miR-21、miR-26a及miR-200a在子癇前期患者中的表達水平及與病情的相關性

劉菊菊,蘇 敏,薛 璇

(1.南京市婦幼保健院產科,江蘇 南京 210000;2.南通大學附屬醫院婦產科,江蘇 南通 226001)

子癇前期(preeclampsia,PE)主要發生在妊娠20周以后,主要特征是高血壓、蛋白尿和水腫,嚴重時會對孕婦的肝、腎、心臟等器官造成損傷,常伴有妊娠不良結局的發生,是造成孕婦和圍生兒死亡的主要原因之一[1-2]。目前,PE發病機制尚不明確,且臨床上缺乏有效的早期PE檢測標志物。因此,尋找一種能預測PE進展的檢測標志物對緩解PE進展及改善妊娠結局具有十分重要的意義。

微小RNA(microRNA,miRNA)是長度為18～25nt的內源性非編碼RNA,已被發現在胎盤滋養細胞增殖、凋亡、分化等過程中起重要的調節作用,可參與PE的發生發展[3-4]。miR-21、miR-26a和miR-200a已被發現與多種腫瘤的發生發展密切相關[5],但它們在PE發病中的研究較少。董坤[6]等人的研究發現,miR-21在PE患者中的表達水平顯著升高。董麗宏[7]等人報道稱,miR-26a在妊娠高血壓患者的血漿中高表達,且過表達miR-26a可顯著抑制滋養層細胞的增殖和侵襲。另有研究表明,miR-200a在妊娠糖尿病患者的外周血中表達顯著升高[8]。因此,我們推測,血清中miR-21、miR-26a和miR-200a的表達水平可能與PE的發生發展及不良妊娠結局相關。本研究通過檢測PE患者血清中miR-21、miR-26a和miR-200a的表達,探討其表達水平與PE進程及妊娠結局的相關性,以期為PE的早期診斷及預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料

選取2019年3月至2021年3月在南京市婦幼保健院治療的PE患者103例,將其分為輕度PE組(57例)和重度PE組(46例)。子癇前期的診斷標準為:妊娠20周后出現收縮壓≥140mmHg和(或)舒張壓≥90mmHg伴蛋白尿≥0.3g/24小時或隨機尿蛋白≥(+)。重度子癇前期診斷標準為:子癇前期患者出現下述任一不良情況可診斷為重度子癇前期:①血壓持續升高:收縮壓≥160mmHg和(或)舒張壓≥110mmHg。②蛋白尿≥2.0g/24小時或隨機蛋白尿≥(++)。③血清肌酐≥1.2mg/dL。④血小板<100×109/L。⑤微血管病性溶血—LDH升高。⑥血清轉氨酶水平升高—ALT或AST。⑦持續頭痛或其他大腦或視覺障礙。⑧持續上腹部疼痛。另選取同期正常50例孕婦作為對照。其中,輕度PE組孕婦年齡24～34歲,平均(28.92±4.89)歲,平均孕周(24.12±1.33)周;重度PE組孕婦年齡25～36歲,平均(29.32±3.96)歲,平均孕周(24.37±0.98)周;對照組孕婦年齡24～35歲,平均(29.77±4.17)歲,平均孕周(24.66±1.03)周。三組孕婦在平均年齡及平均孕周等方面差異無顯著性(P>0.05)。本研究經南京市婦幼保健院倫理委員會批準,且所有患者及其家屬均已簽署知情同意書。

1.1.2 納入及排除標準

納入標準:①所有患者均符合第八版《婦產科學》中關于PE的相關診斷標準[9];②對照組孕婦無任何妊娠合并癥,無蛋白尿,且胎兒發育正常;③所有孕婦均為初次妊娠,且均為自然受孕。排除標準:①有高血壓、糖尿病、心臟病及腎病病史的患者;②有結核或肝炎等急慢性傳染病的患者;③有免疫性疾病的患者;④出現胎盤早剝、胎盤前置或胎膜早破的患者。

1.1.3 主要試劑與儀器

miRNeasy Serum/Plasma 試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒(德國Qiagen);逆轉錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific);實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems);Cobas 8000 全自動生化分析儀(瑞士羅氏)。

1.2 方法

1.2.1 血清miRNA提取

于清晨在各組孕婦空腹狀態下采集靜脈血5mL,4℃、3 000r/min離心15min后收集上清液,并將其置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 miR-21、miR-26a和miR-200a表達水平檢測

用miRNeasy Serum/Plasma試劑盒提取總RNA,然后將其濃度調整為1μg/μL;通過逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA,然后通過SYBR Green PCR試劑盒檢測血清中miR-21、miR-26a和miR-200a的表達水平,以U6為內參基因。PCR反應條件為: 95℃ 15 min,95℃ 15s,60℃ 35s,70℃ 20s,共35個循環。采用2-ΔΔCt法計算血清miR-21、miR-26a和miR-200a的相對表達量。所有引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 觀察指標

比較各組孕婦的年齡、孕周、身體質量指數(BMI)、血壓、24h尿蛋白等臨床資料和血清miR-21、miR-26a及miR-200a的相對表達量。對所有孕婦進行跟蹤隨訪,以完善各組孕婦的妊娠結局及新生兒的健康情況。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組研究對象臨床資料比較

各組研究對象在年齡、孕周等方面差異無顯著性(P>0.05);與對照組相比,輕度PE組患者BMI、舒張壓、收縮壓及24h尿蛋白顯著升高(P<0.05);與輕度PE組患者相比,重度PE組患者舒張壓、收縮壓及24h尿蛋白顯著升高(P<0.05)。結果詳見表2。

表2 各組研究對象臨床資料比較

2.2 各組研究對象血清miR-21、miR-26a及miR-200a表達水平比較

本研究通過qRT-PCR檢測miR-21、miR-26a及miR-200a在對照組、輕度PE組及重度PE組孕婦血清中的表達。結果發現,與對照組相比,miR-21、miR-26a及miR-200a在PE患者中的表達均顯著上調(P<0.05);且miR-21、miR-26a及miR-200a在重度PE組孕婦中的表達顯著高于輕度PE組(P<0.05)。結果詳見圖1。

注:A:miR-21在各組研究對象血清中的表達;B:miR-26a在各組研究對象血清中的表達;C:miR-200a在各組研究對象血清中的表達。與對照組相比,*P<0.05;與輕度PE組相比,#P<0.05。

2.3 各組研究對象不良妊娠結局的比較

與對照組相比,輕度PE組及重度PE組早產、低體重兒、巨大兒及胎兒死亡的發生率顯著升高(P<0.05);且與輕度PE組相比,重度PE組不良妊娠結局的發生率顯著升高(P<0.05)。結果詳見表3。

表3 各組研究對象不良妊娠結局比較

2.4 血清miR-21、miR-26a及miR-200a表達水平與一般資料及不良妊娠結局的相關性分析

Pearson相關分析結果顯示,miR-21、miR-26a及miR-200a的表達均與舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白、早產、低體重兒、巨大兒、胎兒死亡呈正相關(P<0.05),而與年齡、孕周和BMI無相關性(P>0.05)。結果詳見表4。

2.5 血清miR-21、miR-26a及miR-200a對PE診斷價值的分析

通過受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析血清miR-21、miR-26a、miR-200a及三者聯合診斷PE的效能,結果發現,血清miR-21、miR-26a、miR-200a及三者聯合診斷PE的曲線下面積(AUC)分別為0.930(95%CI:0.875～0.984)、0.908(95%CI:0.856～0.960)、0.746(95%CI:0.635～0.839)及0.967(95%CI:0.935～0.998),這提示聯合檢測有助于提高診斷效能。進一步分析血清miR-21、miR-26a、miR-200a及三者聯合對PE診斷的特異性和敏感度,結果發現聯合診斷能提高檢測的敏感度和特異性。結果詳見表5和圖2。

圖2 血清miR-21、miR-26a及miR-200a預測PE的ROC曲線

表5 血清miR-21、miR-26a及miR-200a對PE診斷價值的比較

3 討論

3.1 PE的早期診斷生物標志物仍然缺乏

PE在孕婦中的發病率高達4%～8%,且近年來呈上升趨勢,多數患者發生在孕中后期。PE患者多伴有蛋白尿、嚴重高血壓、水腫、嘔吐、頭痛、全身小動脈痙攣等癥狀,是導致產婦和胎兒死亡主要原因之一[10-11]。另有研究表明,有PE病史的女性其后代在妊娠時發生PE的風險會顯著增加,且其今后患心血管疾病的風險也會顯著增加[12]。雖然隨著人們產前檢查意識的增強,PE的發生率已經有了一定程度的控制,但由于病情進展較為迅速,一經發現,孕婦和胎兒已經受不同程度的傷害,因此,尋找一種靈敏、有效的PE早期診斷生物標志物是十分重要的。

3.2 miR-21、miR-26a及miR-200a既往研究

miRNA已被證明在多種生物學及病理學過程中起調控作用,有證據表明妊娠期孕婦外周血中可檢測到多種miRNA的表達,且其與孕齡、不良妊娠結局等相關,這說明miRNA表達可能是檢測妊娠疾病新型診斷工具[13]。有研究發現,miR-21在腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移、凋亡等多種生物學過程中扮演重要角色,是目前發現的唯一在多種實體瘤及非實體瘤中高表達的miRNA,也是第一個在腫瘤患者血清中檢測到的miRNA[14-15]。胎盤組織中miR-21的表達與胎兒生長受限的發生密切相關,且miR-21在重度PE患者胎盤組織中的表達顯著升高[6,16]。miR-26a位于人3號染色體,在多種組織中表達。有研究發現,miR-26a可在胃癌、肺癌、肝癌及乳腺癌中發揮抑癌作用[17-18]。楊瑩等[19]發現miR-26a在PE患者胎盤組織中的表達顯著升高,且miR-26a的表達與患者的病情程度呈正相關。miR-200a是miR-200家族的重要成員之一,在多種惡性腫瘤中扮演抑癌基因的角色。有研究發現,miR-200a在非小細胞肺癌患者外周血中表達上調[20]。另外,miR-200a也可作為血清標志物,判斷結直腸癌患者的預后[21]。黃麗斯等[8]研究證明,miR-200a在妊娠糖尿病患者外周血及胎盤組織中的表達顯著升高,但目前并無miR-200a與PE相關的報道。而同為miR-200家族的另一成員,miR-200c已被證明在PE患者胎盤組織中的表達顯著升高[22]。

3.3 miR-21、miR-26a及miR-200a表達水平與PE的新發現

本研究結果顯示,PE組miR-21的表達水平顯著高于對照組,與之前的研究結果一致。在此基礎上,本研究還發現miR-21的表達水平與PE患者的病情嚴重程度呈正相關。另外,我們將miR-21的表達水平與臨床指標及不良妊娠結局進行相關性分析,結果發現miR-21的表達與PE患者的舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白及不良妊娠結局呈正相關。本研究顯示PE患者胎盤組織中miR-26a表達顯著升高,且miR-26a表達水平與病情程度呈正相關。此外,本研究還進一步分析了miR-26a表達與患者舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白及不良妊娠結局的相關性,發現它們之間呈正相關。在本研究中,我們首次發現miR-200a在PE患者外周血中的表達顯著升高,且其表達水平與PE患者的病情嚴重程度呈正相關。我們同樣發現,miR-200a的表達水平與PE患者的舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白及不良妊娠結局呈正相關。

綜上所述,PE患者胎盤組織miR-21、miR-26a和miR-200a水平呈現高表達,三者聯合檢測PE時的診斷價值更高。本研究對早期預測及診斷PE,評估患者預后具有重要的意義。但由于本研究的樣本量不大,結果存在一定的局限性。因此,后續還需要進行更大樣本量的研究,以及對調節機制的深入研究。