Si-SETDB1通過SPG20甲基化對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響

趙寶山, 楊 陽, 孫光蕊, 鄭競(jìng)雄, 梁宗英

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科, 河北 承 德 067000 2.河北省胸科醫(yī)院臨床藥理試驗(yàn)部, 河北 石家莊 050000)

肺腺癌是肺癌中最多見的病理分型,且發(fā)病率逐年增多[1]。傳統(tǒng)肺腺癌治療以手術(shù)和術(shù)后放化療為主,隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,現(xiàn)代精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的分子靶向治療和免疫治療作為治療肺腺癌的新方法,已取得巨大進(jìn)展[2]。痙攣性截癱-20(SPG20)是近年來發(fā)現(xiàn)的最新的與多種癌癥相關(guān)的基因,其甲基化修飾與多種實(shí)體腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。SET結(jié)構(gòu)域分支型1(SET domain bifurcated1,SETDBl)是組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶家族中重要一員,其功能可以催化多種基因發(fā)生甲基化抑制基因的表達(dá),與多種腫瘤密切相關(guān)[4]。國(guó)內(nèi)外針對(duì)SETDB1和SPG20在肺腺癌發(fā)病中的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道,鑒于此,本文旨在通過檢測(cè)肺腺癌組織細(xì)胞中SETDB1表達(dá)和SPG20甲基化水平,探究下調(diào)SETDB1對(duì)SPG20甲基化及A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料：2020年1月至2021年1月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除原發(fā)肺腺癌患者60例,其中男性16例,女性44例;≥60歲22例,<60歲38例;Ⅰ期26例,Ⅱ期16例,Ⅲ期18例;低分化8例、中分化38例,高分化14例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。取患者癌組織及同一患者正常肺組織作為研究對(duì)象。

1.2主要試劑：甲基化試劑盒購(gòu)于上海晶抗生物工程有限公司;焦磷酸測(cè)序試劑盒購(gòu)于北京閱微基因技術(shù)股份有限公司;DNA提取試劑盒購(gòu)于廣州皓寶生物科技有限公司;免疫組化試劑盒購(gòu)于廣州露生科技有限公司;SETDB1、SPG20單克隆抗體購(gòu)CST公司。A549細(xì)胞系購(gòu)于廣州皓寶生物科技有限公司。

1.3方 法

1.3.1qRT-qPCR方法：提取RNA,分光光度計(jì)定量;應(yīng)用Prime ScriptTM RT Reagent kit反轉(zhuǎn)錄;應(yīng)用SYBR Green qPCR Master熒光定量試劑盒檢測(cè)mRNA的表達(dá);相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt計(jì)算。

1.3.2免疫組化(SP法)：組織切片二甲苯及梯度酒精脫蠟;3%H2O2浸泡去內(nèi)源性的過氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次,加入檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原;載玻片冷卻至室溫后PBS洗2次,加入血清非免疫山羊血清封閉,加入一抗孵育;PBS處理后,加入二抗孵育;DAB顯色,蘇木精染色;中性樹膠封片固定。

1.3.3免疫印跡實(shí)驗(yàn)：提取蛋白,制備電泳蛋白上樣液,進(jìn)行凝膠電泳。電泳后90V 60～80min轉(zhuǎn)膜。重復(fù)洗膜。孵育一抗(SPG20抗體1∶2000;SETDB1抗體1∶2000;GAPDH抗體1∶1000),4℃過夜。次日孵育二抗,重復(fù)洗膜。暗室發(fā)光顯像。

1.3.4焦磷酸測(cè)序法：DNA提取試劑盒提取總DNA,采用ED DNA Methylation-Gold kit進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。SPG20甲基化擴(kuò)增正向引物序列為5'-AGGAAGTATGAAAGAATGTATTGTAAAG-3',反向引物為5'-CCCCTCAAAATTAAACAACCTTTCTCTACA-3'。產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序,PyroQ-CpG軟件分析甲基化狀態(tài)。

1.3.5細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組：實(shí)驗(yàn)組：SETDB1 siRNA組(si-S)、陰性對(duì)照組：SETDB1 陰性siRNA組(si-N)、空白對(duì)照組：未處理A549細(xì)胞組(NC)。應(yīng)用10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。稀釋SETDB1 siRNA或陰性對(duì)照siRNA于Lipofectamine 3000溶液中,按試劑盒說明書操作,采用siRNA/lipofectamine混合溶液各自培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM液中轉(zhuǎn)染。

1.3.6MTT實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后將各組細(xì)胞以1×103個(gè)/孔接種于96孔板。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,2h、12h、24h、36h、48h觀察細(xì)胞狀態(tài),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)拿出一塊板,每孔加入噻唑藍(lán)溶液30μL,室溫孵育4h后,加入150μL DMSO,80r/min搖勻。酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處OD值。

1.3.7劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后接種于24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿孔底。無菌移液槍頭劃痕,PBS緩沖液洗去脫落細(xì)胞并拍照; 常規(guī)培養(yǎng),48h后再次拍照并計(jì)算遷移距離。細(xì)胞遷移距離=0h初始劃痕寬度-48h后劃痕寬度。

1.3.8侵襲實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用基底膜基質(zhì)膠將上室包被24h,于上室接種各組細(xì)胞混懸液,下室加DMEM培養(yǎng)基。孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48h后棄培養(yǎng)基,棉簽擦去上室未穿膜細(xì)胞,4%多聚甲醛固定下層細(xì)胞,應(yīng)用結(jié)晶紫染色,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。

1.4統(tǒng)計(jì)分析：SPSS21.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用率表示,χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析,相關(guān)性分析采用Pearson法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1組織中SETDB1和SPG20 mRNA表達(dá)量：qRT-PCR結(jié)果顯示,SETDB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為(1.62±0.11),高于正常肺組織的(0.30± 0.04)(t=3.232,P<0.05);SPG20 mRNA相對(duì)表達(dá)量在癌組織中為(0.27±0.05),低于正常肺組織的(1.40±0.09)(t=2.768,P<0.05)。見圖1。

圖1 癌組織和正常肺組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2組織中SETDB1和SPG20蛋白表達(dá)(SP法)：免疫組化結(jié)果顯示,SETDB1在癌組織中呈高表達(dá),陽性表達(dá)率為81.67%,高于正常肺組織的26.67%(P<0.05);SPG20在癌組織中陽性表達(dá)率為28.33%,低于正常肺組織中的61.67%(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 SETDB1和SPG20在組織中的表達(dá)差異

圖2 癌組織和正常肺組織中蛋白的表達(dá)比較

(SP-HE ×40)A：SETDB1在癌組中高表達(dá); B：SETDB1在正常肺組織中呈低表達(dá);C：SPG20在癌組中呈低表達(dá);D：SPG20在正常肺組織中呈高表達(dá)

2.3組織中SETDB1和SPG20蛋白表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示,SETDB1在癌組織中表達(dá)量為(84.16±3.41)%,高于正常肺組織的(34.76±2.37)%(t=4.425,P<0.05);SPG20在癌組織中表達(dá)量為(16.37±2.04)%,低于正常肺組織的(62.64±1.41)%(t=3.742,P<0.05)。見圖3,4。

圖3 SETDB1在癌組織和正常肺組織中的表達(dá)量

2.4組織中SPG20甲基化水平：焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)顯示,癌組織中SPG20甲基化率為(64.75±4.21)%,高于正常肺組織的(15.36±2.57)%(t=2.354,P<0.05)。見圖5。

圖5 組織中SPG20甲基化水平差異

2.5癌組織中SETDB1蛋白和SPG20甲基化的相關(guān)性：癌組織中SETDB1蛋白表達(dá)和SPG20甲基化水平具正相關(guān),其相關(guān)系數(shù)r=0.642 (P<0.05);見表2。

表2 癌組織中SETDB1蛋白與SPG20甲基化水平的相關(guān)性(n)

2.6癌組織中SETDB1蛋白和SPG20甲基化與臨床病例特征的相關(guān)性：統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,SETDB1蛋白陽性表達(dá)和SPG20甲基化與TNM分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05);與性別和年齡無關(guān)(P>0.05)。見表3。

2.7細(xì)胞系中SETDB1和SPG20的蛋白表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示,SETDB1在A549細(xì)胞中呈高表達(dá),而SPG20呈低表達(dá)(t=2.562,P<0.05);正常支氣管上皮細(xì)胞中SETDB1呈低表達(dá),SPG20則呈高表達(dá)(t=5.143,P<0.05)。見圖6。

2.8siRNA干擾SETDB1效果驗(yàn)證：轉(zhuǎn)染成功后,細(xì)胞內(nèi)可見較強(qiáng)的綠色熒光(圖7)。qRT-PCR結(jié)果顯示,si-S組SETDB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為(0.35±0.04),顯著低于si-N和NC組[(1.27±0.13)和(1.31±0.14)](F=26.4,P<0.05,表4,圖8)。si-S組SETDB1蛋白表達(dá)量顯著低于si-N和NC組(P<0.05),見圖9。

圖7 RNA干擾SETDB1轉(zhuǎn)染熒光效果

圖8 RNA干擾后各組SETDB1 mRNA相對(duì)表

圖9 RNA干擾后各組SETDB1蛋白表達(dá)量

2.9下調(diào)SETDB1對(duì)SPG20甲基化和蛋白表達(dá)的影響 RNA干擾下調(diào)SETDB1后,si-S組SPG20甲基化水平顯著下降(F=29.5,P<0.05),而si-N和NC組甲基化水平無差異(P>0.05);見表5。si-S組SPG20蛋白表達(dá)量升高,顯著高于si-N組及NC組(P<0.05)。見圖10。

表5 下調(diào)SETDB1后各組SPG20甲基化率差異(%)

圖10 下調(diào)SETDB1后各組SPG20蛋白表達(dá)量

2.10下調(diào)SETDB1對(duì)肺腺癌細(xì)胞功能的影響 MTT結(jié)果顯示,在12h、24h、36h和72h時(shí)間點(diǎn),si-S組細(xì)胞570nm吸光度值均小于si-N組和NC組,細(xì)胞存活能力下降(P<0.05);而si-N組和NC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表6,圖11.A;劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與si-N組和NC組遷移距離相比,si-S組細(xì)胞遷移距離短(P<0.05);見表7,圖11.B;侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與si-N組和NC組相比,si-S組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05);見表8、圖11。

表6 下調(diào)SETDB1后各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值

表7 下調(diào)SETDB1后48h后各組細(xì)胞遷移距離(μm)

表8 下調(diào)SETDB1后48h后各組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)

圖11 下調(diào)SETDB1對(duì)肺腺癌細(xì)胞存活能力、遷移和侵襲能力的影響

3 討 論

早期肺腺癌多無癥狀,部分患者確診時(shí)已是進(jìn)展期,從而導(dǎo)致其總體預(yù)后不佳[5]。因此,如何提高肺癌患者總體生存率,改善其預(yù)后具有十分重要的臨床意義。

SPG20基因也被稱為SPART,最初的研究表明其參與了Troyer綜合征。然而最新研究表明,SPG20參與了腫瘤組織內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子受體的運(yùn)輸和線粒體的能量代謝過程。研究證實(shí),SPG20在胃癌中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài),這可能與胃癌組織中SPG20高甲基化相關(guān)[6]。SPG20在結(jié)直腸癌和肝癌中低表達(dá),且其高甲基化修飾狀態(tài)作為早期事件已經(jīng)被證實(shí)[7]。課題組前期通過免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí),SPG20在肺腺癌組織中內(nèi)呈低表達(dá),這與SPG20在胃癌、結(jié)腸癌等消化道腫瘤研究中的低表達(dá)狀態(tài)一致[8]。本研究通過免疫組化和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺腺癌組織標(biāo)本,結(jié)果顯示SPG20在癌組織中呈低表達(dá),而正常肺組織則呈高表達(dá),差異顯著。通過基因甲基化分析,結(jié)果表明肺腺癌組織中SPG20基因呈高甲基化。統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示,SPG20高甲基化與肺腺癌TNM分期、分化程度以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性;SPG20的陽性表達(dá)隨著癌組織TNM分期、組織程度分化的增加而逐漸降低,且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)明顯降低。這說明SPG20在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過程可能起到“抑癌基因”作用,其低表達(dá)狀態(tài)減弱抑癌作用,進(jìn)而促進(jìn)了肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

甲基化修飾需要甲基轉(zhuǎn)移酶的參與,甲基化轉(zhuǎn)移酶在甲基化修飾過程中的作用至關(guān)重要。多項(xiàng)研究表明,甲基轉(zhuǎn)移酶參與了多種腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。SETDB1是甲基轉(zhuǎn)移酶家族中重要一員,參與了腫瘤中多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和沉默。SETDB1具有調(diào)控胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、調(diào)節(jié)小鼠軟骨發(fā)育等多種生物學(xué)功能。近年來的研究發(fā)現(xiàn),SETDB1在人體的多種癌癥如結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌等中均表達(dá)上調(diào),與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)[10-11]。本研究通過免疫組化及蛋白免疫印跡檢測(cè)肺腺癌中SETDB1水平,結(jié)果顯示,SETDB1在癌組織中呈陽性表達(dá),與正常肺組織之間存在顯著差異。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,SETDB1的表達(dá)水平與肺腺癌TNM分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān);SETDB1的陽性表達(dá)隨著肺腺癌TNM分期、癌組織分化程度的增加而增加,且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)明顯增加,明顯起到了“促癌”的作用。這與國(guó)外研究在非小細(xì)胞肺癌癌組織中SETDB1高表達(dá)狀態(tài),與肺癌之間具有強(qiáng)相關(guān)性的研究結(jié)果一致。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn),SPG20在肺腺癌組織中的低表達(dá)與其發(fā)生甲基化密切相關(guān)。研究證實(shí),SETDB1作為甲基轉(zhuǎn)移酶可以催化多種基因發(fā)生甲基化。在肺腺癌中SETDB1作為甲基轉(zhuǎn)移酶與SPG20的甲基化修飾是否相關(guān),及二者在肺腺癌中的相關(guān)性及相互作用機(jī)制鮮有研究。本研究對(duì)SPG20甲基化和SETDB1在癌組織中的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,肺腺癌組織中SETDB1高表達(dá)而SPG20甲基化呈高水平,二者呈正相關(guān)。進(jìn)一步檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞系中SETDB1和SPG20蛋白的表達(dá),結(jié)果證實(shí),肺腺癌細(xì)胞系中SETDB1在肺腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá),而SPG20呈低表達(dá);正常支氣管上皮細(xì)胞中SETDB1呈低表達(dá),SPG20則呈高表達(dá),這與肺腺癌組織中檢測(cè)結(jié)果一致。進(jìn)一步通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1與SPG20甲基化的相關(guān)性,結(jié)果顯示,RNA干擾下調(diào)SETDB1后SPG20基因甲基化率明顯降低,SPG20蛋白表達(dá)均明顯上升。結(jié)合SPG20甲基化和SETDB1二者相關(guān)性結(jié)果,筆者推測(cè)在肺腺癌中SETDB1作為甲基轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)了SPG20的甲基化,進(jìn)而抑制了SPG20的表達(dá),使得肺腺癌的惡性程度增加。今后研究中可以將SETDB1及SPG20甲基化作為切入點(diǎn),深入研究二者具體致癌機(jī)制,為肺腺癌的基因靶向治療提供新的理論依據(jù)。

綜上所述,SPG20甲基化和SETDB1與肺腺癌的分期、分化程度及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),且二者呈正相關(guān)性,二者可能協(xié)同作用促進(jìn)了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展,在肺腺癌診治中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。