miR-181b miR-210 miR-126在妊娠期高血壓疾病中的表達及與炎癥反應的相關性

劉 洋, 趙巧棉, 李海燕, 張思宇, 楊 穎, 宮 月

(河北省承德市婦幼保健院生殖中心, 河北 承德 067000)

妊娠期高血壓疾病(Hypertensive Disorders in Pregnancy,HDP)作為產科常見并發癥之一,亦是孕產婦死亡重要原因[1]。HDP病因及發病機制目前尚未十分明確,臨床表現主要為蛋白尿及高血壓,癥狀嚴重者可出現多系統臟器損傷,嚴重威脅母嬰健康。因此,探尋HDP發病機制對其診療意義重大。微小RNA(microRNA,miR)屬于基因調控分子,可影響眾多蛋白編碼基因輸出,參加大多數細胞因子免疫應答及轉錄調控[2]。有研究指出,miR表達和胎盤病理生理發育存在一定關聯,成熟miR可參與滋養細胞增殖、凋亡等過程[3]。miR-181b、miR-210、miR-126均為臨床常見的miR分子,部分學者發現其在HDP發病過程中起著重要作用[4]。國內外研究指出,炎癥反應貫穿HDP發生發展過程,其中炎癥因子與HDP病情變化密切相關[5-6]。目前雖有一些研究探索miR與HDP患者炎癥因子的關系,但關于miR-181b、miR-210、miR-126在HDP中的表達及與7種炎癥因子水平關系的研究報道較少。為此,本研究探究miR-181b、miR-210、miR-126在HDP中的表達及與炎癥反應的相關性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2018年1月至2019年12月承德市婦幼保健院收治的213例HDP單胎孕婦作為觀察組,以病情嚴重程度為依據將其設為妊娠期高血壓(GH組,62例)、輕度子癇前期(MP組,90例)及重度子癇前期(SP組,61例)3個亞組。納選標準：①與HDP相關診斷標準相符[7];②妊娠期產檢規律,資料齊全;③單胎妊娠;④知情同意。排除標準：①胎兒先天畸形的孕婦;②孕婦或胎兒有病毒感染;③妊娠前存在自身免疫性疾病、血液系統疾病、糖尿病或高血壓;④存在重要臟器嚴重病變。另選取同期同醫院收治的78名健康孕婦作為對照組。四組一般資料均衡可比(P>0.05),見表1。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

表1 四組一般資料比較

1.2方 法

1.2.1標本采集：所有受檢者清晨抽5mL空腹靜脈血,在常溫下放置30min后,經10min離心(3500r/min轉速,13.5cm離心半徑)后取上清液,置于-80℃冰箱待檢。

1.2.2miR-181b、miR-210、miR-126相對表達量檢測：實施實時熒光定量PCR法檢測,所用儀器為美國ABI公司生產的7500型熒光定量PCR儀,所用試劑盒及緩沖液、反轉錄酶、dNTPs購自美國Ambio公司。取1份待測上清液,在其中加入Trizol RNA 1mL進行總RNA提取,利用紫外分光光度計初步判斷總RNA純度,若在1.8～2.0間則提示純度較好。利用反轉錄試劑盒對總RNA進行反轉錄為cDNA,其中 miR-181b上游引物5'-AACATTCATTGCTGTCGGTGGG-3',下游引物5'-GCGAAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3';miR-210上游引物5'-CAATAACTGTGCGTGTGACAGC-3',下游引物5'-TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3';miR-126上游引物5'-TCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3',下游引物5'-CGCATI’ATI1ACTCACGGI1AC-3';內參基因U6上游引物5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',下游引物5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。反轉錄反應體系：5μL模板RNA,3μL miRNA特異性莖環引物及內參基因U6,0.15μL 100mmoL/LdNTPs,1μL 50U/μL反轉錄酶,1.5μL 10×反轉錄緩沖液,0.19μL 20U/μL RNase抑制劑,4.16μL無菌不含酶蒸餾水。將提取的cDNA保存于4℃冰箱中。qRT-PCR檢測：模板為cDNA,建立qRT-PCR反應體系20μL(10μL 2×TaqMan通用混合物溶液,1μL 20×引物及探針Mix,1.33μL cDNA模板,7.67μL無核酸酶蒸餾水)。反應條件為16℃ 30min;42℃ 30min;85℃ 5min。擴增條件為95℃ 10min 1個循環,95℃ 15s、60℃ 60s 45個循環。實驗重復3次后取平均值,miR-181b、miR-210、miR-126相對表達量運用2-△△Ct法進行計算,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(U6)。

1.2.3炎癥因子檢測：取1份待測上清液,血清白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)、白介素-17(Interleukin-17,IL-17) 、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1,MCP-1)及血管細胞黏附分子-1(vascular-cellular adhesion molecule-1,VCAM-1)水平實施酶聯免疫法測定,操作嚴格按試劑盒說明書要求開展。IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α檢測試劑盒購自上海科新生物技術股份有限公司,MCP-1、VCAM-1檢測試劑盒購自英國Abcam公司。

1.3統計分析：將數據錄入軟件SPSS25.0分析。符合正態分布的計量資料用描述,行獨立樣本t檢驗;多組間比較行單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;相關性分析采用Pearson相關分析;檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1兩組miR-181b、miR-210、miR-126 相對表達量及炎癥因子水平比較：觀察組miR-181b、miR-210 相對表達量及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均比對照組高(P<0.05);觀察組miR-126相對表達量及IL-10均比對照組低(P<0.05)。見表2。

表2 兩組miR-181b miR-210 miR-126 相對表達量及炎癥因子水平對比

2.2不同HDP亞組miR-181b、miR-210、miR-126 相對表達量及炎癥因子水平比較：GH組miR-181b、miR-210 相對表達量及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均比MP組及SP組低,且MP組比SP組低(P<0.05);GH組miR-126相對表達量及IL-10均比MP組及SP組高,且MP組比SP組高(P<0.05)。見表3。

表3 不同HDP亞組miR-181b miR-210 miR-126 相對表達量及炎癥因子水平對比

2.3HDP患者miR-181b、miR-210、miR-126 相對表達量與炎癥因子的相關性分析：Pearson相關性分析顯示,HDP患者miR-181b、miR-210相對表達量與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均呈正相關,與IL-10呈負相關(P<0.05); HDP患者miR-126 相對表達量與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均呈負相關,與IL-10呈正相關(P<0.05)。見表4、圖1。

圖1 HDP患者miR-181b、miR-210、miR-126 相對表達量與炎癥因子的相關性分析散點圖

表4 HDP患者miR-181b、miR-210、miR-126 相對表達量與炎癥因子的相關性分析

3 討 論

HDP主要發生于妊娠期女性,大部分患者病情多輕微,早期癥狀不顯著,少數患者可發生昏迷、抽搐等,危及母嬰生命安全[8]。HDP發病機制非常復雜,多數學者認為和血管內皮受損、免疫失衡等因素有關[9-10]。因此,探尋HDP發病機制,尋找有效監測指標對其預防、診斷及治療意義重大。

miR屬于內源性非編碼RNA,于真核生物中存在廣泛,可通過調節細胞基因表達對生物體生理活動進行干預。Hromadnikova等[11]指出,HDP發病可能和miR異常表達有關,miR對胎盤發育具有維持正常作用,可能成為HDP重要評估指標。miR-181b屬于miR,當機體出現血管內皮損傷或炎癥反應時其表達異常,可參與心血管疾病等發病過程。楊娜等[12]指出,miR-181b在HDP中呈高表達,可介導HDP發病過程。miR-210作為一種存在于人體11號染色體上的缺氧激活因子,當機體缺血缺氧時其呈高表達,可促使血管新生。Frazier等[13]報道,miR-210參與子癇前期發病過程,可通過介導機體炎癥反應促進病情進展。miR-126屬于與內皮細胞相關miR,對內皮祖細胞增殖分化具有促進作用,可使內皮細胞保持穩定,確保血管完整性。何曉焱等[14]指出,miR-126在HDP中表達下調,通過介導血管生成影響HDP發生發展。本研究中,觀察組miR-181b、miR-210 相對表達量比對照組高,miR-126相對表達量比對照組低,表明miR-181b、miR-210、miR-126參與HDP發病過程。

炎癥反應作為血管生成及損傷的重要調控因素,其與HDP發生發展存在一定關聯。IL-1β、IL-6、IL-17屬于促炎因子,其中IL-1β不僅對IL-6具有誘導作用,還能對血管內皮細胞及胎盤進行直接或間接作用,致使細胞損害;IL-6對Th1/Th2免疫平衡具有重要維持作用;IL-17由T細胞釋放而成,可利用對內皮細胞等誘導作用促使IL-6等細胞因子產生,進而參與炎癥反應。IL-10屬于抑炎因子,對IL-6等促炎因子具有抑制作用,可調節機體免疫功能。TNF-α屬于免疫調節因子,可參與機體炎癥反應,誘導促炎因子釋放。MCP-1屬于趨化因子CC家族,不僅可結合血中單核細胞,并促使其轉變為巨噬細胞,還可使血管內皮受損,降低一氧化氮功能,導致血管痙攣等。VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族,在細胞因子活化內皮細胞表面表達。當人體正常妊娠時,VCAM-1參與血管內皮與滋養細胞間黏附過程,有利于胎盤發育。本研究中,觀察組IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1比對照組高,IL-10比對照組低,表明炎癥反應參與HDP發病過程。

本研究中,GH組miR-181b、miR-210 相對表達量及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均比MP組及SP組低,且MP組比SP組低;GH組miR-126相對表達量及IL-10均比MP組及SP組高,且MP組比SP組高,說明HDP患者病情愈重,miR-181b、miR-210表達及促炎因子水平愈高,miR-126表達及抑炎因子水平愈低。本研究進一步行相關性分析,發現HDP患者miR-181b、miR-210相對表達量與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均呈正相關,與IL-10呈負相關; HDP患者miR-126 相對表達量與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1、VCAM-1均呈負相關,與IL-10呈正相關,表明miR-181b、miR-210、miR-126可能通過與機體炎癥反應相互作用而參與HDP發病過程。分析原因,HDP發病導致機體促炎因子大量釋放,炎癥反應被激活,血管內皮細胞受損,增加血管通透性,導致臟器缺血缺氧,加劇病情。miR-181b通過內皮細胞信號通路誘導促炎因子釋放,使機體炎癥反應加重,導致血管內皮受損,從而參與HDP發生過程。miR-210通過相應靶位將相應信號通路激活,引發機體氧化應激,致使機體免疫失衡,大量促炎因子釋放,而抑炎因子釋放受抑制,從而加劇機體炎癥反應,參與HDP發生過程。miR-126通過靶基因PI3KR2、SPRED抑制PI3K、MAPK信號通路,阻止血管生成,致使母胎界面血供不足,胎盤結構出現異常,一些細胞碎片被釋放而引起機體炎癥反應,最終導致HDP發病。

綜上所述,miR-181b、miR-210在HDP中呈高表達,miR-126在HDP中呈低表達,且三者與HDP炎癥反應密切相關。