miRNA-93-5p通過調控FBXW7基因參與宮頸癌進展

王 江

(四川省南充市中心醫院/川北醫學院附屬南充市中心醫院婦科, 四川 南充 637000)

宮頸癌是導致婦女在癌癥相關疾病中死亡的主要原因[1]。雖然近幾十年來在宮頸癌的管理取得了技術進展,但宮頸癌的死亡率仍然很高。目前,宮頸癌發生和發展的相關致病機制尚未完全闡明。探索宮頸癌發展的分子機制對于建立宮頸癌的新治療策略至關重要。微核糖核酸(miRNAs)可分為致癌miRNAs和抗癌miRNAs[2],惡性腫瘤的發生發展與腫瘤表達miRNAs的異常變化有關[3]。近年來,miRNAs的功能已成為近年來癌癥靶向治療研究的熱點。miRNA-93-5p已被發現廣泛參與結腸癌、胃癌、肝細胞癌等惡性腫瘤的進展,在癌細胞的的增殖、侵襲和遷移中發揮重要作用[4-5]。既往研究顯示,miR-93-5p可能是治療宮頸癌的潛在靶點[6]。FBXW7是一種重要的腫瘤抑制因子[7]。miRNAs可使癌癥細胞中的FBXW7功能失活[8]。研究發現,FBXW7在調控宮頸癌的侵襲性中發揮重要作用[9]。然而,關于miR-93-5p是否可通過調控FBXW7影響宮頸癌的進展,未見報道。本研究通過調控宮頸癌細胞miR-93-5p與FBXW7的表達水平,探究miR-93-5p是否可通過調控FBXW7影響宮頸癌細胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲水平,以期為臨床中治療宮頸癌提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器：FBXW7抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)、GAPDH抗體(美國Affinity生物技術公司)、細胞凋亡檢測試劑盒(賽默飛世爾科技公司)、Transwell小室(上海康寧有限公司)、結晶紫染色液(美國Sigma-Aldrich公司)、酶標儀、Attune CytPix 成像型流式細胞儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2實驗分組：收集20例臨床宮頸癌患者組織,分組為癌旁組織、宮頸癌組織,并檢測H8、Caski、HeLa、C33A,選擇宮頸癌細胞C33A。分為對照組(正常培養)、miRNA-93-5p抑制組(轉染低表達miRNA-93-5p),FBXW7激活組(轉染高表達FBXW7)。

1.3實驗方法

1.3.1RT-qPCR檢測miRNA-93-5p 、FBXW7 mRNA水平：提取鄰近正常宮頸組織、宮頸癌組織中及H8、Caski、HeLa、C33A細胞中總RNA量,逆轉錄miRNA-93-5p、FBXW7的RNA為cDNA。將miRNA-93-5p、FBXW7的cDNA擴增,內參為GAPDH。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.2轉染低表達miRNA-93-5p 、過表達FBXW7：將C33A宮頸癌細胞接種到6孔板內,培養至細胞到80%,參考轉染試劑(質粒,賽默飛世爾科技公司)說明書逐步操作將miRNA-93-5p、FBXW7分別轉染到C33A細胞中,構建出低表達miRNA-93-5p 細胞株、過表達FBXW7細胞株。

1.3.3流式細胞術檢測C33A細胞的凋亡率：收集各組C33A細胞制備成單細胞懸液,調整細胞濃度,離心后去掉上清再加入稀釋的一抗重懸細胞,冰上避光孵育1h,再加入對應的二抗溶液,冰上避光孵育30min,使用抗體稀釋液洗滌稀釋兩次,離心去除上清液后,加入抗體稀釋液重懸細胞,最后使用流式細胞儀檢測分析。

1.3.4平板克隆檢測C33A宮頸癌細胞增殖能力：將C33A宮頸癌細胞接種到6孔板中,干預結束后繼續培養細胞至克隆團數大于50個后,使用PBS清洗反復清洗,加入甲醛溶液將細胞固定,加入Giemsa溶液浸染克隆團,最后使用PBS清洗后,拍照分析。

1.3.5細胞劃痕實驗檢測C33A宮頸癌細胞遷移能力：將C33A宮頸癌細胞接種到6孔板,培養細胞至85%左右,使用滅菌后的槍頭在各孔正中央垂直劃一條直線使用無血清的培養基繼續培養,分別在0h和24h時將各孔用PBS清洗后在顯微鏡下拍照觀察,使用ImageJ軟件測量遷移距離。

1.3.6Trallswell檢測C33A細胞侵襲能力：將200 μL無血清培養基加入(5×104個細胞)Transwell室上腔中的細胞進行培養,下腔中的細胞加入完全培養基,培養24h,使用4%的多聚甲醛細胞固定10min,去除固定液,加入結晶紫染色25min,使用PBS清洗3次后直接在倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3.7Western blotting 檢測C33A細胞中FBXW7蛋白表達水平：收集各組C33A細胞并提取總蛋白,將各組蛋白濃度使用BCA試劑盒檢測盒,配置合適的體系,高溫將蛋白變性處理,置于-20℃備用。提前配置合適濃度的凝膠塊,將樣品加入對應的孔道中電泳一定時間,結束后將凝膠進行轉膜、封閉,孵育一抗FBXW7(1∶1000),對應的二抗,每個步驟的間隙將條帶浸入PBST溶液中清洗30min,使用發光液進行曝光,最后使用ImageJ軟件分析。

2 結 果

2.1miRNA-93-5p、FBXW7在宮頸癌組織、細胞中的表達：與癌旁組織相比,宮頸癌組織中miRNA-93-5p mRNA水平顯著增加、FBXW7 mRNA水平顯著減少(圖1A-B,F=173.65,P<0.001)。與H8相比,Caski(F=8.65,P<0.05)、HeLa(F=9.21,P<0.05)、C33A(F=82.41,P<0.01)細胞中miRNA-93-5p mRNA水平增加、FBXW7 mRNA水平減少(圖1C-D)。

圖1 miRNA-93-5p、FBXW7在宮頸癌組織、細胞中的mRNA水平

2.2抑制miRNA-93-5p對宮頸癌細胞凋亡、增殖、遷移、侵襲的影響：與對照組相比,miRNA-93-5p抑制組miRNA-93-5p mRNA水平顯著降低(圖2A,F=164.82,P<0.001),C33A宮頸癌細胞的細胞凋亡率增加(圖2B,F=192.01,P<0.001),C33A細胞的克隆能力下降(圖2C,F=74.02,P<0.01),C33A細胞遷移距離減少(圖2D,F=82.75,P<0.01),C33A細胞侵襲能力下降(圖2E,F=67.25,P<0.01)。

圖2 C33A細胞中的miRNA-93-5p mRNA水平及細胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲能力

A.RT-qPCR檢測細胞中miRNA-93-5p mRNA水平;B.流式細胞術檢測細胞凋亡率;C.平板克隆檢測細胞增殖能力;D.劃痕實驗檢測細胞遷移能力;E.Trallswell檢測細胞侵襲能力;與對照組比較,**P<0.01、***P<0.001。

圖4 C33A細胞中的FBXW7 mRNA水平及細胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲能力

A.Western blotting檢測細胞中FBXW7蛋白水平;B.RT-qPCR檢測細胞中FBXW7 mRNA水平。與對照組比較,**P<0.01。

2.3miRNA-93-5p調控宮頸癌細胞中FBXW7的表達：與對照組相比,miRNA-93-5p抑制組FBXW7蛋白(F=65.81,P<0.01)、mRNA(F=69.24,P<0.01)水平顯著增加(圖3A-B)。

2.4過表達FBXW7對宮頸癌細胞凋亡、增殖、遷移、侵襲的影響：與對照組相比,FBXW7激活組FBXW7 mRNA水平顯著增加(圖4A,F=72.11,P<0.01),C33A細胞凋亡率增加(圖4B,F=187.31,P<0.001),克隆能力下降(圖4C,F=172.60,P<0.001),遷移距離減少(圖4D,F=80.25,P<0.01),侵襲能力下降(圖4E,F=65.72,P<0.01)。

3 討 論

宮頸癌是一種子宮頸上皮性惡性腫瘤,是最常見的婦科惡性腫瘤之一[10]。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發作的主要原因[11]。研究顯示,HPV感染后致癌性相關的基因組改變是癌癥進展的關鍵步驟。因此,對致癌基因以及抑癌基因的研究尤為重要。據統計,全球每年約有50萬患者患有宮頸癌,這些病例大多數發生在發展中國家,且每年約有27萬人死于宮頸癌。早期宮頸癌患者經標準化治療后,5年生存率為80～90%。然而,伴有淋巴結轉移的宮頸癌患者的5年生存率低于50%[12]。因此,深入研究宮頸癌的可能有效治療策略至關重要。

隨著對各種腫瘤中miRNAs的深入研究,發現miRNAs的表達譜可以作為多種腫瘤的重要分子生物標志物和治療靶點。目前,所有關于miRNAs的研究都集中在篩選腫瘤組織和正常組織(或癌旁組織)之間具有差異表達的miRNAs的表達譜上。研究學者們認為,下調的miRNAs的功能與抑制基因相似,表現出抗癌作用,上調的miRNAs的功能與致癌基因相似,顯示出致癌作用。近年來,miRNAs的功能已成為癌癥靶向治療的研究熱點。miRNA-93-5p在多種癌組織中高表達,具有致癌作用,且在癌細胞的的增殖、侵襲和遷移中發揮重要作用。值得關注的是,已有研究顯示,miR-93-5p可能是治療宮頸癌的潛在靶點。FBXW7是一種重要的腫瘤抑制因子。miRNAs可使癌癥細胞中的FBXW7功能失活。既往研究顯示,FBXW7在調控宮頸癌的侵襲性中發揮重要作用。然而,關于miR-93-5p是否可通過調控FBXW7影響宮頸癌的進展,未見報道。本研究初步在宮頸癌組織及癌旁組織中檢測發現,宮頸癌組織中miR-93-5p mRNA水平顯著增加,FBXW7 mRNA水平顯著減少。通過選擇不同的宮頸癌細胞系進行檢測,也得出同樣的結果,其中C33A宮頸癌細胞中二者變化最為顯著,因此我們選擇該細胞系進行后續研究。為了驗證miR-93-5p是否可通過調控FBXW7 影響宮頸癌的生物學行為,我們將miR-93-5p低表達后發現,宮頸癌細胞中FBXW7的低水平改善,且宮頸癌細胞的凋亡率增加,增殖、遷移、侵襲能力下降。進一步高表達FBXW7也得出同樣的結果。

綜上所述,宮頸癌組織中miR-93-5p高表達,FBXW7低表達,低表達miR-93-5p可上調FBXW7水平,阻礙宮頸癌的發病進展,將宮頸癌細胞中FBXW7高表達,結果與低表達miR-93-5p對宮頸癌細胞的影響保持一致。本研究初步初步闡明miRNA-93-5p可通過調控FBXW7基因影響宮頸癌細胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲水平,將為臨床中宮頸癌的治療提供新思路。