同種異體移植物炎性因子-1在糖尿病睪丸大鼠模型中的表達及意義

李德朝 張明津 藍一筆 馬春雷 付偉金

1賀州市中醫醫院泌尿外科（廣西賀州 542899）；2廣西醫科大學第一附屬醫院泌尿外科（南寧 530022）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種代謝性疾病，表現為全身內環境的血糖增高，可引起全身多個系統和器官發生病變［1］，如糖尿病腎病（DKD）、糖尿病視網膜病變、糖尿病心肌病、糖尿病足潰瘍等［2-4］，嚴重影響患者身體健康。近年，DM 對男性生殖系統特別是對睪丸功能的影響逐漸引起了研究者的重視。DM 可引起氧化應激及炎癥反應［5-6］，激活相關信號通路如胰島素和血糖調控通路FoxO1 等［7］，導致睪丸細胞凋亡和生精細胞減少［8-9］，影響睪丸功能，具體機制仍有待研究。

同種異體移植物炎性因子-1（allograft inflammatory factor-1，AIF-1）是一種與巨噬細胞免疫調節活動密切相關的炎癥因子［10-11］，已經證實AIF-1 參與DKD 發病過程，并促進炎性因子IL-6、TNF-α 等過表達［12］，提示AIF-1 誘發的炎癥反應可能在DM發生及發展中起重要作用。那么AIF-1 在DM 睪丸中表達情況及是否會引起炎癥反應，目前研究相關報道較少。本研究擬建立Ⅰ型DM 睪丸大鼠模型，探討AIF-1 在DM 睪丸大鼠模型中的表達及意義，為DM睪丸病變診斷和治療提供新策略和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物4～6 周齡，雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，購自廣西醫科大學實驗動物中心，SD大鼠飼養在SPF 級屏障環境，濕度40%～70%，溫度20～26 ℃，光照12 h，所有大鼠自由飲水及飲食。動物實驗獲得廣西醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（編號：2022-KT-國基-254），所有操作均根據國家研究委員會的實驗室動物護理和使用指南進行。

1.2 實驗試劑及儀器鏈脲佐菌素（STZ）、檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液（PBS）購至美國Sigma公司，AIF-1 兔抗鼠單克隆抗體（ab283319）、NFκB p65 鼠單克隆抗體（ab32536）購至美國Abacm公司，HRR 標記羊抗鼠二抗IgG（GB21302）、組織自發熒光淬滅劑（G1221）購至武漢賽維爾公司，免疫組化染色試劑盒購至北京中杉金橋生物技術有限公司，分析天平購至盛平公司，電子天平購至力辰公司，血糖儀（卓越型）購至ROCHE 公司，病理切片機（RM2016）購至上海徠卡儀器有限公司，白光顯微鏡（E100）和正置熒光顯微鏡（Eclipse C1）購至上海尼康儀器有限公司。

1.3 動物實驗分組42 只雄性SD 大鼠隨機分為實驗組（DM 組，n=24）和正常對照組（normal control，NC 組，n=18）。空腹時，DM 組單次腹腔注射pH=4.5，0.1 mmol/L 的檸檬酸緩沖液溶解的STZ，50 mg/kg。注射STZ 后3 d，尾靜脈采血，隨機血糖高于16.7 mmol/L 時，出現多飲、多食、多尿等癥狀時，判定為糖尿病大鼠模型成功［13-14］；NC 組僅腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。

24 只實驗組大鼠中，造模成功20 只，將DM 大鼠隨機分組：（1）糖尿病睪丸4 周組（DMT4W 組，n=6）：成模4 周后處死。（2）糖尿病睪丸8 周組（DMT8W，n=6）：成模8 周后處死。（3）糖尿病睪丸12 周組（DMT12W，n=6）：成模12 周后處死。NC 分組：（1）正常對照4周組（NC4W，n=6）：4 周后處死。（2）正常對照8 周組（NC8W，n=6）：8 周后處死。（3）正常對照12 周組（NC12W，n=6）：12 周后處死。

1.4 測量大鼠血糖和體質量每周記錄大鼠的進食量和飲水量，用天平測量空腹時各組大鼠體質量；尾靜脈采血，血糖儀測定各組大鼠隨機血糖值。

1.5 標本采集斷頸法處死各組大鼠后摘取雙側睪丸，天平稱量睪丸重量。PBS 液清洗后將睪丸組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，4 μm切片。左側睪丸組織用于HE染色，行組織病理學檢查；右側睪丸組織用于免疫組化和免疫熒光檢查。

1.6 組織病理學檢查切片放入酒精脫蠟后，浸泡蘇木素3 min，自來水清洗后1%鹽酸酒精分化5 s，返藍5 min，伊紅液浸泡20 s，洗滌后，切片浸沒于不同梯度酒精和二甲苯液體脫水，中性樹膠封片，顯微鏡觀察，細胞核染為藍色，胞質染為紅色，按100 ×、200 ×、400 ×倍數拍片。

1.7 免疫組織化學檢查切片脫蠟后進行抗原修復，滴加3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15 min 后，滴加一抗AIF-1（濃度1∶2 000），4 ℃孵育過夜，滴加HRR標記羊抗兔二抗（1∶300），37 ℃孵育20～30 min，PBS 洗滌后室溫下孵育30 min。PBS 洗滌后滴加DAB 顯色劑。自來水沖洗，蘇木素復染30～60 s，1%鹽酸乙醇分化后，返藍，無水乙醇，二甲苯脫水透明后封片鏡檢。顯微鏡觀察，拍片。

AIF-1 蛋白陽性主要定位于細胞膜和細胞漿。免疫組化結果判定參考既往文獻［15-16］，隨機檢測4 個高倍視野（400 ×），結果采用半定量計分方法，根據細胞染色強度和染色陽性細胞比例（陽性細胞數占同類細胞數的比例）的乘積來判定。染色強度評分：0 分為無特異性著色，1 分為淺黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色；染色陽性細胞占比評分：0 分為＜5%，1 分為5%～25%，2 分為6%～50%，3 分為＞51%。兩種評分相乘（A×B），將結果分為：0～3 分為低表達；4～9 為高表達。

1.8 免疫熒光檢查清洗及浸泡切片后，山羊血清封閉，室溫孵育60 min 后滴加一抗AIF-1（濃度1∶300）和NF-κB p65（濃度1∶500），4 ℃過夜。PBS清洗，滴加熒光素標記二抗（濃度1∶200），室溫孵育60 min 后PBS 清洗，DAPI 染核15 min，PBS 清洗，加抗熒光淬滅劑，封片后熒光顯微鏡下觀察（400 ×）。AIF-1 和NF-κB p65 蛋白陽性表達為紅色特異性熒光。

1.9 統計學方法用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析，Graphpad Prism 5 軟件作圖。計量資料用均數±標準差表示；成組設計兩樣本過均數比較，滿足獨立性、正態性、方差齊性檢驗，采用獨立樣本t檢驗，若不滿足方差齊性及正態分布，采用非參數檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義，P＜0.01 為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、血糖、睪丸情況實驗前，各組大鼠體質量、隨機血糖，差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。DMT組大鼠于造模成功6周、9周時各死亡1 只，最后共存活16 只，分別為DMT4W組6 只，DMT8W 組5 只及DMT12W 組5 只，總體來說，STZ 誘導1 型DM 大鼠模型成模率較高，誘導周期短，能滿足實驗要求。NC 組18 只，在飼養過程中無死亡，分別為NC4W 組6 只，NC8W 組6 只，NC12W 組6 只。

表1 實驗前糖尿病組和對照組大鼠體質量、血糖比較Tab.1 Body weight and blood glucose in diabetic and control rats before experiment ±s

表1 實驗前糖尿病組和對照組大鼠體質量、血糖比較Tab.1 Body weight and blood glucose in diabetic and control rats before experiment ±s

注：與NC組相比，*P＜0.05

組別NC4W DMT4W NC8W DMT8W NC12W DMT12W血糖（mmol/L）7.70±1.32 7.47±1.29*6.30±0.77 7.20±1.17*6.97±0.70 7.35±0.38*數量6 6 6 6 6 6體質量（g）171.43±12.36 178.55±15.29*179.23±12.89 182.80±13.52*172.61±10.34 173.27±6.29*

各實驗組大鼠每周稱量體質量及監測隨機血糖。與NC 組比較，DWT 組大鼠飲食、飲水增加，從4 周開始體質量顯著下降（P＜0.01），血糖升高（P＜0.01）；到了8、12 周各實驗組體質量大鼠持續下降（P＜0.01）；而血糖繼續升高（P＜0.01，表2）。

表2 糖尿病組和對照組大鼠體質量、睪丸重量、血糖比較Tab.2 Body and testicular weight，and blood glucose in diabetic and control rats ±s

注：與NC組相比，*P＜0.05；**P＜0.01

組別NC4W DMT4W NC8W DMT8W NC12W DMT12W睪丸（g）1.67±0.11 1.64±0.10 1.87±0.10 1.65±0.11*1.94±0.16 1.52±0.03*數量6 6 6 5 6 5體質量（g）289.55±32.16 201.47±28.12**384.85±17.84 203.44±23.11**469.93±29.37 231.52±36.86**血糖（mmol/l）7.23±0.94 28.30±3.22**7.23±0.86 26.92±1.98**8.21±1.95 26.20±3.72**

分別于造模成功4、8、12 周后處死各組大鼠，與NC 組相比，DWT4W 組大鼠睪丸重量雖然降低，但差異無統計學意義（P＞0.05，表2），8、12 周時，睪丸重量持續下降（P＜0.01，表2）。

2.2 各組大鼠睪丸組織病理學變化組織病理學結果表明，與NC 組相比，DMT4W 組大鼠生精小管形態不規則，睪丸間質和支持細胞減少，生精細胞從基底膜分離，形狀不規則、排列紊亂，精母細胞和精子細胞數量減少、畸形增多。到了DMT8W、DMT12W 時，生精小管進一步萎縮，精母細胞和精子細胞進一步減少，提示隨著DM 病程加重，DM 組睪丸組織萎縮，結構改變明顯（圖1）。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理學圖片Fig.1 Histopathological images of the rat testicular tissues in different groups

2.3 各組大鼠睪丸AIF-1 蛋白表達情況免疫組織化學結果顯示，NC 組睪丸組織中AIF-1 為低表達或陰性表達，與NC 組相比，DMT 各組大鼠睪丸組織內AIF-1 陽性表達明顯增加（P＜0.05）。DMT4W 組中AIF-1 蛋白陽性表達最明顯。雖然DMT8W、DMT12W 組AIF-1 蛋白陽性表達相對減弱，但仍高于NC 組（表3、圖2）。

圖2 各組大鼠睪丸組織AIF-1 蛋白表達Fig.2 The expression of AIF-1 protein in the rat testicular tissues of different groups

表3 AIF-1 蛋白在各組睪丸組織的表達Tab.3 The expression of AIF-1 protein in the testicular tissues of different groups

2.4 各組大鼠睪丸AIF-1 和NF-κB p65 免疫熒光表達情況免疫熒光染色結果顯示，AIF-1 和NFκB p65 主要表達在細胞膜和細胞質。與NC 組相比，DWT 各組睪丸組織AIF-1 和NF-κB p65 熒光染色強度明顯增加。DMT4W 組中AIF-1 和NF-κB p65熒光染色最明顯，DMT8W、DMT12W組AIF-1和NF-κB p65 熒光表達相對減弱，但仍高于NC 組。陽性表達除見于細胞膜和細胞質，細胞核也呈陽性表達（圖3、4）。

圖3 各組大鼠睪丸組織AIF-1 蛋白免疫熒光表達Fig.3 The immunofluorescence staining expression of AIF-1 protein in the rat testicular tissues of different groups

圖4 各組大鼠睪丸組織NF-kB p65 蛋白免疫熒光表達Fig.4 The immunofluorescence staining expression of NF-kB p65 protein in the rat testicular tissues of different groups

3 討論

DM 患者長期處于高血糖環境，睪丸結構及生精功能受到損害，表現為少精、弱精癥等，其損傷機制可能與DM 時產生的持續高血糖內環境，導致活性氧（ROS）及炎性因子IL-1、IL-6 等表達增加，激活氧化應激及炎癥反應［17-18］，提示炎癥反應可能參與了DM 誘導的睪丸損傷。

AIF-1 是一種17 千道爾頓（17 kDa）單位的鈣結合蛋白。它是INF-Y 合成，由單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞誘導產生炎性細胞因子，可與多種靶點相互作用，與多種炎癥性疾病如類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、間質纖維化等發病密切相關［19-20］。在1 型DM 大鼠模型和胰島素分泌Ⅰ型細胞（INS-1）中，AIF-1 可誘導一氧化氮（NO）增多和免疫細胞活化，促進細胞凋亡。在Ⅱ型DKD 患者血清AIF-1 表達水平與蛋白尿增加呈正相關。AIF-1 在DKD 動物模型腎組織和高糖誘導的小鼠腎小球內皮細胞（MRGECs）中過表達，可激活炎癥和氧化應激反應［12］。

目前還不清楚AIF-1 在DM 患者睪丸中表達情況，是否激活相關炎癥因子調控的相關信號通路。由于倫理學原因，真實世界中無法對人DM患者睪丸組織的AIF-1 表達進行檢測。本研究擬對DM 大鼠模型睪丸進行體內研究。目前有1 型和2 型DM 動物模型，相比2 型，1 型DM 大鼠模型成功率高，是大多數DM 研究首選動物模型［21-22］，因此本研究選取1 型DM 大鼠模型。

本研究首先對雄性SD 大鼠腹腔注射SMZ，破壞胰島素功能，制作1 型DM 大鼠模型。為模擬體內DM 真實發病進程，本研究分別在誘導DM 大鼠模型成模4、8、12 周時，檢測各組大鼠體重和血糖，與NC 組相比，在4、8、12 周時，DMT 各組大鼠體重持續下降（P＜0.05）；同時DMT 各組大鼠血糖持續增高（P＜0.05），提示DM 造模成功，可模擬體內DM 疾病的發展過程。

組織病理學結果表明，與NC 組相比，DMT4W組大鼠生精小管形態不規則，間質和支持細胞減少，生精細胞從基底膜分離，形狀不規則、排列紊亂，精母細胞和精子細胞數量減少、畸形增多。到了DMT8W、DMT12W 時，生精小管進一步萎縮，精母細胞和精子細胞進一步減少，提示隨著DM 病程加重，睪丸組織結構萎縮，睪丸功能進一步受損，與既往研究相符合。

而免疫組織化學結果顯示，與NC 組相比，DMT 組大鼠睪丸組織生精小管內AIF-1 棕黃色或棕褐色陽性細胞多，染色程度深，提示DMT 組睪丸中AIF-1 蛋白表達明顯升高，表明炎癥因子AIF-1蛋白可能參與DMT 的發生發展。

核因子κB（NF-κB）是從B 淋巴細胞核抽提物中檢出的一種能夠與免疫球蛋白k 鏈和重鏈基因增強子序列特異結合的核蛋白因子，與細胞增殖、分化、免疫應激以及細胞周期和凋亡等密切相關。NF-κB p65 是NF-κB 中由p65 亞單位構成的一種異源二聚體，其表達增加可促進相關炎癥因子增多和激活炎癥反應［23］。相關研究［24-25］證實過表達AIF-1 后，通過IkBa 激酶磷酸化和促進p65/p50 異源二聚體從細胞質易位到細胞核，激活NFκB 信號通路，導致NF-κB p65 表達增加。那么在DMT 大鼠模型睪丸內AIF-1 過表達后，是否會促進NF-κB p65 表達增加？

為證實這一假說，本研究進一步結果顯示，與NC 組相比，DMT 各組大鼠睪丸組織AIF-1 和NFκB p65 免疫熒光表達增加（P＜0.05），提示DMT大鼠模型中，AIF-1 過表達后，有可能激活NF-κB信號通路，導致NF-κB p65 表達增加，從而促進炎癥和氧化應激反應，導致睪丸功能受損。

本研究還存在以下不足：（1）沒有對DMT 各組大鼠睪丸模型中的精子活力和精液常規進行檢測，因而無法探討精子活力與AIF-1 表達的相關性。（2）沒有檢測AIF-1 調控相關炎性因子IL-6、TNF-α 等表達。（3）沒有進行體外細胞實驗，從而探討AIF-1 調控NF-κB p65 表達的機制和信號通路。

綜上所述，本研究首次發現DMT 大鼠模型睪丸組織中AIF-1 過表達，有可能調控NF-κB 信號通路，因而促進NF-κB p65 過表達，激活炎癥反應和氧化應激，從而破壞睪丸組織結構，影響睪丸功能。AIF-1 有可能成為治療DMT 病變的新靶點和診斷標記物。

【Author contributions】ZHANG Mingjin，LAN Yibi and YANG Meizi performed the experiments and wrote the article.MA Chunlei performed the experiments.LI Dechao revised the article.FU Weijin designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.