脫落酸調控‘品麗珠’葡萄果實白藜蘆醇合成的研究

王俊芳，姜凱凱，楊東岳，孫玉霞，管雪強*

（山東省葡萄研究院/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術創新中心，山東濟南 250100）

芪類化合物是一類多酚類次生代謝產物，屬于植物抗毒素，存在于包括葡萄在內的部分植物中[1-2]。而其中的白藜蘆醇（Resveratrol，Res）具有醫學保健作用，可預防和減緩癌癥、心腦血管疾病的發生[3-4]。葡萄及其產品被認為是食品中Res的重要來源，但是在大量栽培的葡萄果實中Res含量很低（<10 μg?g-1），因此，研究葡萄中Res的合成與積累及其調控機制，提高成熟果實中Res含量具有重要意義。

Res在葡萄果實中主要有4種存在形式：反式-白藜蘆醇（trans-resveratrol，trans-res）、順式-白藜蘆醇（cis-resveratrol，cis-res）、反式-白藜蘆醇苷（trans-piceid，trans-pd）、順式-白藜蘆醇苷（cispiceid，cis-pd）[5]。通常情況下，Res在不同組織器官和不同基因型葡萄品種中含量不同[6-7]。很多研究均表明，葡萄果實中Res的合成與積累從葡萄的轉色期（veraison，即果實開始進入成熟階段，著色品種開始著色，白色品種果皮綠色減退、變淺、變黃，果肉開始變軟）迅速增加，且與葡萄的成熟過程及果實中植物激素的動態變化密切相關[8-11]。

葡萄果實的成熟受植物激素的調控，包括脫落酸（Abscisic acid, ABA）、油菜素內酯（Brassinosteroids,BR）、乙烯（Ethylene, ETH）等[12-15]。在葡萄發育過程中，ABA的合成與積累出現在果實的始熟期或略早[16-18]。大量的研究表明，ABA在調控葡萄果實成熟過程中起著十分重要的作用，包括促進果實著色、糖分積累和果實變軟等[12,16,19-24]，而施用ABA合成抑制劑氟啶酮（fluridone）可以抑制葡萄果實著色，延遲果實成熟[11,25]。

本研究采用外源ABA及其合成抑制劑處理‘品麗珠’葡萄果實，探討果實發育及成熟過程中Res合成與積累的動態變化規律，并通過分析果實中ABA的含量，進一步探討ABA調控葡萄果實Res合成與積累機制，對研究外源誘導子調控葡萄果實Res的合成具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

(+)-脫落酸（ABA）（分析純，純度≥98%）購于生工生物工程（上海）股份有限公司，氟啶酮（Fluridone，分析純）購于Sigma-Adrich公司（美國）。

配制方法：稱取一定量的(+)-ABA，先用少量的乙醇（0.1%，Vol，分析純）溶解，然后加水充分震蕩使其完全溶解，定容到一定體積，使其濃度為500 mg?L-1。然后在溶液中加入一定體積的表面附著劑Tween 80，其體積占最終溶液總體積的0.1%；氟啶酮溶液配制方法同上；對照（CK）的去離子水中也加入相同比例的乙醇和Tween 80。

以中糧集團（蓬萊）釀酒試驗基地的釀酒葡萄品種‘品麗珠’為試材，單干雙臂整形，南北行向，株行距為1 m×2.5 m，其他田間管理按常規。

1.2 處理方法

于2018年7月27日，即在‘品麗珠’果實的花后60 d（始熟期前10 d左右），選取72個果穗，在前期研究的基礎上，分別用500 mg?L-1的(+)-ABA、氟啶酮溶液進行噴施直至溶液剛開始下滴，每種溶液均處理24穗果；同時用去離子水浸泡處理的果穗作為對照。

1.3 取樣時間及方法

花后60 d（處理前）、花后61 d（處理后1 d）、花后62 d（處理后2 d）、花后67 d（處理后7 d）、花后81 d（處理后21 d）、花后95 d（處理后35 d）、花后116 d（處理后56 d）、花后138 d（處理后78 d，成熟期）取樣。

每次取3穗果，每穗果作為一個重復，樣品先用自來水沖洗，再用去離子水沖洗（去除果實表面外源ABA及氟啶酮溶液的殘留），吸水紙吸干表面，分離果實的果皮、果肉和種子，液氮速凍，研磨，-80 ℃冰箱下保存。

1.4 Res的提取與檢測分析

Res的提取參照Wang等[10]的方法：稱取1 g果皮粉末，用10 mL甲醇和乙酸乙酯50∶50（Vol）的浸提液提取，25 ℃ 條件下避光浸提24 h 。然后在4 ℃、10 000 r?min-1下離心10 min，取上清液。再用3 mL浸提液重復提取，離心，取上清液。合并兩次上清液，用旋轉蒸發儀在40 ℃下旋蒸至干，用2 mL甲醇復溶，-40 ℃儲存，待測。

Res的檢測與分析參照Wang等[10]的方法。樣品均采用安捷倫高效液相色譜系統進行測定。樣品上機分析前用0.22 μm PTFE膜（上海安譜科學儀器有限公司）過濾。色譜柱為Atlantis?T3反相C18柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm, Waters，USA），保護柱為Atlantis T3（4.6 mm×20 mm，5.0 μm，Waters，USA)。

高效液相色譜的測定條件參照Wang等[10]。采用外標法定量，標樣trans-res和trans-pd可以在紫外線-C（UV-C）輻射處理下部分轉化為順式異構體，所以兩種順式異構體（cis-res和cis-pd）是通過UV-C輻射處理30 min后得到的，且兩種順式異構體的含量是假設反式異構體能夠百分之百轉化而計算，根據轉化率，做出標準曲線。由于本研究中主要測定trans-res、cisres、trans-pd和cis-pd的含量，因此，把上述4種物質的總和計為Res總量。

1.5 基因表達分析

1.5.1 葡萄果皮RNA的提取

利用通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型，購于北京百泰克生物技術有限公司）提取果皮RNA。具體操作如下：

取100 mg葡萄果皮于液氮中快速研磨，將勻漿轉移至1.5 mL RNase free離心管中，加入1 mL的裂解液PL，在65 ℃條件下孵育5 min。然后在4 ℃條件下，以12 000 r?min-1轉速離心10 min，轉入新的RNase free過濾柱中。以10 000 r?min-1轉速離心45 s。收集濾液（含有總RNA）于收集管中，加入1倍體積70%乙醇，充分顛倒混勻，將得到的溶液轉入吸附柱中。以10 000 r?min-1轉速離心45 s，加入500 μL的去蛋白液，以12 000 r?min-1轉速離心45 s。加入700 μL漂洗液，以12 000 r?min-1轉速離心60 s，棄掉廢液。再加入500 μL漂洗液RW，以12 000 r?min-1轉速離心60 s，棄掉廢液。將吸附柱放回空收集管中，以12 000 r?min-1轉速離心2 min，盡量除去漂洗液。取出吸附柱，放入一個新的RNase free離心管中，在吸附膜的中間部位加45 μL RNase free water，室溫放置2 min，以12 000 r?min-1轉速離心1 min，即獲得了RNA提取物，置于-80 ℃保存。

1.5.2 DNA消化及反轉錄過程

利用天根生化科技（北京）有限公司的快速反轉錄試劑盒（Fast quant RT with gDNase KR106，中國）進行反轉錄。具體操作如下：

將模板RNA在冰上解凍，5×DNA Buffer、FQRT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室溫（15～25 ℃）解凍，然后置于冰上，使用前震蕩搖勻，收集殘留管壁的液體。

DNA的消化：在無核酸酶的離心管中，將13 μL總RNA和2 μL 5×gDNA Buあer配制成反應液，共15 μL，混勻，然后42 ℃下反應3 min。

反轉錄過程：在無核酸酶的離心管中，將2 μL的10×Fast RT Buffer、1 μL的RT Enzyme Mix和2 μL的FQ-RT Primer MIX配制成反應液，并將5 μL該反應液加入到DNA消化過程中的15 μL液體中，總反應體積為20 μL，然后先在42 ℃下反應15 min，再在95 ℃下反應3 min，即得到cDNA，在-20 ℃保存，備用。

1.5.3 引物的合成

引物序列參照作者及前人[9,14]已發表文章中所用的引物，由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 Res及ABA合成及調控相關基因的引物序列Table 1 Primers of genes related to Res and ABA biosynthesis and regulation

1.5.4 熒光定量PCR

使用天根生化科技有限公司的RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒進行熒光定量PCR。先將20×SYBR Solution和2.5×RealMasterMix在冰上解凍，然后將125 μL 20×SYBR Solution加入至2.5×RealMasterMix中，徹底混勻。在PCR反應管中配制20 μL的反應體系：9 μL 2.5×RealMasterMix/SYBR Solution、0.6 μL/0.6 μL的正反向引物、1 μL的DNA模板、8.8 μL的超純水。

使用7500熒光定量PCR儀進行以下程序：先在94 ℃預變性2 min；按以下程序進行40個循環PCR擴增：94 ℃變性10 s，58 ℃退火18 s，68 ℃延伸30 s；然后按照以下梯度采集溶解曲線：95 ℃保持1 min，55 ℃保持30 s，95 ℃保持30 s結束整個程序，熒光定量數據采用2-ΔΔCT法分析基因相對表達量。

1.6 數據統計分析

每個葡萄樣品3次重復的平均值被用來進行進一步的數據分析，采用PASW Statistics 13.0（SPSS，USA）處理數據，不同發育時期之間用One-Way ANONA 進行方差分析，所有圖表用Sigma Plot 12.5制作。

2 結果與分析

2.1 不同處理對果實粒質量及可溶性固形物含量影響

從圖1可以看出，所有處理的粒質量均表現為前期快速增大，在花后80 d以后趨于平穩的狀態。在138 d，ABA處理的粒質量比對照增加約11%，而ABA合成抑制劑氟啶酮處理的粒質量低于對照。在可溶性固形物含量方面，在成熟過程中3個處理均呈不斷上升趨勢，在花后116 d所有處理基本相同，但此后表現不同，ABA處理和對照繼續增加，在花后138 d達到最大值；氟啶酮處理則不再增加，顯著低于對照約20%。

圖1 不同處理對‘品麗珠’發育過程中果實粒質量（A）及可溶性固形物（B）的影響Figure 1 Berry weight(A) and total soluble solids (B) over the growing season in 'Cabernet France' berries

2.2 不同處理對果實內源ABA含量及其相關基因表達的影響

外源ABA處理‘品麗珠’葡萄果實后，顯著增加了果實中內源ABA的含量，且在果實整個成熟過程中，ABA的含量均高于對照（圖2），尤其是在花后62 d達到高峰（約0.7 μg?g-1）；氟啶酮處理后降低了果實中內源ABA的含量，但其變化趨勢與對照一致。

圖2 不同處理下‘品麗珠’果實發育過程中ABA含量變化Figure 2 Changes of ABA content in the development of'Cabernet Franc' berries under diあerent treatments

外源ABA處理后，ABA的兩個合成基因VvNCED1和VvNCED2的表達在前期升高（圖3），VvNCED1在花后62 d和67 d時顯著高于對照，并在花后67 d出現表達高峰，但是在花后116 d，出現第二個表達高峰，顯著低于對照；而VvNCED2在ABA處理后前期顯著高于對照，在花后81 d出現表達高峰，花后95 d低于對照。而氟啶酮處理后，VvNCED1的表達在整個發育過程中呈下降趨勢，在處理前期和后期，果實中VvNCED1的表達都低于對照，但在花后95 d高于對照（圖3A）；而VvNCED2表達在氟啶酮處理后顯著受到抑制（圖3B）。

圖3 不同處理對葡萄果實中ABA合成基因表達的影響Figure 3 Eあects of diあerent treatments on ABA synthesis gene expression in grape fruits

2.3 不同處理對總Res含量及其組分的影響

如圖4所示，在‘品麗珠’葡萄果實發育過程中，總Res含量持續增加，從花后81 d開始直到成熟，ABA處理的葡萄果實中總Res含量均顯著高于對照；用氟啶酮處理后，總Res含量積累減慢，并顯著低于對照。由圖5可以看出，‘品麗珠’果實總Res主要是由trans-res和cis-pd組成，約占53%和38%（圖5B，C），且二者含量在外源ABA處理后顯著增加；氟啶酮處理后，trans-res在果實發育過程中變化不明顯，只有在花后81 d和成熟期顯著低于對照（圖5B），但是cis-pd顯著降低（圖5C）；而trans-pd和cis-res含量較低，在ABA及氟啶酮處理后變化較小（圖5A，D），但在花后116 d和成熟期的ABA處理葡萄果實中trans-pd顯著高于對照，而花后95 d的果實中cis-res含量顯著高于對照。

圖4 不同處理對‘品麗珠’發育過程中總Res含量的影響Figure 4 Eあects of diあerent treatments ontotal Res content duringdevelopment of 'Cabernet Franc' berries

圖5 不同處理對‘品麗珠’發育過程中Res各組分含量的影響Figure 5 Eあects of diあerent treatments on the content of Res components during development of 'Cabernet Franc' berries

2.4 不同處理對Res合成基因表達的影響

外源ABA處理后的前期，苯丙氨酸代謝途徑的第一個基因VvPAL表達沒有變化，但在成熟期顯著高于對照，而在花后67 d的氟啶酮處理葡萄果實中顯著低于對照（圖6A）；VvC4H在花后67 d和138 d的ABA處理葡萄果實中顯著高于對照，而氟啶酮處理后幾乎沒有變化（圖6B）；Vv4CL在花后67 d和81 d 的ABA處理后葡萄果實中表達顯著低于對照，但在成熟期高于對照，而花后67 d、81 d、95 d的氟啶酮處理后葡萄果實中顯著低于對照（圖6C）。

圖6 不同處理對‘品麗珠’發育過程中Res合成相關基因表達的影響 (續）Figure 6 Eあects of diあerent treatments on the expression of genes related to Res synthesis during development of 'Cabernet Franc' berries

圖6 不同處理對‘品麗珠’發育過程中Res合成相關基因表達的影響Figure 6 Eあects of diあerent treatments on the expression of genes related to Res synthesis duringdevelopment of 'Cabernet Franc' berries

在‘品麗珠’葡萄果實花后60 d用ABA處理發現，在花后81 d，VvSTS表達顯著高于對照，在花后95 d，ABA處理和對照果實中VvSTS的表達都達到最高，但無顯著性差異；隨后表達量降低，在成熟期略有增加（圖6D）；VvSTS的一個重要調節基因VvMyb14在花后67 d的ABA處理葡萄果實中顯著高于對照，隨后其表達趨勢和對照基本一致，但無顯著性差異（圖6E）；VvSTS的另一個重要調節基因VvMyb15在外源ABA處理后的果實成熟過程中基本無變化，但是在成熟期顯著高于對照（圖6F）；Res糖苷合成的關鍵基因VvO3GT在花后95 d的ABA處理果實中與對照同時達到表達高峰，并顯著高于對照，隨后降低（圖6G）。

而ABA合成抑制劑處理后，VvSTS、VvMyb14、VvMyb15及VvO3GT的表達量均或多或少的降低，且在整個果實成熟過程中沒有出現表達高峰。

3 討論與結論

本研究表明，外源ABA處理能夠促進‘品麗珠’葡萄果實提前成熟，果實中內源ABA含量增加，且ABA處理后果實中Res含量增加。氟啶酮處理則抑制了葡萄果實成熟，且果實中Res含量降低。葡萄果實發育過程中Res合成受轉錄水平的調控，外源ABA處理后ABA合成基因VvNCED1和VvNCED2表達升高，Res合成相關基因及其調控基因（尤其是VvSTS、VvMyb14及VvMyb15）表達升高，而氟啶酮處理后表達量降低。

眾多研究表明，外源ABA的施加，能夠增加果實著色，加速果實成熟，即ABA在果實成熟過程中起著重要作用。在本研究中，外源ABA施用后，內源ABA的含量增加，有可能是因為外源ABA進入果實內部造成的；然而ABA合成基因VvNCED1和VvNCED2表達升高，表明是由于外源ABA的刺激，導致內源ABA的合成增加[26]。同時表明由于外源ABA的施用先啟動內源ABA的合成與積累，當內源ABA的含量積累到一定程度之后，再啟動葡萄果實的成熟，即促使‘品麗珠’葡萄提前進入始熟期，進而啟動Res的合成與積累。

在ABA信號途徑中，ABEB/ABFs是bZIP（basic leucine zipper）家族Group A中可以結合在ABA-響應元件上的一類轉錄因子，對ABA的信號轉導起著重要作用[27-28]。VvABF2是一個與葡萄果實成熟相關且在細胞核中表達的ABEB/ABF-like轉錄因子，通過與下游基因啟動子上特定序列結合，激活下游基因表達；當VvABF2過表達時，受ABA調控的多個轉錄因子家族成員（DREB、WRKY和MYB等）上調；同時在VvABF2過表達的葡萄細胞懸浮系中Res含量增加，且ABA處理能夠增強此作用[18]。因此本試驗對將來研究ABA信號途徑調控Res的合成與積累具有重要意義。

綜上所述，在葡萄生產上可利用相應的栽培措施促進植物體內ABA積累增加，調控葡萄果實的成熟[29]，進而調控葡萄果實中Res的合成與積累，有利于促進果實營養物質的增加。