450值高于sh circRTN4+inhibitor NC組(P<0.05),見表3。

表3 各組U251細胞A450值的比較

2.3各組U251細胞CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表達變化：sh circRTN4組CircRTN4、MYT1L mRNA表達低于空白組、sh NC組,但miR-224-5p表達增加(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組MYT1L mRNA表達高于sh circRTN4+inhibitor NC組,但miR-224-5p表達下降(P<0.05),CircRTN4表達無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組U251細胞CircRTN4 miR-224-5p MYT1L mRNA表達水平比較

2.4各組U251細胞凋亡變化：sh circRTN4組凋亡率高于空白組、sh NC組(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組凋亡率低于sh circRTN4+inhibitor NC組(P<0.05),見圖1、表5。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡

表5 各組U251細胞凋亡率的比較

2.5各組U251細胞遷移、侵襲變化：sh circRTN4組遷移、侵襲數低于空白組、sh NC組(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組遷移、侵襲數高于sh circRTN4+inhibitor NC組(P<0.05),見圖2、表6。

圖2 觀察細胞遷移、侵襲變化

表6 各組U251細胞遷移侵襲數的比較

2.6驗證miR-224-5p分別與CircRTN4、MYT1L的靶向關系：數據庫顯示miR-224-5p分別與CircRTN4、MYT1L存在結合位點。如圖3、4。miR-224-5p mimics+CircRTN4-WT組熒光素酶活性低于mimics NC+CircRTN4-WT組(P<0.05),見表7。miR-224-5p mimics+MYT1L-WT組熒光素酶活性低于mimics NC+MYT1L-WT組(P<0.05),見表8。

圖3 miR-224-5p與CircRTN4的結合位點

圖4 miR-224-5p與MYT1L的結合位點

表7 CircRTN4靶向調節

表8 miR-224-5p靶向調節

2.7各組U251細胞cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L蛋白的表達水平：sh circRTN4組ki-67、MYT1L表達低于空白組、sh NC組,但cleaved Caspase-3表達增加(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組ki-67、MYT1L表達高于sh circRTN4+inhibitor NC組,但cleaved Caspase-3表達下降(P<0.05)。見圖5、表9。

圖5 細胞中cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L蛋白表達(Western blot圖)

表9 各組細胞中cleaved Caspase-3 ki-67 MYT1L表達的比較

2.8干擾circRTN4對移植瘤裸鼠的影響：干擾circRTN4較對照組、sh NC組腫瘤質量顯著降低(P<0.05),見表10。

表10 干擾circRTN4對移植瘤裸鼠腫瘤質量的比較

3 討 論

GM是中樞神經系統最常見的原發性侵襲性腫瘤之一,但神經膠質瘤的確切病因仍不清楚,近年來靶向治療可預防惡性腫瘤并提高患者存活率[6]。因此確定GM治療的潛在分子靶點勢在必行。

近來年的研究表明,circRNAs的異常表達與包括神經膠質瘤在內的人類惡性腫瘤的發生和發展有關[7]。研究發現小鼠腦中,circRTN4在表達隨著原代神經元的分化而增加,參與調節神經發育[8]。先前研究顯示[3],circRTN4被確定為胰腺癌腦轉移的潛在治療靶點和生物標志物。基于此,本研究推測circRTN4在GM中上調,參與GM發展。在多種GM細胞系研究中,circRTN4均顯著上調,與多種其他腫瘤研究趨勢相吻合,尤其是U251細胞變化最為顯著。當沉默circRTN4處理U251細胞后,細胞遷移、侵襲數、24h、48h A450值顯著降低,細胞凋亡顯著增加,提示沉默circRTN4可抑制U251細胞增殖、侵襲及遷移,促進其凋亡。Western blot結果顯示ki-67蛋白表達降低,cleaved Caspase-3表達增加,進一步表明沉默circRTN4可抑制U251細胞惡性行為學發展。

CircRNA可以通過miRNA反應元件吸附miRNA,間接調節基因表達,而miRNA是一種調節mRNA翻譯的非編碼小RNA轉錄物,參與調節細胞增殖、細胞凋亡、胚胎發育等多種生物學過程以及腫瘤的發生和發展[9]。研究發現miR-224-5p可抑制甲狀腺乳頭狀癌、黑色素瘤包括GM在內的腫瘤發展[10-12]。本研究發現miR-224-5p在多種GM細胞系表達下調,通過生物信息學分析預測了circRTN4與miR-224-5p的結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗、qRT-PCR證實circRTN4能吸附miR-224-5p并負調控其表達,提示circRTN4可能通過上調miR-224-5p發揮抑制U251細胞惡性行為學發展的作用。同時文章還發現MYT1L是circRTN4-miR-224-5p的下游靶點,在GM細胞系中上調,與先前研究相吻合[13]。沉默circRTN4表達增加miR-224-5p的表達,但減少MYT1L的表達,且MYT1L被鑒定為miR-224-5p的靶標并負調控其表達,提示circRTN4可能通過上調miR-224-5p/MYT1L軸抑制GM細胞惡性生物學行為發展。為進一步驗證實驗結論,以miR-224-5p inhibitor進行回復驗證,結果發現miR-224-5p inhibitor逆轉了沉默CircRTN4對U251細胞惡性生物學行為的抑制作用,提示沉默CircRTN4抑制U251細胞惡性生物學行為發展,可能與上調miR-224-5p/MYT1L軸有關。最后文章進行了動物體內實驗研究,結果發現沉默CircRTN4可抑制裸鼠移植瘤生長,表明CircRTN4可能成為治療GM細胞的靶點。

綜上所述,沉默CircRTN4調節miR-224-5p/MYT1L軸抑制U251細胞惡性生物學行為,CircRTN4有望成為治療GM的靶點和生物標志物,但由于實驗僅是初步研究,結論仍需進一步驗證。