烏蘇酸對人胰腺癌細胞PANC-1 增殖和凋亡的影響

金俊華，趙承偉，付 佳，鄭桂茹△

（1. 浙江省金華市人民醫院藥劑科，浙江金華 321000； 2. 溫州醫科大學藥學院＜諸暨＞生物醫藥研究院，浙江諸暨 311800）

胰腺癌（PC）為惡性程度極高的腫瘤疾病，病情進展快，預后極差，5年生存率低于6%［1-2］。近年來，我國PC 總體發病率和死亡率均呈增長趨勢。有Ⅲ期臨床試驗報道，厄洛替尼聯合吉西他濱（GEM）較GEM 單藥治療的生存獲益顯著，患者的總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）均得到一定延長［3］，但獲益時間有限，且伴隨強烈的藥品不良反應。烏蘇酸（UA）又稱熊果酸，屬烏蘇烷型三萜類化合物，在植物中分布廣泛［4］。有研究表明，UA 主要從誘導腫瘤細胞凋亡［5］、自噬［6］，抑制腫瘤細胞轉移［7］、炎性反應［8］、上皮-間充質轉化［9］、腫瘤血管生成［10］，逆轉放射治療和化學藥物治療（簡稱放化療）藥物的耐藥性［11］，阻滯細胞周期［12］，調節免疫功能［13］等方面發揮抗腫瘤作用，但是對PC 的作用并不明確。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是細胞內重要的生存信號通路，其激活與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、化療耐藥性及血管生成密切相關［14］。抑制該通路的激活可阻止腫瘤細胞的生長、增殖，促進凋亡［15］。本研究旨在探討UA對人胰腺癌細胞PANC-1活性、遷移、增殖、凋亡等的影響，并研究PI3K/Akt/mTOR 信號通路在PC發生、發展中的作用，為開發PC治療新藥提供思路。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：MIKRO 200R/ 220R 型臺式離心機（德國Hettich 公司）；CKX41 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；INCO108-246型二氧化碳細胞培養箱（德國Memmert 公司）；Synergy 超純水系統（美國Millipore 公司）；1600 型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；IC1000 型細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；Synergy H1 型多功能酶標儀（美國BioTek 公司）；DK -S22 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；IMMULITE?2000 XPi 型免疫分析系統（西門子＜ 中國＞ 有限公司）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；AL104型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；GL-802A型臺式小型真空泵（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

試藥：UA（CAS：77 - 52 - 1，含量> 99%），二甲基亞砜（DMSO，CAS：67 - 68 - 5，含量> 99.9%），均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；GEM（美國Med-ChemExpress 公司，批號為HY-17026）；DMEM 培養基（美國Sigma公司，批號為D6429）；1%青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺、胎牛血清（美國Gibco 公司，批號分別為10378016，10099141C）；PI3K，磷酸化蛋白激酶B（p -Akt），Akt，磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR），mTOR，β - Actin、活化半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3），B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2），Bcl-2 關聯X 蛋白（Bax）一抗（美國Cell Signalling Technology 公司，批號分別為#4249，#4060，#5536，#9272，#2972，#3700，#9661，#4223，#2772）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（生工生物工程＜ 上海＞ 股份有限公司，批號為D110058）。

細胞：人胰腺癌細胞株PANC-1（中國科學院上海細胞庫）。

1.2 方法

細胞培養：細胞培養于含10%胎牛血清和1%青霉素- 鏈霉素雙抗的DMEM 培養基（以下簡稱培養基）中，置37 ℃及飽和濕度，5%CO2的條件下培養，待細胞貼壁生長2～3 d后釆用胰蛋白酶消化。

細胞活性：采用四氮唑鹽（MTT）法。取細胞，置96孔板中孵育（細胞密度3×103個/孔）。分別加入不同濃度的UA（1.25，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0μmol/L）和GEM（0.16，0.31，0.63，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0μmol / L）；對照細胞加入等體積的DMSO。設6 個復孔。培養24，48，72 h后加入5 mg/mL MTT溶液20μL，繼續培養4 h，吸去上清液，各組加入DMSO 150 μL，振蕩2 min 至晶體完全溶解。在570 nm 波長處檢測吸光度值（OD）。細胞存活率（%）=OD實驗細胞/OD對照細胞×100%。

細胞形態：取對數生長期的細胞，制成細胞密度為2 × 105個/mL 的混懸液，取1 mL 于12 孔板中，實驗設對照1 組（等體積DMSO），UA 低、中、高劑量組（5，10，20 μmol/L），各組細胞相應培養24 h 后，電子顯微鏡下觀察細胞形態學變化，并拍照記錄。

細胞增殖：采用集落形成實驗。取細胞，接種于6孔板中（細胞密度為1×103個/孔）。實驗分組同“細胞形態”項，各組細胞予相應處理，設置3個復孔。培養5 d后顯微鏡下觀察直徑大于0.5 mm的細胞集落數。

細胞遷移：采用細胞劃痕實驗。實驗設對照2組（等體積DMSO）和UA 組（10μmol/L）。取細胞，接種于6孔板中（細胞密度為5×105個/孔），待生長至80%匯合度時除去培養基，用20μL 移液槍頭末端刮擦產生劃痕，加入培養基，各組細胞予相應處理，分別培養48 h和72 h后，顯微鏡下觀察細胞的遷移情況。

蛋白表達水平：采用Western blot 法。實驗分組同“細胞形態”項，各組細胞予相應處理48 h，用胰蛋白酶消化并離心，加入細胞裂解緩沖液，冰上裂解細胞。4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清液。用BCA 法測定蛋白質含量，加入等體積2 × loading 緩沖液，混合并煮沸10 min使蛋白質變性，凝膠電泳后轉膜，封閉2 h，加入PI3K，p - Akt，Akt，p - mTOR，mTOR，Cleaved Caspase-3，Bcl-2，Bax，β-actin抗體（1∶1 000，V/V）4 ℃下過夜。以羊抗兔二抗（1∶5 000，V/V）室溫振搖1 h，洗膜3 次，置凝膠成像儀掃描成像，使用Image J 軟件分析條帶，以β-actin 條帶平均光密度為參考，計算目的蛋白的相對表達量。

分子對接模擬：從蛋白數據庫下載目標蛋白PI3K（PDB ID：3APD［16］）和Akt 2（PDB ID：3E8D［17］）用薛定諤分子對接軟件（2018 版）預處理蛋白，生成對接盒子，使用UA 結構進行模擬對接，查看評分結果，對接結果圖以PyMOL軟件導出或Ligand interaction鍵生成。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 10.0統計學軟件分析。計量資料以±s表示，行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞活性

GEM 和UA 對細胞活性的影響見圖1（因GEM 療效確切，故未進行48 h 及72 h 實驗）。可見，隨著UA 藥物濃度的升高，細胞活性逐漸減弱，且有劑量依賴性。在24 h 時，UA 的IC50為7.89 μmol / L，顯示出與上市藥物GEM（IC50= 2.20 μmol / L）相同數量級的腫瘤細胞活性抑制效果。UA 在48 h 和72 h 時的IC50分別為6.26μmol/L和5.06μmol/L。

圖1 細胞活性A.Gemcitabine B.Ursolic acidFig.1 Cell viability

2.2 細胞形態

對照1 組細胞形態正常，貼壁，呈不規則梭形或圓形，細胞生長狀態較好。UA 各劑量組細胞隨著濃度的增加，逐漸失去原有形態，變形細胞數量隨之增加，細胞邊界模糊不清，貼壁細胞數量變少，部分細胞懸浮于培養基中，細胞顯示出較差的生長特點。詳見圖2。

圖2 細胞形態Fig.2 Cell morphology

2.3 細胞增殖

與對照1 組比較，UA 各劑量組細胞數量均顯著減少（P＜0.05），且呈一定的濃度依賴性。詳見圖3。

圖3 細胞增殖能力A.Photos B.Data statisticsNote：Compared with those in the control group one，*P ＜ 0.05，**P ＜0.01（for Fig.3 and Fig.5 - 6）.Fig.3 Cell proliferation

2.4 細胞遷移

與對照2 組比較，UA 組細胞48 h 和72 h 的遷移距離縮短。詳見圖4。

圖4 細胞遷移情況Fig.4 Cell migration

2.5 相關蛋白表達水平

與對照1組比較，UA各劑量組細胞Cleaved Caspase-3及Bax 的表達水平均顯著升高（P＜0.05）；UA 中、高劑量組細胞Bcl - 2 表達水平均顯著降低（P＜ 0.05）；UA高劑量組細胞PI3K 表達水平，UA 中、高劑量組細胞p-Akt 表達水平，UA 各劑量組細胞p-mTOR 表達水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖5、圖6。

圖5 細胞中凋亡相關蛋白表達水平A.Electropherograms B.Data statisticsFig.5 Expression levels of apoptosis - related proteins in cells

圖6 細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達水平A1，A2.Electropherograms B.Data statisticsFig.6 Expression levels of PI3K / Akt / mTOR signaling pathway - related proteins in cells

2.6 分子對接

結果見圖7。可見，UA 中的烏蘇烷型三萜類結構可進入PI3K 與Akt2中三磷酸腺苷（ATP）結合位點競爭性結合疏水口袋，從而影響PI3K，Akt2 蛋白與ATP 的結合，抑制其激活。其中UA 結構中的羧酸部分，可與PI3K蛋白中的Lys890，Thr887 產生氫鍵相互作用。UA 中的羥基部分也可與Akt2中的Asp293產生氫鍵相互作用。

圖7 分子對接結果A.Ursolic acid and PI3K B.Ursolic acid and Akt2Fig.7 Results of molecular docking

3 討論

PC 的發病率與死亡率相近，僅20%的患者可通過手術切除獲得長期生存［18］。PC 相較于其他實體腫瘤具有解剖結構特殊、富間質、高度異質性、細胞惡性潛能大及腫瘤代謝模式異常等特點。臨床治療PC 的主要手段是手術切除，但切除后仍有復發的可能。非手術療法有放療、化療、靶向藥物治療及傳統中醫藥輔助治療［19-20］。免疫療法、內分泌療法作為新興的治療手段［21］，其療效并不確定。故臨床迫切需要開發新型PC治療藥物和方法來提升PC 的治療效果。中醫藥作為腫瘤輔助聯合治療的重要組成部分，有其獨特的治療優勢。UA 由于抗瘤譜廣，對正常細胞毒性低，同時具有免疫增強功能，其抗腫瘤作用日益受到關注［22］。本研究結果顯示，極低濃度GEM 和UA 有可能促進細胞增殖；UA具有抑制PANC- 1 細胞活性的效果，且在DMEM 培養基中培養24 h 的IC50與GEM 處在同一個數量級；且UA可影響PANC-1細胞形態，誘導其凋亡，抑制增殖。

PI3K/ Akt/ mTOR 信號通路的作用機制包括細胞受生長因子等的刺激后，PI3K 激活并聚集到細胞膜上，將其底物3，4 - 二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉化為3，4，5 - 二磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3 再激活其下游的Akt 蛋白等。PIP3 通過與Akt 的PH 結構域相互作用，聚集Akt 到細胞膜上，并通過3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK-1）將其Thr308 和羧基端的Ser473 位點同時磷酸化，激活后的p-Akt蛋白再轉移，通過直接或間接途徑激活下游的mTOR，調節蛋白質合成，基因轉錄等，從而達到對細胞生存和凋亡的調控［23］。隨著研究的不斷深入，PI3K/Akt/mTOR 信號通路所涉及的多種下游信號分子在許多常見腫瘤的發生、發展過程中的重要角色也日益凸顯，針對該信號通路的關鍵分子靶點的腫瘤治療策略令人期待［24］。本研究結果顯示，UA 能降低PANC - 1 細胞中PI3K，p - Akt，p - mTOR 的蛋白表達水平，抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路的激活影響腫瘤功能，以及上調凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3和Bax，下調Bcl-2誘導PANC-1細胞的凋亡。分子對接結果發現，UA中的烏蘇烷型三萜類結構可與PI3K和Akt2蛋白相互作用，從而影響蛋白質功能，抑制其激活。

綜上所述，UA 作為多靶點抗腫瘤天然產物，在體外能顯著抑制PANC-1細胞的增殖，誘導細胞凋亡，抑制細胞遷移，其機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路的激活和影響凋亡相關蛋白Cleaved Caspase - 3，Bax，Bcl-2表達相關。