失笑散化學成分分析*

王 清，魏 星，陳佩東，曹雨誕△

（1. 南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京 210029； 2. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210023）

失笑散出自宋代《太平惠民和劑局方》，由蒲黃、五靈脂等量組方［1］，具有化瘀活血、散結止痛功效［2-3］，臨床常用于治療婦科痛經、月經失調和產后腹痛［4］。前期研究表明，失笑散可有效改善模型大鼠的缺氧狀態，降低其全血和血漿黏度，緩解血瘀癥狀。其機制可能是通過血管內皮生長因子A（VEGFA）通路產生作用，調節組織型一氧化氮合酶（eNOS）水平，從而促進一氧化氮（NO）釋放，并作用于環氧合酶2（COX - 2），繼而調節前列腺素E2（PGE2）水平，改變血管平滑肌的緊張狀態［5］。為進一步研究其效應-物質基礎，現采用超高效液相色譜串聯三重四極桿飛行時間質譜（UPLC - Q -TOF-MS）法分析其化學成分。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB SCIEX Triple TOFTM5600 型質譜儀（美國AB SCIEX公司）；LC-20A 型液相色譜儀，包含TF1.6 Analyst工作站及Peak View 分析軟件（日本Shimadzu 公司）；Micro CL21R 型高速冰凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；FA1104 型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司，精度為0.1 mg）；AUW120D 型電子天平（日本Shimadzu公司，精度為0.01 mg）；KQ-500B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16C 型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；JXFSTPRP-24型球磨儀（上海凈信實業發展有限公司）。

1.2 試藥

失笑散（本院實驗室自制）；異槲皮苷對照品（批號為111809-201403），原兒茶酸對照品（批號為110809-201205），沒食子酸對照品（批號為110831 - 201605），均購自中國食品藥品檢定研究院，含量均大于98%；兒茶素對照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號為PS1000-0100）；山柰酚3-O-新橙皮苷對照品（批號為X28A9L68907），香蒲新苷對照品（批號為Y14S8H43976），水仙苷對照品（批號為S08A8D33447），異鼠李素- 3 -O- 新橙皮苷對照品（批號為H30M3X1），紫云英苷對照品（批號為Y19M8H36474），對羥基苯甲酸對照品（批號為MKBK3576V），異鼠李素-3 -O- 葡萄糖苷對照品（批號為Y09J9H52567），蘆丁對照品（批號為Y22S6S3719），柚皮素對照品（批號為X21M7C11378），山柰酚對照品（批號為C26J8Y38642），槲皮素對照品（批號為C09S8Y43412），異鼠李素對照品（批號為P17S9F68615），均購自上海源葉生物科技有限公司，含量均大于98%；甲醇、乙腈、甲酸均為質譜純，其余試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。蒲黃藥材飲片（南通三越中藥飲片公司，批號為190504）；五靈脂藥材飲片（江西贛樹國家中藥飲片有限公司，批號為202201）。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Cortecs UPLC T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.6μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min時0 B →15%B，10～15 min時15% B →30% B，15～25 min 時30% B →50% B，30～33 min 時50%B →90%B，33～34 min 時90%B →15%B）；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為2μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正負離子模式，霧化器（GS1）氣壓為55 psi；氣簾氣（Gas）氣壓為40 psi；輔助加熱器（GS2）氣壓為55 psi；噴霧電壓（IS）為4 500 V；離子源溫度（TEM）為550 ℃；去簇電壓（DP）為-100 V；碰撞能量（CE）為- 40 V；掃描范圍為質荷比（m/z）50～1500。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取1.2項下16種對照品各適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇充分溶解后定容，即得。

供試品溶液：取蒲黃與五靈脂藥材飲片干燥粉末（分別過7 號篩和3 號篩）各0.5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）提取45 min，放冷至室溫，再次稱定質量，加甲醇補足減失的質量，吸取上清液置4 mL離心管中，4 ℃下13 000 r/ min 離心2 次，每次10 min，即得。4 ℃保存備用。

2.3 成分分析

鑒定：取2.2項下2種溶液各適量，按2.1項下試驗條件進樣測定，通過Peak View 及Origin 軟件分析后得總離子流圖，詳見圖1。由圖1 可見，樣品與單味組方藥的離子流圖有明顯差異，表明其所含化學成分存在明顯差異。結合文獻［6 - 11］及對照品的數據，在正負離子模式下鑒定出化學成分53 個，包括黃酮類32 個，有機酸類17 個，氨基酸類2 個，聚酮類、酚類各1 個，詳見表1。失笑散中富含黃酮類和有機酸類化學成分。由表1可見，在負離子模式下，有機酸類常出現脫羥基、羧基的碎片離子峰［12］，對羥基苯甲酸母離子為m/z138，脫去羥基、羧基后分別得到m/z121.031 1、m/z95.047 5的二級碎片。沒食子酸、原兒茶酸等也出現脫去羧基的碎片離子峰。

表1 失笑散化學成分分析信息Tab.1 Analysis of chemical constituents of Shixiao Powder

圖1 總離子流圖A1.Negative ion chromatograms of the mixed reference solution A2.Positive ion chromatograms of the mixed reference solution B1.Negative ion chromatograms of the test solution B2.Positive ion chromatograms of the test solution C1.Negative ion chromatograms of the test solution of Typhae Pollen C2.Positive ion chromatograms of the test solution of Typhae Pollen D1.Negative ion chromatograms of the test solution of Faeces Trogopteror D2.Positive ion chromatograms of the test solution of Faeces TrogopterorFig.1 Total ion chromatograms

解析：黃酮類化學成分有較明顯的分子離子峰，且常出現［M - H］-、［M - OH］-、［M - CH3］-、［M -CH3O］-及RDA 裂解的碎片離子峰［7］，如異鼠李素在負離子模式下，產生m/z315.051 3 的準分子離子峰，脫去1分子羥基，得到m/z299.030 3的碎片離子峰，脫去1 分子甲氧基，產生m/z283.028 4 的碎片離子峰，C 環發生RDA 裂解，得到m/z151.003 2 的碎片離子峰。對于黃酮苷類化學成分，則會出現脫糖基的碎片離子峰，從而有利于對苷類化合物的鑒定［9，12］，如香蒲新苷在負離子模式下可觀察到脫去鼠李糖基和葡萄糖基的碎片離子峰。山柰酚-3-O-葡萄糖苷（紫云英苷）在負離子模式下的準分子離子峰為447.094 2，脫去1 分子葡萄糖基得到m/z285.033 0 的碎片離子峰，在此基礎上C 環發生RDA 裂解產生m/z150.993 7 的碎片離子峰。聚酮類化合物如蘆葦醇C在二級質譜圖中出現脫羥基、脫羧基、支鏈斷裂的情況，與文獻［10］的報道一致。氨基酸類化學成分如苯丙氨酸在負離子模式下出現脫羧基和側鏈斷裂，詳見圖2。

圖2 不同化學成分的裂解途徑A.p - Hydroxybenzoic acid B.IsorhamnetinC.Typhaneoside D.Kaempferol - 3 - O - glucosideFig.2 Pyrolysis pathways of different chemical constituents

3 討論

失笑散由蒲黃和五靈脂組方，其中蒲黃性平，味甘，能行血消瘀；五靈脂性溫，味苦、咸、甘，能通利血脈、散瘀止痛，二者相須為用，為化瘀、散結、止痛的常用組合。現代藥理學研究證實，蒲黃、五靈脂能抗血小板聚集，加快微循環，興奮子宮平滑肌，加快瘀血排出。LIU等［13］的研究顯示，蒲黃中所含化合物主要有黃酮類、有機酸類、酯類及多糖類，五靈脂中則主要有黃酮類及萜類成分。本研究中納入失笑散組方藥材對應成分的16 個對照品，檢測到失笑散中化學成分53個，其中蒲黃中23個，五靈脂中14個，其余16個成分為兩者共有。進一步分析可知，蒲黃及其與五靈脂的共有化學成分以黃酮類為主，而五靈脂獨有化學成分以萜類為主，與以往的研究結果一致。該結果可為進一步研究失笑散的效應-物質基礎提供科學依據。