賀蘭山東麓產區‘美樂’和‘赤霞珠’葡萄酒香氣特征研究

何少華，都振江，商華，閆梅玲，蘭義賓*，項文婷，秦燕飛

（1.中糧長城葡萄酒（寧夏）有限公司，寧夏銀川 750100；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院/葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；3.中國長城葡萄酒有限公司，河北張家口 075400）

葡萄酒的品質由其外觀特征、香氣、滋味等因素綜合來決定。葡萄酒香氣的組成和含量與多方面因素相關，如品種、生長環境、成熟度、釀造技術、后期工藝處理等[1-2]，利用儀器檢測手段分析葡萄酒的香氣已成為人們衡量葡萄酒感官品質的重要參考依據。研究發現，葡萄酒中包含著復雜的香氣物質成分，目前已經鑒定出的有1300多種，主要包括醇、醛、酮、酸和酯等化合物，賦予葡萄酒特殊又復雜的香氣，其中包括黑櫻桃、黑莓、花朵和奶油脂肪等水果、花卉和香料的香氣[3]。相同或者不同品種葡萄酒的香氣成分在不同產區或者不同地塊均有明顯差異，使葡萄酒展現出不同質量和風格，從而具有一定的產地和品種特征[4-6]。

‘赤霞珠’和‘美樂’是兩種主流紅葡萄品種，被世界許多葡萄酒產區廣泛種植，并用于釀制紅葡萄酒[7]。在中國，賀蘭山東麓葡萄酒產區因擁有得天獨厚的地理環境、優越的氣候條件、獨特的土壤環境和高品質釀造技術，成為我國最大的釀酒葡萄產區之一。截至2022年底，賀蘭山東麓的釀酒葡萄種植面積已經達到3.88萬 hm2，約占全國釀酒葡萄總面積的三分之一[8]。研究葡萄酒的香氣成分對于理解當地葡萄品種的特點及不同葡萄酒的品質、風格差異非常重要，也有助于提高釀酒技術和工藝水平，推動產業發展，并為消費者提供更加多樣化的優質產品。

本試驗檢測了寧夏賀蘭山東麓產區的‘美樂’和‘赤霞珠’葡萄酒的揮發性香氣物質，旨在為分析產區釀酒葡萄香氣特征和風格品質提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地和材料

‘美樂’（Merlot，ME）和‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon，CS）品種葡萄均來自2020年份的寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產區，每個品種采自5個典型的子產區，從南到北選取5塊葡萄園，它們的地理位置在谷歌地圖（https://www.google.com/maps/place/）采集。5個子產區分別為紅寺堡產區（106.17°E，37.33°N）、青銅峽廣武產區（105.90°E,37.85°N）、甘城子產區（105.91°E，38.04°N）、三關口產區（105.94°E，38.38°N）、金山產區（106.07°E，38.71°N），整體取樣基本在同一經度上，最南端產區的緯度為37.33°N，最北端產區的緯度為38.71°N，南北差距1.38°。紅寺堡葡萄園為沙壤土，青銅峽廣武葡萄園為風沙土和灌淤土結合，甘城子葡萄園為風沙土帶有少量礫石，三關口和金山葡萄園主要為礫石土壤，各葡萄園管理水平良好。根據當地氣候條件和兩品種的成熟情況，葡萄果實在適當成熟系數采收[9-10]，‘美樂’采收時間為9月22日至9月24日，‘赤霞珠’采收時間為10月6日至10月8日，除梗破碎入料，采用常規干紅發酵工藝釀造，每個酒樣從入料、發酵、儲存均在獨立的容器中，確保試驗結果反映不同葡萄的品種特征。各酒樣命名為紅寺堡‘美樂’（HSP-ME）、紅寺堡‘赤霞珠’（HSPCS）；青銅峽‘美樂’（QTX-ME）、青銅峽‘赤霞珠’（QTX-CS）；甘城子‘美樂’（GCZ-ME）、甘城子‘赤霞珠’（GCZ-CS）；三關口‘美樂’（SGK-ME）、三關口‘赤霞珠’（SGK-CS）；金山‘美樂’（JS-ME）、金山‘赤霞珠’（JS-CS）。酒精發酵后進行常規理化指標檢測，原酒經蘋果酸-乳酸發酵后，在不銹鋼罐穩定儲存6個月后對其香氣物質進行檢測。

1.2 儀器設備與試劑

1.2.1 試驗設備

50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Sigma-Aldrich公司；HP-Innowax色譜柱（60 m×0.25 μm×0.25 mm）：美國Agilent Technologies公司；QP2010 Ultra氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用儀：日本島津公司；2RO/DI-digital型純水儀：上海和泰儀器有限公司；DP-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；UV-3100型紫外分光光度計：上海美普達儀器有限公司；PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器有限公司；ME204E型分析天平：METTLER TOLEDO公司；THD-0505型低溫恒溫槽：寧波天恒儀器廠。

1-己醇、1-丁醇、丁酸乙酯、2-辛醇、2-甲基丁酸乙酯、1-戊烯-3-醇、異戊酸乙酯、2-庚醇、異丁醇、3-甲硫基丙醇、戊醇、正丁醇等標準品（純度均＞98%）：美國Sigma-Aldrich公司。4-甲基-2-戊醇、乙醇（純度均＞98%）：美國Thermo Fisher Scientific公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化指標的測定

各葡萄采收后，經過穗選、粒選后除梗破碎，加入果膠酶和50 mg?L-1的SO2，置于15 t的小型不銹鋼罐中，添加已活化的酵母，控溫24～26 ℃進行發酵，待發酵至殘糖＜4 g?L-1時，即判定酒精發酵結束，進行皮渣分離，最后進行穩定澄清，得到10個干紅葡萄酒酒樣，分別進行理化指標的檢測。葡萄酒的理化指標（酒精度、總糖、可滴定酸、揮發酸、pH、干浸出物）分析測定依據國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和GB 2758—2012《食品安全國家標準發酵酒及其配制酒》執行。色度采用分光光度計法，測定波長420、520、620 nm下的吸光值，取三者之和。檢測后取不同地區同一品種的數據平均值進行分析。

1.3.2 香氣物質的測定

對各酒樣的香氣物質進行檢測，檢測后取同品種不同地區的平均值進行分析。揮發性風味物質采用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）分析。

頂空固相微萃取（HS-SPME）：稱取1 g NaCl于15 mL樣品瓶，加入5 mL酒樣，10 μL內標（4-甲基-2-戊醇，1617 mg?L-1），立即擰緊樣品瓶蓋，放置在自動進樣器的樣品架上。平衡穩定30 min（溫度為40 ℃），萃取30 min，確保樣品瓶中香氣物質達到氣-液和氣-固平衡；將萃取頭插入樣品瓶頂空部分，持續在40 ℃下攪拌30 min。在GC-MS進樣口解析8 min（250 ℃，老化時間2 min）。

氣相色譜條件：樣品采用不分流模式，使用高純度（純度＞99.999%）氦氣作為載氣，進樣口溫度為250 ℃，流速1 mL?min-1，吹掃流速3 mL?min-1。柱溫在50 ℃保持1 min后升溫至220 ℃，升溫速率為2 ℃?min-1，保持5 min。質譜測試條件：使用電子電離（EI）源進行電離，離子源溫度設定為230 ℃，質譜接口溫度設定為250 ℃，質量掃描區間為30～350 amu，進樣時長約1 min，溶劑延遲時間為3.5 min。采用基于標準香氣成分保留時間（RT）對比的方法，結合美國國家標準技術研究所（NIST 14）標準譜庫檢索比對結果進行揮發性香氣化合物的定性分析。同時，使用標準品制作標準曲線，并基于該曲線進行定量，單位為μg?L-1。

1.4 數據分析

采用Excel 2019軟件進行數據整理；采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析；采用Origin Pro 2022軟件作香氣物質的雷達圖、聚類熱圖和主成分分析；利用SIMCA-P 14軟件建立偏最小二乘判別分析模型，對香氣物質進行可視化趨勢分析，并篩選重要特征香氣物質。

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2 結果與分析

2.1 兩個品種葡萄酒的理化指標

由表1可以得出，兩個品種的葡萄酒理化指標均符合國標GB/T 15037—2006《葡萄酒》規定，且均為干型紅葡萄酒。兩個品種間的pH存在顯著性差異，‘美樂’（ME）的pH為3.44，‘赤霞珠’（CS）的pH為3.65，較ME高；干浸出物存在顯著性差異，CS含量31.4 g?L-1顯著高于ME的27.88 g?L-1；酒精度、總糖、可滴定酸、揮發酸、色度等5個理化指標無顯著性差異。

表1 ‘美樂’和‘赤霞珠’品種葡萄酒的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of 'Merlot' and 'Cabernet Sauvignon' varieties

2.2 兩個品種葡萄酒的香氣物質分析

2.2.1 葡萄酒香氣物質含量

兩個品種葡萄酒樣中，共檢測出香氣物質84種，如表2所示。葡萄酒揮發性香氣物質類型較為相似，C6醇類物質5種，高級醇類物質21種，脂肪酸乙酯類物質16種，乙酸酯類物質6種，其他酯類6種，萜烯類8種，倍半萜類2種，降異戊二烯類1種，醛酮類10種，脂肪酸類7種，果香硫醇2種。兩葡萄品種共計20種物質的含量存在顯著差異，其中1-己醇（青草味、生青味）、乙偶姻（奶油味、脂肪味）、水楊酸甲酯（青草味、新鮮味、冬青油味）、乙酸（醋酸味）4種物質的含量差異極顯著；其余16種物質為順式-2-己烯-1-醇、1-戊醇、順式-6-壬烯-1-醇、3-甲基-2-丁烯醇 、2-庚醇、辛酸乙酯、月桂酸乙酯、水楊酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯 、己酸異戊酯、辛酸異戊酯、異戊醛、丁酸。

表2 ‘美樂’和‘赤霞珠’葡萄酒的香氣物質含量和OAV值Table 2 Analysis of the volatile substance content and OAV values in 'Merlot' and 'Cabernet Sauvignon' wines

2.2.2 兩個品種葡萄酒的香氣物質含量分析

兩個品種葡萄酒的香氣物質類型具有相似性，在香氣物質的含量上有一定差異。對ME和CS各5個樣本進行聚類分析繪制圖1（左），CS品種（B區）各類香氣物質含量整體上較ME品種（A區）高，且CS品種單品中，隨著地理位置從南向北的變遷，香氣物質的含量呈現出逐漸增加的趨勢。通過對兩個品種香氣物質類別進行主成分（PCA）分析繪制圖1（右），主成分1（PC1）43.6%，主成分2（PC2）23.1%，PC1和PC2的貢獻解釋了總變異的66.7%，整體區分度良好；ME酒樣的香氣物質較為相近均位于第三象限，CS酒樣居于第一、二、四象限，說明所測不同產區的ME酒樣特征相似度高；ME僅在PC1上有降異戊二烯類物質和PC2成分中的果香硫醇類、萜烯類、高級醇類物質為主要特征，CS品種（除HSPCS外）在PC1上除降異戊二烯類物質外的其他物質均為主要特征，且CS各酒樣之間差異較大。

圖1 ‘美樂’和‘赤霞珠’酒樣香氣物質類別的聚類熱圖（左）和主成分分析（右）Figure 1 Cluster heat map (left) and principal component analysis (right) of aroma substance kinds of'Merlot' and 'Cabernet Sauvignon' wine samples

表3所示，ME香氣總含量達到1034.04 mg?L-1，CS香氣總含量較高達到1175.10 mg?L-1，兩酒樣中的香氣物質主要以高級醇類、脂肪酸類、脂肪酸乙酯類、醛酮類物質為主；兩酒樣香氣物質含量占比差異較大，高級醇類物質在ME中占比66.01%，在CS中占比60.75%；脂肪酸類物質在ME中占比28.97%，在CS中占比32.97%；脂肪酸乙酯類物質在ME中占比3.98%，在CS中占比3.89%；醛酮類物質在ME中占比0.92%，在CS中占比2.22%；其余物質占比約0.11%。兩酒樣的香氣物質含量中C6醇類、醛酮類、脂肪酸類3類物質存在極顯著差異，乙酸酯類物質存在顯著差異，且均為CS較ME高。高級醇類物質在ME中的占比顯著高于CS，乙酸酯類物質和醛酮類物質在ME中的占比顯著低于CS。

表3 兩品種葡萄酒各種類香氣物質含量和占比Table 3 Content and proportion of volatile substances in two wine samples

2.3 兩品種葡萄酒的香氣物質OAV值分析

2.3.1 香氣物質的OAV值差異性

為探究ME和CS品種葡萄酒的香氣物質對酒的氣味貢獻度和差異，由表2可知，兩個品種共23種物質OAV＞1，其中異戊醇（酒精味、指甲油味）、甲硫基丙醇（煮西紅柿、橡膠）、辛酸乙酯（香蕉、梨、花香）、己酸乙酯（香蕉、青蘋果）、乙酸異戊酯（香蕉味）、乙醛 （辛辣味、溶劑味）、苯甲硫醇（煙熏、打火石）、苯乙醇（花香）8種香氣物質的OAV值＞10，對酒的氣味貢獻較大。

對ME和CS各5個酒樣的OAV＞1的香氣物質進行聚類分析繪制圖2，可看出兩者差異性，ME酒樣主要以乙醛、己酸乙酯、己酸、丁酸乙酯、辛酸、辛酸乙酯、異戊醛、2,3-丁二醇等12種香氣物質為品種差異性特征，葡萄酒中的草本、果香、花香、奶酪味、脂肪味更突出；CS酒樣主要以甲硫基丙醇、乳酸異戊酯、乙酸、乙偶姻、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、苯乙醇、異戊醇、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、異丁醇、苯乙醛、苯甲硫醇、1-辛烯-3-醇、1-己醇等17種香氣物質為品種差異性特征，葡萄酒中的酒精味、溶劑味、指甲油等化學味和果香、煙熏、打火石、蘑菇味等更為突出，構成了葡萄酒香氣的多樣性和復雜性。

圖2 酒樣中OAV＞1的香氣物質相關性聚類熱圖Figure 2 Correlation cluster heat maps of volatile compounds with OAV>1 in wine samples

2.3.2 OAV值評價ME和CS品種葡萄酒的香氣質量

根據表2中各香氣物質OAV＞1的成分，使用Origin對數據進行標準化（歸一化）處理，對兩個品種香氣歸為9類并利用OAV累計值作香氣輪廓圖，結果如圖3。由圖3可知，兩個品種葡萄酒在香氣類型上相似，主要表現在香蕉果香、化學味、花香、蘋果等香氣類型，兩者在香氣類型的貢獻程度上有一定差距，ME葡萄酒在果香（辛酸乙酯）香氣和花香較突出，CS葡萄酒在草本味（1-己醇）、化學味（異戊醇、乙醛 ）、其他類中的蘑菇/橡膠（1-辛烯-3-醇、甲硫基丙醇）、蘋果果香（己酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯）等香氣類型突出。

圖3 兩葡萄酒樣品的香氣輪廓圖Figure 3 Aroma outline of two wine samples

2.4 葡萄酒香氣成分的OPLS-DA分析

利用SIMCA-P 14基于OAV＞1的23種香氣定量結果對兩品種酒樣建立正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）模型，對香氣物質進行可視化趨勢分析（圖4）。通過OPLS-DA分析模型，該模型的解釋變量（R2x）和預測能力（R2y）分別為0.932和0.921，說明模型分類良好，Q2為0.651，對兩個品種葡萄酒香氣風味具有良好的預測能力。由主成分得分圖4A分析，ME和CS酒樣被明顯的區分為2類，提取的2個主成分累計貢獻率為75.9%，能夠較好反映總體原始變量的絕大部分信息和多個樣本間的總體情況。其中ME在PC1的負向端，相互聚攏為一類，與PC1呈負相關；CS品種在PC1的正向端，與PC1呈正相關；在PC2方向上ME酒樣和CS酒樣分布較廣，有一定差異性。因此可從PC1上對ME和CS進行明顯的區分。

圖4 不同品種葡萄酒香氣成分正交偏最小二乘判別分析結果Figure 4 Results of orthogonal partial least squares discriminant analysis of aroma components in diあerent wines

OPLS-DA分析是一種以偏最小二乘法為基礎的判別方法，用各因素的重要性指數來定量OPLS-DA中各因素對類別的貢獻，從而方便地篩選出有意義的特征物[20-21]。不同品種葡萄酒的重要香氣物質VIP值分布見圖4B。由圖4B和圖4C可知，VIP值越大，變量在不同產地間差異越顯著。為了篩選對品種差異有重要影響的風味物質，以VIP＞1為指標，確定對品種區分有重要貢獻的香氣物質共5種，其中乙酸（VIP=3.49，醋酸味）、苯乙醇（VIP=1.71，花香）、異戊醇（VIP=1.57，溶劑味、酒精味、指甲油）、乙偶姻（VIP=1.33，奶油味、脂肪味）為CS酒樣中主要特征物質；2，3-丁二醇（VIP=1.34，奶油味、花香）為ME酒樣中的主要特征物質。這5種物質可作為ME和CS品種之間香氣物質相互區分的主要標志物。

對OPLS-DA進行200次的置換交叉驗證試驗（Permu tation test），200次重抽樣R2與Q2擬合置換圖見圖4D，驗證Q2與真實Q2在一條回歸直線上，截距為-1.14＜0.05，模型未出現過擬合，模型區分度良好，認為該結果可用于對兩品種葡萄酒揮發性成分的區分。

3 討論與結論

本研究通過對比賀蘭山東麓5個子產區的‘美樂’和‘赤霞珠’葡萄品種的香氣物質含量和組成，揭示了兩者之間的差異性，并發現了一些具有顯著貢獻度的關鍵特征物質。

試驗結果表明，兩個品種酒樣在理化指標方面只有pH和干浸出物含量存在顯著差異，這些差異可能受到品種、栽培管理和地理環境等因素的影響[22-27]。本試驗中兩品種葡萄酒香氣物質相對含量主要以高級醇類（占比63.4%）、脂肪酸類（占比31.0%）、脂肪酸乙酯類（占比3.9%）、醛酮類（占比1.5%）這4類物質為主，共占比99%以上，這些物質作為葡萄酒的主要呈香物質，已得到很多研究的證實[28-30]。相對含量分析結果顯示，‘赤霞珠’較‘美樂’的C6醇類、酯類-乙酸酯類、醛酮類、脂肪酸類物質含量高，其中以1-己醇、乙酸異丁酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、異戊醛、丁酸、乙酸為主要差異性物質。根據不同產區酒樣的香氣物質含量進行主成分分析能較好的區分兩個品種的主要特征，但對產區區分的結果并不理想，與孫麗君[28]研究結果一致。不同產區‘美樂’的香氣物質以降異戊二烯類、果香硫醇類、萜烯類等物質為主要特征；而‘赤霞珠’各酒樣之間差異較大，說明賀蘭山東麓不同子產區對‘赤霞珠’香氣物質含量的影響較大，與葛謙[20]的研究結果較為一致，這可能是因為受到不同緯度、地理氣候特征等因素的綜合影響所致。本研究對酒樣進行了香氣物質的檢測，共計鑒定出84種香氣物質，兩個品種的香氣物質總含量均超過了1000 mg?L-1，但‘赤霞珠’整體高于‘美樂’葡萄酒的香氣物質含量，這與張燕[31]等對不同品種葡萄酒的研究結果相似。‘美樂’相較于‘赤霞珠’在香氣物質方面表現較弱，這可能是由于‘美樂’本身香氣物質含量相對較低所致。二者在20種香氣物質含量上存在顯著差異，其中1-己醇（青草味、生青味）、乙偶姻（奶油味、脂肪味）、水楊酸甲酯（青草味、新鮮味、冬青油味）、乙酸（醋酸味）4種物質的含量差異極顯著。‘赤霞珠’葡萄酒各類香氣物質整體上較‘美樂’葡萄酒高，且‘赤霞珠’單品種隨著地理位置從南向北的變遷，香氣物質的含量呈現出逐漸增加的趨勢，與李媛媛[29]的研究較為一致，說明不同地理位置同一品種香氣存在差異，另外，李媛媛等還發現，大馬士酮是賀蘭山東麓產區‘赤霞珠’干紅葡萄酒的花香和果香特征主要香氣貢獻物質，而本次研究未檢測出大馬士酮物質，這種差異可能是受到所用酒樣來源的影響，未來有必要對此加以確認。

通過OAV值分析發現，兩個品種的葡萄酒主要呈現了香蕉、蘋果、梨等果香，化學味和花香。其中，‘美樂’葡萄酒的花香味和梨類香氣較為突出，而‘赤霞珠’葡萄酒的化學味和蘑菇/橡膠等香氣類型較為突出。進一步應用OPLS-DA分析，確定了乙酸、苯乙醇、異戊醇、乙偶姻和2,3-丁二醇這5種物質對香氣具有顯著貢獻度，說明它們可成為區分該產區‘美樂’與‘赤霞珠’兩個品種的關鍵特征物質。

綜上所述，‘美樂’和‘赤霞珠’兩個品種葡萄酒在香氣物質含量和香氣質量方面存在顯著差異。這些發現有助于建立基于不同產區、葡萄園和葡萄品種的風味指紋數據庫和感官描述詞庫，為生產企業提供關于葡萄品種選育和栽培的科學依據。