60Co-γ 射線輻照對(duì)利咽含漱液中木犀草苷含量的影響*

施崇精，李 萍，王 雋，蒲秋易，李 瑞，肖佳佳

（四川省成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川成都 610095）

利咽含漱液由錦燈籠、冰片、硼砂、赤石脂、兒茶、甘草組方，有清熱利咽、消腫止痛、涼血止血、收斂生肌功效，可用于治療口咽部腫痛、潰瘍、急慢性扁桃體炎等。輻照滅菌是利用γ射線，電子加速器產(chǎn)生的高能電子束，或者X 射線殺滅中藥中微生物的方式，可降低藥品生產(chǎn)過(guò)程中的微生物負(fù)載［1-4］。60Co-γ射線輻照是常用的藥品滅菌方法［5-6］，為此，本研究中建立了高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定方中君藥錦燈籠藥效成分木犀草苷的含量［7-9］，并進(jìn)一步考察了不同劑量60Co-γ射線輻照對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；BP -211D 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜中國(guó)＞有限公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

木犀草苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111720-201810，含量93.5%）；利咽含漱液（醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)分別為210501，210701，210702，210703）；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈- 0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/ V）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

取木犀草苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇，制成質(zhì)量濃度為47.385 μg / mL 的對(duì)照品溶液。精密量取樣品2 mL，置5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按利咽含漱液的處方及工藝制備缺錦燈籠的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰，理論板數(shù)按木犀草苷峰計(jì)大于5 000，分離度均大于1.5，基線分離良好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.LuteolosideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為47.385 8 μg/ mL），加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.895 4，4.738 6，18.954 3，28.431 5，47.385 8μg/mL的系列對(duì)照品溶液。精密量取10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=31.13X-15.793（r=0.999 7，n=5）。結(jié)果表明，木犀草苷質(zhì)量濃度在1.895 4～47.385 8 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限與定量限考察：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比（S/N）為3∶1 和10∶1 時(shí)的進(jìn)樣量作為檢測(cè)限及定量限。結(jié)果分別為0.2 ng和0.4 ng。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄木犀草苷峰面積。結(jié)果的RSD為0.58%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，1，2，3，6，9，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄木犀草苷峰面積。結(jié)果的RSD為1.26%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為210501）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果木犀草苷平均含量為19.857 0μg/mL，RSD為0.87%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取已知含量的樣品（批號(hào)210501）1 mL，共9 份，分別置5 mL 容量瓶中，精密加入對(duì)照品溶液0.5，1，1.5 mL，各3 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定（輻照前后）

取3批樣品，采用60Co-γ射線分別以6 kGy和10 kGy的劑量輻照，平行2次，即得輻照后的利咽含漱液樣品。取輻照前（0 kGy）后樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算木犀草苷含量。結(jié)果見表2，可見，輻照后樣品中木犀草苷含量明顯減少，且減少程度與輻照劑量呈正相關(guān)。考慮批間差異、藥材差異等的影響，利咽含漱液中木犀草苷的含量限度暫定為20μg/mL。

表2 輻照前后樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/mL，n=2）Tab.2 Results of content determination of luteoloside in samples before and after irradiation（μg/mL，n=2）

3 討論

隨著藥品監(jiān)管力度的加強(qiáng)，醫(yī)院制劑質(zhì)量控制要求日益提升，逐步從定性分析提升到定量分析，在保證藥品質(zhì)量方面起到了積極作用［10-12］。利咽含漱液組方中，錦燈籠清熱解毒、利咽，為君藥；冰片清熱止痛、消腫［13］，硼砂清熱解毒，共為臣藥；赤石脂收斂生肌［14］，兒茶收斂生肌、止血［15］，共為佐藥；甘草清熱解毒，緩急止痛，且能調(diào)和諸藥，為使藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，錦燈籠含生物堿、甾體類、黃酮及其苷類等多種成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等生物活性［16-17］。

木犀草苷為錦燈籠的藥效成分，多采用HPLC 法進(jìn)行含量測(cè)定。臣藥冰片難溶于水，且受熱易揮發(fā)，本工藝將冰片兌入冷卻的水煎液后混懸使用，不涉及提取轉(zhuǎn)移率的質(zhì)量控制，后期擬采用薄層色譜法進(jìn)行鑒別。臣藥硼砂多采用滴定法測(cè)定含量，但制劑測(cè)定存在顏色干擾；佐藥赤石脂無(wú)明確指標(biāo)成分；佐藥兒茶、使藥甘草用量占比較小，且有效成分在水提液中轉(zhuǎn)移率較低，在本色譜條件下難以有效測(cè)定，故均暫未納入指標(biāo)成分測(cè)定。

預(yù)試驗(yàn)中還分別對(duì)色譜柱、柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相進(jìn)行了耐用性試驗(yàn)考察。色譜柱考察了Agilent Zorbax Eclipse XDB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和Agilent Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）；柱溫考察了28，30，32 ℃；流速考察了0.9，1.0，1.1 mL / min；檢測(cè)波長(zhǎng)考察了345，350，355 nm；流動(dòng)相比例考察了乙腈- 0.1%磷酸水溶液（19∶81、20∶80、21∶79，V/V）。結(jié)果木犀草苷含量的RSD均小于3%，表明該方法耐用性良好。

綜上所述，本研究中建立的HPLC 法精密度高、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，適用于測(cè)定利咽含漱液中木犀草苷含量。但其含量經(jīng)60Co -γ射線輻照后會(huì)大幅下降，對(duì)制劑的有效性影響較大，宜考慮其他滅菌方法。