基于 γ-干擾素釋放試驗的麻風分枝桿菌感染篩查診斷

李艷艷 王 川 孫樂樂 潘 晴 王 娜 周桂芝 劉 紅 張福仁

1山東第一醫科大學附屬皮膚病醫院,山東濟南,250022;2山東省皮膚病性病防治研究所,山東濟南,250022

麻風是一種由麻風分枝桿菌感染易感人群導致的慢性肉芽腫性疾病,主要侵犯皮膚和周圍神經,嚴重者可通過血液或淋巴系統播散[1］。根據機體對麻風菌免疫反應的強弱,麻風可大致分為五個類型,LL型：特異性Th1型細胞免疫弱或缺失,細菌指數高;TT型：特異性Th1型細胞免疫強,高IFN-γ分泌,低細菌指數;BT、BL、BB型為免疫不穩定型。根據皮損數目可將患者分為皮損少于5個的少菌型(PB,包括TT和BT型)和多于5個的多菌型(MB,包括LL、BL和BB型)。麻風仍是我國和WHO傳染病防控的重點,對麻風患者進行早期篩查已成為防治麻風、消除麻風危害的重要手段[2］。

某些分枝桿菌在生長早中期分泌到胞外的一些蛋白,具有高度免疫原性和特異性,常作為分枝桿菌感染診斷和預防研究的重要靶抗原。6 kD早期分泌抗原(ESAT-6)和早期濾液蛋白-10(CFP-10)是來源于結核分枝桿菌的分泌蛋白,其能誘發特異性Th1應答,與細菌的毒力密切相關,可提供抗結核桿菌感染的保護性[3］。基于ESAT-6/CFP-10建立的兩種商業化的檢測技術T-SPOT.TB和QuantiFERON-Gold已在臨床上廣泛應用,通過γ-干擾素釋放試驗(Interferon-γ release assay,IGRA)對結核感染者進行有效診斷,且不受BCG預防接種的影響[4］。研究發現結核分枝桿菌ESAT-6和CFP-10與麻風分枝桿菌同源物之間有一定的同源性[5,6］。將結核分枝桿菌ESAT-6/CFP-10作為刺激性抗原,在麻風患者外周血及其單個核細胞(PBMCs)中進行檢測,發現麻風桿菌來源的兩種蛋白與結核分枝桿菌同源物之間存在完全免疫交叉反應。目前該研究缺乏多樣本的數據支持,其性能還有待評估。

1 材料與方法

1.1 患者招募與病理組織樣本的收集 對2019年1月至2022年10月期間在山東第一醫科大學附屬皮膚病醫院(山東省皮膚病與性病防治研究所)診斷為麻風的病例進行篩選納入,共獲得29份臨床標本(包括血液和皮損組織),所有患者均根據病史、臨床表現、皮膚涂片和組織學檢查確定診斷,并對每例患者進行嚴格的Ridley-Jopling(R-J)分級(LL、BL、BB、BT和TT)(Kundu, 1979)。20份健康獻血者的血液樣本作為本研究的對照。所有患者均按照WHO指南進行聯合化療方案(MDT)的治療。

1.2 酶聯免疫斑點法檢測抗原刺激后釋放IFN-γ的效應T細胞 采用I-SPOT-TB試劑盒進行檢測。將PBMCs解凍、洗滌并在培養箱(37℃, 5% CO2)中孵育過夜。將96孔微孔板上依次設置空白對照組、PHA對照組和測定組,培養液中分別加入50 μL AIM-V、50 μL PHA和50 μL抗原試劑,設置3個復孔。每孔加入100 μL含3.0×106cells/mL的PBMCs,置于恒溫培養箱(37℃, 5%CO2)中孵育16～20 h。洗板后,加入標記抗體,于2℃～8℃孵育60 min。重復洗板操作,加入50 μL顯色底物溶液,暗室室溫下反應7 min,加入去離子水終止反應,使用放大鏡進行斑點計數。

1.3 qPCR方法 qPCR引物由NCBI網站設計,并在UCSC數據庫(http：//genome.ucsc.edu/)中進行驗證。在實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher, USA)上使用Taqman探針方法完成qPCR反應。總反應體系為20 μL,包括引物探針混合物、去離子水、正反向引物和DNA。qPCR擴增條件：50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,進行40個循環。完成40個循環擴增后,對擴增結果進行分析：(1)Ct值≥37為陰性;(2)Ct值<37判定為陽性。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 9軟件(GraphPad Software Inc, CA, SanDiego, USA)進行統計學分析。組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。所有檢驗均為雙側,P<0.05認為差異有統計學意義。

1.5 倫理聲明 本研究經山東省皮膚病性病防治研究所審查和倫理委員會批準。在采集血液和組織之前獲得了所有患者和健康志愿者的知情同意。

2 結果

2.1 MB和PB患者IFN-γ激活程度的比較分析 使用結核分枝桿菌的重組蛋白rESAT6-CFP10作為刺激性抗原,在29例麻風患者和20名正常對照的PBMCs中應用酶聯免疫斑點法(ELISPOT)檢測釋放IFN-γ的效應T細胞頻數(圖1a)。MB和PB患者IFN-γ的激活程度無統計學差異(圖1b)。根據實驗情況,包括1例麻風患者和2例正常對照存在高IFN-γ分泌情況,1例麻風患者細胞失活,故從本研究中剔除。

N：空白對照孔;P：植物血凝素孔;T：測試培養孔IGRA檢測患者PBMCs中IFN-γ的激活程度

MB和PB患者IGRA陽性率的比較分析 根據試劑盒給定的陽性標準,確定各組的陽性患者,16例MB患者中6例陽性,IGRA的檢出率為 37.5%;11例PB患者中5例陽性,檢出率為45.45%。比較兩組IGRA陽性率,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 27例麻風患者的IGRA檢測結果

IGRA聯合qPCR對PB患者的診斷價值 12例MB患者進行了qPCR檢測,陽性率為100%。8例PB患者進行了qPCR檢測,陽性率為25%。聯合IGRA結果進行分析,37.5%(3/8)的PB患者qPCR陰性,IGRA陽性;12.5%(1/8)的PB患者IGRA陰性,qPCR陽性;IGRA陽性或qPCR陽性患者達75%(6/8)。見表2。兩種篩查方法的結合可能有利于臨床表現不典型的PB患者的診斷。

表2 IGRA與qPCR在27例麻風患者中診斷效能的比較分析 例(%)

3 討論

麻風是由麻風分枝桿菌引起的一種慢性傳染病,主要影響皮膚和周圍神經。雖然聯合化療藥物治療降低了全球麻風的患病率,但麻風仍然是一個公共衛生問題[7］。該病的診斷主要依靠臨床表現和組織病理學檢查。然而,由于麻風的臨床特征和組織病理學復雜,且PB患者以單純神經瘤和少數皮膚病變為主,涂片較難檢出麻風分枝桿菌,使得該類患者的診斷和鑒別診斷具有挑戰性,尤其在發病早期[8］。因此,有必要采用更靈敏、可靠、準確的方法來診斷PB病例。研究證實,麻風分枝桿菌抗原刺激誘導的IFN-γ分泌在PB患者中獲得了比MB患者更高的陽性反應率[9］。多項研究評估了麻風分枝桿菌不同抗原組合的檢測價值,如麻風分枝桿菌重組蛋白(rML),包括46f+LID-1、ML0276+LID-1、ML2055+ML1632+ML2044、ML0276+46f、ML2055+LID-1等[10］,通過測定感染患者外周血上清液中IFN-γ水平來探索以重組蛋白為刺激性抗原的免疫應答,但這種方法識別PB患者的潛力有限[11］。

既往研究中,基于結核分枝桿菌ESAT-6、CFP-10蛋白和麻風分枝桿菌同源物之間的同源性關系,以結核分枝桿菌rESAT6-CFP10蛋白為刺激性抗原進行全血的IGRA試驗中,50%(5/10)的PB患者呈陽性,40例MB患者均為陰性[12］。在麻風患者PBMCs中進行的研究同樣證實了麻風桿菌的兩種蛋白與結核桿菌同源物之間存在免疫交叉反應。以CFP-10為刺激抗原,在3例麻風患者中特異性T細胞斑點數為36(164)、42(76)、54(280)[13］;以ESAT-6為刺激抗原,在4例麻風患者中斑點數為88(164)、68(76)、220(280)、252(184)[5］。

為進一步評價IGRA的診斷價值,補充麻風的篩查手段,我們開展了該研究。本研究發現使用結核分枝桿菌rESAT6-CFP10刺激麻風患者的PBMCs后,MB患者的檢出率為37.5%(6/16),PB患者的檢出率為45.45%(5/11),結果大致符合該蛋白在結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌間的同源性關系。PB患者的IFN-γ激活程度及陽性率略高于MB患者,但差異無統計學意義。MB患者常存在免疫功能低下,細胞免疫反應弱,表現為IFN-γ分泌水平低,皮膚涂片中麻風桿菌數量多,即IGRA敏感性低的原因。在結核患者中也發現,免疫功能正常的患者相比免疫功能低下者對IGRA檢測的敏感性更高。由于實驗操作方法及人為因素的異質性,MB患者的IFN-γ水平在各項研究中不全一致,與其他研究相比,本研究中的數據(陽性率37.5%)偏高,不排除受實驗操作因素及樣本量的影響。

分子檢測,如qPCR,已被證明是診斷PB麻風的強大診斷工具,該技術靈敏度高,對于鏡檢陰性患者的早期診斷或組織病理學不確定病變的鑒別診斷非常重要。在皮膚活檢中,80%以上的MB患者和30%～40% PB患者的皮膚組織樣本能檢出麻風桿菌DNA。在一系列可能的基因靶點中,麻風桿菌特異元件RLEP、16srRNA、folP、gyrA和rpoB被確定為最適合用于診斷[14］,結合這些基因開發麻風桿菌試驗可以加強早期麻風病例的診斷。本研究以RLEP為靶基因進行皮損組織的qPCR檢測,MB患者中的陽性率為100%(12/12),PB患者中為25%(2/8)。MB患者中,皮損組織qPCR的陽性率明顯高于血液IGRA的陽性率;PB患者的qPCR陽性率則低于血液IGRA。將qPCR與IGRA聯合分析發現,37.5%(3/8)的PB患者qPCR陰性,IGRA陽性;12.5%(1/8)的PB患者IGRA陰性,qPCR陽性;IGRA陽性或qPCR陽性的PB患者達75%(6/8),兩種檢測手段在一定程度上能夠相互補充,可能是早期發現PB患者的有效聯合檢測手段。

綜合既往研究和本研究的結果,可認為IGRA在PB患者中的敏感性尚可,在MB患者中異質性較大。特異性不高,使用該方法不能將麻風與結核分枝桿菌等基因組攜帶RD-1區的分枝桿菌引起的疾病相鑒別。針對麻風分枝桿菌特異性抗原的IGRA能提高該檢測的特異性,更好地將麻風與其他分枝桿菌疾病鑒別開來。

綜上,本研究發現IGRA對麻風分枝桿菌感染的診斷價值值得商榷,但為該感染的診斷提供了思路,陽性結果提示麻風桿菌感染的可能性,具體應結合患者臨床表現、接觸史或其他實驗室檢查進行綜合診斷。IGRA聯合qPCR可能是早期發現和篩查麻風桿菌的輔助檢測方法。基于γ-干擾素釋放試驗的應用,IFN-γ在預測早期麻風、結節性紅斑反應和監測治療反應中的價值有待進一步研究。此外,本研究的樣本量較小,可能會造成一定的誤差,未來需要加大樣本量進一步研究。