腸道菌群代謝相關產物與6～9歲健康兒童骨骼肌質量的相關性分析

龍海旭, 詹紅艷, 陸 影, 李巧香, 唐美美, 陸軼鑫

(湖南中醫藥大學第二附屬醫院兒科, 湖南 長沙 410005)

兒童正處于生長發育的最快速階段,健康的骨骼生理有助于對抗骨骼疾病,降低成年后期骨折的風險[1]。骨骼健康與正常骨量密切相關,通常采用骨礦物質密度(Bone mineral density,BMD)評估兒童骨量[2]。BMD定義為礦物質含量與骨體積的比率(g/cm3),超過85%的峰值BMD是在18歲時積累,尤其是在青少年時期。調查顯示,兒童期峰值骨量增加10%將使骨質疏松癥的發病延遲13年,并使骨質疏松性骨折的風險降低50%[3]。因此,在成長過程中最大限度地保持骨骼健康可以防止衰老過程中的骨質疏松和骨折。新出現的證據表明,在包括骨質疏松癥在內的多種疾病中,腸道微生物群和微生物代謝物的組成發生了改變[4]。短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)作為主要腸道菌群代謝產物,其通過調節胰島素樣生長因子或改變骨免疫狀態來破壞骨形成和吸收之間的平衡,從而影響骨量變化[5-6]。然而,目前關于SCFAs對兒童骨量影響的研究有限。因此,本研究試圖探索6～9歲兒童腸糞便SCFAs與骨骼肌質量的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料：在2021年12月至2023年1月期間在本院進行這項橫斷面研究。總共有221名6～9歲兒童的父母或法定監護人提供了使用這些數據的知情同意書。排除標準：①在糞便樣本收集前3個月內使用抗生素;②雙胎和早產;③一般資料不全,糞便采集不全,或骨密度檢測不全。最后,共有176名具有核心數據的參與者(68名女孩和108名男孩)被納入本研究。本研究方案經本院倫理委員會批準同意。

1.2雙X射線吸收測定法(DXA)測量骨骼肌質量指標：使用Tanita MC-780A秤(日本Tanita Corporation公司)測量所有參與者的體重(精確到0.1 kg)。使用Discovery W系統(美國Hologic公司)測定全身(total body,TB)、除頭部外全身骨骼(total body less head,TBLH)、腰椎(lumbar spine,LS)和骨盆(pelvic,PELV)的骨礦物質含量(bone mineral content,BMC)和骨面積(bone area,BA)值。通過將BMC除以BA計算BMD。根據文獻推薦的TBLH骨密度參考值計算Z值[7]。納入研究的兒童被分層為Z值≥0的正常BMD(n = 120)和Z值< 0的低BMD(n = 56)。此外,通過全身DXA掃描評估全身脂肪量(total body fat mass,TBF)、四肢脂肪量(appendicular fat mass,AFM)、無脂肪量和骨量。全身瘦軟組織質量(total body lean soft tissue mass,TSM)計算為無脂肪質量減去骨質量(包括骨骼肌質量以及所有其他器官的質量)。四肢骨骼肌質量(Appendicular skeletal muscle mass,ASM)計算為手臂和腿部肌肉質量的總和,是全身骨骼肌質量的主要指標。

1.3SCFAs測量：參照文獻方法,使用高效液相色譜(HPLC)測定糞便中的短鏈脂肪酸濃度[8]。色譜條件包括一臺Agilent 1200 HEWLETT PACKARD(美國Agilent公司)HPLC機器;色譜柱為ZORBAX C18(250mm×6mm,美國Agilent公司);流動相由乙腈、甲醇和0.1%三氟乙酸組成(比例分別為3.3∶1.7∶94.9,在30min的時間間隔內該比率逐漸變為53.4∶28.5∶18.0,隨后逐漸變回初始比率,保持該比率直到每次樣品分析結束);柱溫保持在50℃;流速設定為1.1mL/min。測量波長為400nm。使用特定批次的研究樣本對混合糞便上清液樣本進行分析,以監控分析精度,計算出日內和日間重現性的變異系數分別為2.4%～9.8%和3.9%～11.4%,SCFAs的回收率為80%～120%。

1.4解釋變量收集：由調查員通過面對面訪談收集家庭收入、父母教育水平和分娩方式等數據。通過定量食物頻率問卷評估過去一年的膳食攝入量,和通過2009年中國食物成分表進行計算能量和纖維的膳食消耗[9]。

1.5統計分析：使用SPSS22.0進行所有統計分析。對于描述性統計,連續變量表示為平均值±標準差,分類變量表示為頻率(百分比)。通過卡方檢驗和t檢驗進行各組之間的差異分析。Spearman相關分析用于評估SCFAs與DXA骨量測量的相關性。使用多元線性回歸模型檢驗這些相關性是否獨立于潛在的協變量,包括年齡、性別、身高、分娩方式、家庭收入、父母教育、鈣和多種維生素補充劑的使用、總能量和纖維的膳食攝入量用于調整。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1參與者特征：按BMD分層的參與者的特征,見表1。正常BMD組和低BMD組兒童的年齡、性別、膳食能量、纖維攝入、分娩方式、家庭收入、父母學歷等指標差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

表1 受試者的基線特征

2.2參與者骨骼肌質量指標：與正常BMD組相比,低BMD組的TB BMD、TBLH BMD、LS BMD、PELV BMD、TSM/TBF、ASM/AFM均顯著降低(P<0.05),和TSM、ASM均顯著增加(P<0.05),見表2。

表2 參與者骨骼肌質量指標

2.3受試者的糞便SCFAs：受試者的糞便SCFAs分析結果見表3所示。與正常BMD組相比,低BMD組的糞便戊酸水平顯著增加(P<0.05),和乙酸、丁酸、總SCFAs水平顯著降低(P<0.05)。兩組其他SCFAs指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 受試者的糞便SCFAs

2.4Spearman相關分析糞便SCFAs與骨骼肌質量的關系：如圖1A所示,Spearman相關分析表明,PELV BMD與乙酸、丁酸和總SCFAs顯著正相關(r=0.19、0.24、0.17,P<0.05)。糞便樣本中的4-甲基戊酸與TB BMD、TBLH BMD、PELV BMD呈負相關(r=-0.25、-0.32、-0.29,P<0.01)。糞便樣本中的丁酸、乙酸和總SCFAs水平與TSM、ASM呈正相關(r = 0.16～0.21,P<0.05),與TSM/TBF、ASM/AFM呈負相關(r = -0.17～-0.25,P<0.05)。校正協變量和FDR校正后,多元回歸分析顯示TBLH BMD、PELV BMD與丁酸、戊酸和總SCFAs顯著正相關(β=0.15～0.23,P<0.05)(圖1B)。

圖1 糞便SCFAs與骨骼肌質量的spearman相關分析

3 討 論

這項橫斷面研究檢驗了健康兒童糞便SCFAs和骨量測量之間的關系。在控制了潛在的協變量和多重比較校正后,研究結果顯示,糞便中丁酸、戊酸和總SCFAs水平較高的兒童表現出較高TBLH BMD、PELV BMD。

SCFAs具有向遠處器官擴散和誘導有效骨調節作用的能力,表明SCFAs可能作為破骨細胞代謝和骨穩態的有效調節劑。例如,丙酸鹽和丁酸鹽在體外以劑量和時間依賴的方式抑制骨鈣素分化。一項大鼠模型研究顯示,除了喂食高膳食纖維飲食外,用SCFAs治療大鼠顯著增加了骨量,并防止了絕經后和炎癥誘導的骨丟失,在剛斷奶大鼠中,對SCFAs產生的膳食纖維干預將促進骨量顯著增加[10]。目前,較少有研究直接調查SCFAs和骨礦物質狀態之間的聯系。在我們的數據中,與正常BMD組相比,低BMD組的糞便戊酸水平顯著增加(P<0.05),和乙酸、丁酸、總SCFAs水平顯著降低(P<0.05)。直鏈SCFAs來源于復雜碳水化合物(如膳食纖維)的微生物發酵,而支鏈SCFAs(異丁酸、2-甲基丁酸、4-甲基戊酸和異戊酸)來源于支鏈氨基酸的代謝。然而,尚不清楚這兩種類型的SCFAs是否發揮不同的生理作用。現有的證據表明SCFAs像一把“雙刃劍”共同發揮作用。一方面,這些酸作為一種重要的能量來源,具有通過增強糖異生和脂肪生成來影響骨量增加的潛力,這與我們的結果一致。另一方面,據報道,短鏈脂肪酸有利于減肥[11]。因此,在得出準確的結論之前,需要開展更多的受控人類干預研究。

以前很少有研究調查SCFAs在肌肉質量中的作用。本研究中,TBLH BMD、PELV BMD與丁酸、戊酸和總SCFAs顯著正相關。根據我們的研究結果,大多數先前的成人橫斷面研究都報告了骨量降低個體的糞便中乙酸、丙酸和丁酸濃度高于骨量正常個體[12-13]。與成年人的這些發現一致,Chen等[14]觀察到,與肌肉質量正常的兒童相比,低肌肉質量兒童糞便中乙酸、丙酸和丁酸的濃度以及總SCFAs的濃度明顯較高。Houtman等[15]觀察到,乙酸、丙酸和丁酸的空腹循環濃度與全身脂肪、內臟脂肪和皮下脂肪的百分比呈正相關。在小鼠模型中,與未補充丁酸鹽的對照組相比,在喂食丁酸鹽10個月的老齡小鼠中觀察到肌肉質量/體重比增加。類似地,Lahiri等[16]觀察到骨骼肌萎縮的小鼠糞便中乙酸、丙酸和丁酸水平較未發生萎縮的小鼠降低。現有證據主要涉及乙酸、丙酸和丁酸,這些酸是一種重要的能量來源,有可能通過增強糖異生和脂肪生成來影響體脂。尚不清楚腸道微生物群/SCFAs是否可以通過沉積體脂來調節肌肉質量。

這項研究在兒童糞便樣本中探索了SCFAs與骨量的關系。然而,一些限制也值得考慮。①本研究橫截面數據的性質無法進行因果推斷。對于SCFAs與骨量聯系的潛在機制需要在體外和體內的進一步研究中探索。②本研究沒有對骨質疏松性骨折最常發生的髖部進行DXA檢查,但是從之前研究中獲得的數據表明,TB、LS和股骨頸的BMD之間有很強的相關性[17]。③本研究沒有對SCFAs數據進行跟蹤分析,未來的研究應該隨著時間的推移收集研究人群的糞便樣本,以評估縱向變化。④本研究沒有測量血液中的SCFAs濃度,這可能更好地代表SCFAs吸收。

總之,這項針對6～9歲健康兒童的研究結果表明,糞便丁酸、戊酸和總SCFAs與BMD呈正相關。未來的縱向研究將重復評估SCFAs的其他代謝標記(盲腸、血液、遺傳部分代謝物等)來驗證我們的發現。