γ-干擾素誘導蛋白-10 mRNA檢測試驗對不同年齡人群結核病的輔助診斷價值

宋瑞雪 董靜 姚明旭 賈紅彥 李自慧 孫琦 朱傳智 杜博平 邢愛英 潘麗萍

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的嚴重威脅人類健康的傳染性疾病,其防控形勢依然嚴峻[1]。對結核病防控的關鍵在于盡早診斷和及時治療。盡管分子生物學技術的發展使得目前病原學檢出率有所提升,但臨床仍存在約50%的病原學陰性結核病患者,需要依靠免疫學、影像學等輔助方法進行診斷[2]。

近年來,有研究發現γ-干擾素誘導蛋白-10(interferon gamma-induced protein 10,IP-10)可能作為結核病輔助診斷的新靶標[3-4]。IP-10是CXC家族中的一種趨化因子,在結核特異性抗原刺激后其表達水平明顯高于γ-干擾素(IFN-γ)[5]。有研究發現,在結核抗原刺激的2.5～8 h內,IP-10 mRNA的表達可以上調約100倍[6],故以IP-10 mRNA為靶點診斷結核感染可能帶來更高敏感性[7-8]。既往研究發現,IP-10 mRNA可用于結核感染的檢測[9],而且對結核病具有一定的輔助診斷價值,但目前尚無在不同年齡組中分析IP-10 mRNA檢測診斷性能的數據。因此,本研究采用前瞻性分析,納入了1590例疑似結核病患者,根據年齡分為中青年組和老年組,根據最終臨床診斷結果,分別對不同年齡組內IP-10 mRNA檢測結果進行比較分析,進一步評估IP-10 mRNA檢測技術對不同年齡組結核病的輔助診斷價值。

對象和方法

一、研究對象

于2018年3月至2022年7月,在首都醫科大學附屬北京胸科醫院、河南省傳染病醫院和深圳市第三人民醫院連續性、前瞻性納入疑似結核病患者,共計1590例,剔除診斷不明確200例,共1390例納入分析。根據研究對象的臨床表現、常規生化檢測、結核病病原學檢測、影像學檢測和(或)病理學檢測結果,將上述患者分為確診結核病組475例、臨床診斷結核病組518例和非結核病組397例。本研究通過首都醫科大學附屬北京胸科醫院倫理委員會批準,編號為(2018)年臨審第(2017-40-01)和(2019)年臨審第(2017-40-02),所有研究對象入組前均簽署知情同意書。

二、納入和排除標準

1. 納入標準:(1)確診結核病組:參照《WS 288—2017 肺結核診斷》[10],具有結核病臨床表現且具有MTB病原學診斷依據者。(2)臨床診斷結核病組:參照《WS 288—2017 肺結核診斷》[10],具有結核病臨床表現且具備結核病影像學表現,排除肺部其他疾病者。(3)非結核病組:主要指肺炎、肺癌、非結核分枝桿菌病等易混淆疾病,均按相應疾病的診斷標準進行診斷,并經臨床診斷及鑒別診斷最終確診。

2.排除標準:年齡<18歲,最終診斷不明或者隨訪期內診斷更改。

三、研究方法

1.IP-10 mRNA檢測:采用IP-10 mRNA檢測試劑盒(蘇州創瀾生物科技有限公司)并嚴格按照試劑盒說明書進行。采集肝素抗凝靜脈血均勻分至空白對照管(N管)、結核抗原管(T管)和陽性抗原管(P管),每管1.2 ml,立即輕柔顛倒混勻3～5次,使血液充分與管內壁接觸,然后轉入37 ℃恒溫培養箱內孵育培養6 h。孵育后的全血標本在全自動核酸檢測反應體系構建系統上完成外周血標本的RNA提取(儀器全自動操作,蘇州創瀾生物科技有限公司,Innovo-100)。取10 μl RNA,按照50 ℃ 20 min,85 ℃ 2 min逆轉錄成cDNA。取10 μl cDNA,15 μl聚合酶鏈式反應緩沖液(包含探針、酶和緩沖液),組成25 μl擴增體系,按照50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,然后95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s循環40次,完成實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR), qPCR檢測在美國ABI公司7500實時熒光定量PCR儀上完成。軟件自動計算靶標IP-10和內參基因CHMP2A的擴增循環閾值(cycle threshold,Ct),采用ΔCt=Ct靶標基因-Ct內參基因的方法分別計算N管、T管和P管中靶標IP-10 mRNA的相對表達量。

2.結果判讀標準:當T管中IP-10 mRNA的相對表達量減去N管中IP-10 mRNA的相對表達量≤-1.04,定義為陽性結果;當T管中IP-10 mRNA的相對表達量減去N管中IP-10 mRNA的相對表達量>-1.04,且P管中IP-10 mRNA的相對表達量減去N管中IP-10 mRNA的相對表達量≤-1.2時,定義為陰性;當T管中IP-10 mRNA的相對表達量減去N管中IP-10 mRNA的相對表達量>-1.04,且P管中IP-10 mRNA的相對表達量減去N管中IP-10 mRNA的相對表達量>-1.2時,定義為不確定結果。

四、 統計學處理

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據的統計學分析。偏態分布的計量資料以“中位數(四分位數)[M(Q1,Q3)]”描述,組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗;計數資料以“百分率/構成比(%)”描述,組間差異的比較采用χ2檢驗。基于R語言完成敏感度和特異度變化的Mann-Kendall趨勢檢驗,散點圖應用Prism 8.0繪制。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般特征

1390例納入分析的研究對象中,確診結核病組475例,包括男317例,女158例,年齡18～88歲,中位年齡為41歲;臨床診斷結核病組518例,其中男300例,女218例,年齡18～95歲,中位年齡為37歲;非結核病組397例,其中男232例,女165例,年齡18～88歲,中位年齡為53歲。具體見表1。

表1 研究對象的一般特征

按照世界衛生組織年齡分段將納入分析的人群進行分組[11],中青年組1062例(18～59歲)和老年組328例(60～95歲)。中青年組中,結核病患者810例,男489例,女321例,中位年齡33歲,其中確診結核病患者376例,男243例,女133例,中位年齡33歲;臨床診斷結核病患者434例,男246例,女188例,中位年齡33歲;非結核病患者252例,男146例,女106例,中位年齡45歲。老年組中,結核病患者183例,男128例,女55例,中位年齡66歲。其中確診結核病患者99例,男74例,女25例,中位年齡66歲;臨床診斷結核病患者84例,男54例,女30例,中位年齡67歲;非結核病患者145例,男86例,女59例,中位年齡67歲。

二、IP-10 mRNA檢測的診斷效能評估

1.IP-10 mRNA檢測在結核病輔助診斷中的價值評估:1390例納入分析的研究對象中,IP-10 mRNA檢測有效者1366例(98.3%),不確定結果24例(1.7%),其中,結核病組13例,非結核病組11例,主要原因是陽性對照管中靶標IP-10的相對表達量低于設定的閾值。剔除獲得的24例不確定結果,在剩余的1366例有效檢測標本中分析IP-10 mRNA檢測的診斷效能。結核病組980例患者中,880例IP-10 mRNA檢測陽性;非結核病組386例患者中,246例IP-10 mRNA檢測陰性。以臨床診斷為標準,IP-10 mRNA檢測的敏感度為89.8%(95%CI:87.7%～91.6%),特異度為63.7%(95%CI:58.7%～68.5%)。IP-10 mRNA檢測的陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比分別為86.3%(95%CI:84.0%～88.3%)、71.1%(95%CI:66.0%～75.8%)、2.48(95%CI:2.17～2.83)、0.16(95%CI:0.13～0.19)。其中確診結核病組和臨床診斷結核病組的陽性檢出率分別為92.3%(432/468,95%CI: 89.4%～94.4%)和87.5%(448/512,95%CI: 84.2%～90.2%)。在非結核病組中,肺癌組、肺炎組和非結核分枝桿菌病組的陰性檢出率分別為53.7%(72/134,95%CI:44.9%～62.3%)、61.3%(106/173,95%CI:53.6%～68.5%)和83.3%(35/42,95%CI:68.0%～92.5%)。

2.不同年齡組中IP-10 mRNA檢測輔助診斷結核病的性能分析:中青年組(18～59歲)中,結核病組患者799例,非結核病組患者247例,IP-10 mRNA檢測的敏感度和特異度分別為90.2%(95%CI:87.9%～92.1%)和68.8%(95%CI:62.6%～74.4%)。中青年組中,按照0～20歲、20～40歲、40～60歲進行了進一步亞組分析。在0～20歲中,31例結核病組患者中27例IP-10 mRNA檢測陽性,5例非結核病組患者中3例IP-10 mRNA檢測陰性,IP-10 mRNA檢測的敏感度和特異度分別為87.1%(95%CI:69.2%～95.8%)和60.0%(95%CI:17.0%～92.7%);20～40歲中,480例結核病組患者中435例IP-10 mRNA檢測陽性,86例非結核病組患者70例IP-10 mRNA檢測陰性,IP-10 mRNA檢測的敏感度和特異度分別為90.6%(95%CI:87.6%～93.0%)和81.4%(95%CI:71.2%～88.7%);在40～60歲中,288例結核病組患者中259例IP-10 mRNA檢測陽性,156例非結核病組患者中97例IP-10 mRNA檢測陰性,IP-10 mRNA檢測的敏感度和特異度分別為89.9%(95%CI:85.7%～93.0%)和62.2%(95%CI:54.0%～69.7%)。老年組(60～95歲)中,結核病組患者181例,非結核病組患者139例,IP-10 mRNA檢測的敏感度和特異度分別為87.8%(95%CI:82.0%～92.0%)和54.7%(95%CI:46.0%～63.1%)。IP-10 mRNA檢測的敏感度在中青年組和老年組間差異無統計學意義(χ2=0.922,P=0.337),中青年組IP-10 mRNA檢測的特異度高于老年組,差異有統計學意義(χ2=7.704,P=0.006)。具體見表2。

表2 不同年齡組中IP-10 mRNA檢測結核病的效能分析

3.IP-10 mRNA檢測的敏感度和特異度隨年齡變化趨勢:以每10歲為一個年齡組,將結核病組980例及非結核病組386例患者進行分組。隨著年齡增加,IP-10 mRNA檢測的敏感度變化趨勢見圖1。結果顯示,無論是確診結核病組(Z=-0.157,P=0.875)、臨床診斷結核病組(Z=-0.601,P=0.548)或所有結核病組(Z=-1.063,P=0.288)中,IP-10 mRNA檢測的敏感度隨年齡變化差異均無統計學意義。各年齡組內IP-10 mRNA診斷特異度變化趨勢見圖2。結果顯示,IP-10 mRNA檢測的特異度在30歲及以下人群中達到頂峰(81.8%),隨后隨年齡增長診斷特異度逐漸降低(Z=-2.846,P=0.004)。

圖1 IP-10 mRNA檢測結核病敏感度隨年齡變化折線圖

圖2 IP-10 mRNA檢測結核病特異度隨年齡變化折線圖

討 論

目前,關于IP-10用于結核病診斷的薈萃分析研究提示其檢測的綜合敏感度為85%(95%CI:80%～88%),綜合特異度為89%(95%CI:84%～92%)[12],提示IP-10作為結核病輔助診斷靶標的可行性。IP-10 mRNA檢測作為一種新的結核感染診斷靶標,在既往研究中對其輔助診斷結核病的性能有所分析,提示在診斷結核病中也有著良好的性能[13],但其在不同年齡分組中,特別是老年群體中對結核病輔助診斷的性能如何,現階段數據不足。本研究募集了一組較大樣本量的疑似結核病患者隊列,根據最終診斷分為結核病組和非結核病組,并在中青年組和老年組中分別探討了以IP-10 mRNA為靶標的檢測技術的診斷效能,發現在中青年和老年組結核病患者中IP-10 mRNA檢測的敏感度差異并無統計學意義,而且在年齡分層分析中IP-10 mRNA檢測的敏感度差異也無統計學意義,提示IP-10 mRNA檢測的敏感度受年齡影響較小。既往關于γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assays,IGRA)的診斷性能評價中,均提示IGRA檢測結核病的敏感度隨年齡增長而下降[14-16],國內研究結果也提示IGRA檢測對老年結核病的敏感度相較于中青年組明顯降低[17-18],提示老年人中應用IGRA檢測會存在更高比例的假陰性結果。但本研究發現IP-10 mRNA檢測對老年結核病的敏感度不受年齡影響,因此,相對于傳統的IGRA檢測,在老年疑似結核病患者中應用IP-10 mRNA檢測技術進行結核病診斷,可能獲益更多。

本研究中IP-10 mRNA檢測對疑似結核病的敏感度和特異度分別為89.8%(95%CI: 87.7%～91.6%)和63.7%(95%CI:58.7%～68.5%),其敏感度與文獻報道結果相似,但特異度相對較低[19]。IP-10 mRNA檢測作為結核感染的診斷方法,與IGRA類似,并不能區分結核分枝桿菌潛伏感染和活動性結核病。年齡增長、免疫力低下是結核感染的危險因素[20-21],本研究中非結核病組患者多為老年肺癌和肺炎患者,免疫力低且容易合并感染(中位年齡為53歲),導致結核分枝桿菌潛伏感染比例增加,進而表現為IP-10 mRNA檢測特異度較低。而既往關于IP-10蛋白用于診斷結核病的Meta分析中[4],主要以健康人、兒童非結核病患者或密切接觸者作為對照組,相較于本研究的對照組其潛伏感染風險相對較低,特異度較高。本研究也在不同年齡組中分析了其特異度,發現在40歲及以下群體中,IP-10 mRNA檢測的整體特異度維持在80%以上。盡管在低于20歲的群體中,特異度僅為60%,但這很大程度上是因為本研究中低于20歲的非結核病組患者例數太少(5例)導致。隨著年齡增長,在40歲及以上年齡的人群中,潛伏感染風險增高,導致特異度逐漸降低,在老年組中降至60%以下。這一數據與國內既往關于老年人中IGRA檢測的結果一致,即在我國超過60歲的老年人群中,潛伏感染率明顯上升,超過30%[22-23]。

老年患者由于缺乏典型臨床癥狀、病原學檢出率低及因免疫反應受損導致對IGRA等診斷反應減弱,因此結核病診斷困難。但與青年人相比,老年人患結核病的風險卻增加了1.5倍[24],說明對老年疑似結核病患者的臨床診斷需求更加強烈。同時,在《老年肺結核診斷與治療專家共識(2023版)》[25]中也指出對于具有危險因素的老年結核分枝桿菌潛伏感染者,建議進行相關的結核病篩查。有研究表明,體外應用MTB抗原刺激外周血單個核細胞產生的IFN-γ比年輕人低,且在動物實驗中老年小鼠對MTB的易感性增加,這可能與CD4+T細胞介導的免疫受損有關[26],這也是IGRA檢測敏感度隨年齡增加而降低的原因之一。但本研究結果提示IP-10 mRNA檢測敏感度不受年齡影響,提示IP-10的釋放存在其他細胞來源或存在其他通路調節機制,仍需要進一步探究。

綜上,本研究基于臨床真實世界的研究隊列,評估了IP-10 mRNA檢測在不同年齡組中對結核病診斷的性能,特別是分析了其在臨床鑒別診斷困難的老年疑似結核病患者中的診斷性能,結果提示,IP-10 mRNA檢測在老年結核病診斷中只能作為輔助手段;但在缺乏病原學證據的情況下,由于IP-10 mRNA檢測的敏感度不受年齡增長影響,因此,其陰性結果能夠更好地提示臨床醫生優先考慮其他非結核性疾病。

本研究尚存在一些不足之處。首先,在研究評估IP-10 mRNA檢測的效能時,并未同時納入IGRA檢測進行對比分析。其次,受樣本量限制,本研究并未進一步對IP-10 mRNA檢測在其他合并癥人群中的診斷效能進行評估,其中包含糖尿病、其他免疫疾病人群和HIV感染人群等,未來應在各類特殊人群中進行深入分析,以便于指導臨床應用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻宋瑞雪:實施研究、采集數據、分析/解釋數據、起草文章;董靜和姚明旭:實施研究、采集數據;賈紅彥:對文章的知識性內容作批評性審閱;李自慧:獲取研究經費、支持性貢獻;孫琦、杜博平和邢愛英:行政/技術/材料支持、支持性貢獻;朱傳智:獲取研究經費;潘麗萍:醞釀和設計實驗、對文章的知識性內容作批評性審閱、獲取研究經費、指導、支持性貢獻