骨寶膠囊對糖皮質激素誘導骨質疏松大鼠骨密度、骨微結構的影響

郭金星，田增輝，盛夏，郝延科

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014）

糖皮質激素性骨質疏松癥（glucocorticoidinduced osteoporosis，GIOP）是一種以骨丟失、骨量減少、骨組織微結構破壞為特點的繼發性骨質疏松癥，是長期或高劑量糖皮質激素（glucocorticoids，GC）使用后最常見的不良反應之一［1-2］。目前GIOP的治療以促進骨生成，抑制骨破壞的西藥治療為主，但其弊端正逐漸被世人認知，造成諸多不良反應。流行病學調查顯示，風濕性疾病患者骨質疏松癥發病率高達80%以上，且骨量下降與GC累積使用時間呈正相關，但我國GIOP患者使用抗骨質疏松藥物尚未規范，約1/3的患者從未接受任何治療，從而導致骨折風險增加［3］。

中醫學對GC雖無明確記載，但《素問·陰陽應象大論》中提到“壯火食氣，少火生氣”，意為“壯火之品”易致氣血虧虛，“少火之品”令人氣血旺盛［4］。中醫將GC歸為 “壯火之品”，初用耗氣傷津，久之則損傷臟腑、氣血、陰陽［5］。

關于GIOP的治療一直是藥物研究的熱點問題，骨寶膠囊作為山東中醫藥大學附屬醫院制劑科經典自制藥，已經在臨床上得到廣泛應用，早期研究表明，長期服用可改善GIOP（肝腎不足證）［6］。本次實驗研究旨在通過觀察骨寶膠囊對GC誘導下骨質疏松大鼠的影響，進一步明確骨寶膠囊在GIOP中對提高骨密度、改善骨微結構的療效，為今后骨寶膠囊在臨床上對GIOP患者的應用提供有力證據。

1 材料

1.1 實驗動物

3月齡SPF級雄性Wistar 大鼠40只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK（京）2021-0006，體質量（200±20）g。所有動物均在山東中醫藥大學SPF級動物實驗中心飼養，并且在清潔、干燥、通風、恒溫、相對濕度（50±5）℃的適宜條件下進行飲食，實驗所需飼料、凈化水、墊料均由山東中醫藥大學實驗動物中心提供。本實驗符合規范并通過了山東中醫藥大學實驗動物福利倫理審查，批準文號：SDUTCM20220314001，并在實驗中心指導下開展實驗。

1.2 實驗藥物

骨寶膠囊（規格：0.25 g/粒、批號：Z01080550），由鹿角膠、骨碎補、淫羊藿、白芍、當歸、甘草組成，上述藥材均由山東中醫藥大學附屬醫院制劑科嚴格按照工藝制備而成；地塞米松磷酸鈉注射液（規格：1 mL∶5 mg，批號：H14022567，石藥銀湖制藥有限公司）；鈣爾奇D（規格：600 mg/片、批號：H10950029，惠氏制藥有限公司）。

1.3 試劑與儀器

血清鈣、血清磷、堿性磷酸酶測定試劑盒（批號：2022003、2022004、2021003，長春匯力）；無水乙醇、二甲苯（批號：100092683、10023418，國藥集團化學試劑有限公司）。

離心機（型號：Centrifuge 5810 R型，德國Eppendorf）；烤箱（型號：GFL-230型，天津市萊玻瑞儀器設備有限公司）；臥式冷凍箱（型號：BCD-318AT型，中科美菱）；Micro-CT（型號：SkyScan 1276型，德國Bruker）；全自動生化分析儀（型號：Chemray 240型，深圳雷杜生命科技）；電子天平（型號：ME203E/02型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；實驗室超純水機（型號：AK-RO-C2型，艾肯水精靈）；包埋機（型號：JB-P5型，武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（型號：RM2016型，上海徠卡儀器有限公司）；正置光學顯微鏡（型號：Eclipse E100，日本尼康）。

2 方法

2.1 實驗分組、造模、給藥、取材

對40只健康3月齡的雄性Wistar大鼠進行適應性飼養，1周內無死亡及其他異常后，隨機分為空白組、模型組、給藥組（骨寶膠囊）和對照組（鈣爾奇D），每組10只。除空白組外，其余3組采用腹腔注射方式注射地塞米松磷酸鈉注射液（2.5 mg/kg），空白組予以等體積0.9%氯化鈉注射液（2.5 mL/kg）腹腔注射，每周2次（周二，周五），為期8周。8周后各組隨機選擇3只大鼠進行CT檢測，發現造模組較空白組骨密度較低，骨小梁稀疏，排列不均勻，提示造模成功。將藥物溶于蒸餾水配制相應濃度的灌胃溶液，冷藏保存，上午8時給藥，1次/d，給藥劑量參照藥理學標準體重動物的mg/kg劑量折算表［7］，給藥組給予0.4 g/（kg·d）骨寶膠囊，對照組給予60 mg/（kg·d）鈣爾奇D，空白組、造模組予以等體積生理鹽水灌胃，連續12周，所有動物灌胃體積均為1 mL/kg。灌胃結束后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉，觀察大鼠，待大鼠對外界刺激無應答麻醉完全后取材。

2.2 樣本采集及檢測

2.2.1 血清ELISA檢測

腹主動脈取血，將全血標本放于室溫靜置，2 h后置入離心機，4 ℃低溫離心30 min（3 000 r/min），移液槍提取上清，EP管密封后置于-20 ℃冰箱中待測。按血鈣、磷、堿性磷酸酶生化ELISA檢測試劑盒要求進行檢測，用全自動生化分析儀進行數據分析。

2.2.2 骨密度的測量和Micro-CT

取左側股骨，仔細剔除附著肌肉和軟組織，剝離完全后組織固定液固定，采用Micro-CT掃描，利用NRecon三維重建圖像，使用 CT Analyser分析選定區域。統一標準后，測得骨密度（BMD）、骨體積比（BV/TV）、骨小梁數（Tb.N）和骨小梁分離度（Tb.Sp）等參數。

2.2.3 蘇木精-伊紅染色

取右側股骨，用生理鹽水清洗，并于甲醛溶液中固定48 h。脫鈣液脫鈣后每3 d更換一次液體，石蠟包埋后切片，按常規蘇木精-伊紅染色步驟：石蠟切片脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片，顯微鏡下觀察分析組織病理學變化。

2.3 統計學方法

使用Microsoft Excel進行記錄和格式整理，SPSS25.0和GraphPad Prism9.0軟件對所有數據進行統計分析。實驗結果用±s表示，判斷數據是否服從正態分布，若具備正態分布且方差齊，則采用單因素方差分析（one-way-ANOVA），若服從正態分布但方差不齊則采用非參數檢驗。P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組血清生化指標的比較

模型組大鼠血鈣水平明顯低于空白組（P＜0.05），給藥組和對照組血鈣水平均有顯著提高（P＜0.05）。模型組血磷、堿性磷酸酶與空白組比較無統計學意義（P＞ 0.05），給藥組血磷、堿性磷酸酶與模型組比較無統計學意義（P＞ 0.05）。見表1。

表1 各組血清生化指標比較（±s）

表1 各組血清生化指標比較（±s）

注：與空白組比較，△P ＜ 0.05；與模型組比較，▲P ＜ 0.05。

組別空白組模型組給藥組對照組堿性磷酸酶/（U/mL）134.72±20.81 128.14±23.55 136.19±33.10 118.38±26.66 n7 7 7 7血鈣/（mmol/L）2.06±0.06 1.91±0.01△2.07±0.05▲2.09±0.05▲血磷/（mmol/L）1.86±0.15 1.82±0.11 1.78±0.18 1.84±0.20

3.2 各組骨密度相關參數

模型組大鼠BMD明顯低于空白組（P＜ 0.05），說明糖皮質激素誘導骨質疏松大鼠模型成功。給藥組BMD較模型組有顯著提高（P＜ 0.05），而給藥組與對照組BMD水平比較無統計學意義（P＞ 0.05），說明骨寶膠囊和鈣爾奇D對治療骨質疏松均有不錯療效。模型組大鼠BV/TV、Tb.N和Tb.Sp較空白組明顯降低（P＜ 0.05）。與模型組相比，給藥組BV/TV、Tb.N提升顯著（P＜ 0.05），Tb.Sp下降明顯（P＜ 0.05）。與對照組比較，給藥組BV/TV顯著升高 （P＜ 0.05），而Tb.N、Tb.Sp無統計學意義（P＞ 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠股骨骨密度、骨相關參數比較（±s）

表2 各組大鼠股骨骨密度、骨相關參數比較（±s）

注：與空白組比較，△P ＜ 0.05；與模型組比較，▲P ＜ 0.05；與對照組比較，*P ＜ 0.05。

組別空白組模型組給藥組對照組n7 7 7 7 BMD/（g/cm3）0.41±0.06 0.15±0.06△0.38±0.06▲0.36±0.02▲BV/TV/%36.79±2.96 12.64±6.13△67.13±5.02▲*52.87±2.01▲Tb.N/（L/mm）2.85±0.57 0.91±0.44△3.81±0.21▲3.78±0.12▲Tb.Sp/mm 0.17±0.05 0.84±0.41△0.16±0.03▲0.18±0.03▲

3.3 Micro-CT掃描圖像

Micro-CT圖像顯示模型組骨小梁數目缺失、變細、形態不規則、連續性下降、排列稀疏、間距變大，總體呈稀疏狀骨微結構。給藥組與對照組骨小梁數目增加、變粗、形態完整、連續性較好、排列緊密，間隙縮小，已接近空白組骨小梁微結構，這說明骨寶膠囊和鈣爾奇D均能改善骨微結構。見圖1。

圖1 各組Micro-CT股骨遠端掃描圖像

3.4 Micro-CT三維重建

三維重建圖像顯示模型組骨小梁數量明顯減少、骨小梁排列稀疏，骨髓腔內出現顯著空虛，骨小梁網狀結構缺失。給藥組與對照組骨髓腔較為充實，骨小梁數量明顯增加，骨小梁排列緊密，骨小梁間隙較小，骨小梁網狀結構重現，可見骨寶膠囊和鈣爾奇D均能顯著改善骨微結構，其中給藥組改善效果整體略優于對照組。見圖2。

3.5 蘇木精-伊紅染色

模型組的骨小梁數目減少、厚度變薄、面積比低、連續性差、排列紊亂、骨質疏松特征顯著?？瞻捉M松質骨豐富，骨小梁數目多、排列緊密、連續性好、骨組織結構完整、壁厚均勻。與模型組相比，給藥組和對照組骨小梁結構均較為完整，紋理排列緊密?？傮w而言，給藥組和對照組兩組的骨小梁和松質骨的狀態均優于模型組。見圖3。

圖3 各組HE染色結果（×100，標尺200 mm）

4 討論

糖皮質激素（GC）臨床上主要用于治療過敏性疾病、自身免疫性疾病、器官移植后狀態等。但長期應用容易導致糖皮質激素性骨質疏松（GIOP）的發生，應引起臨床醫生的重視［8］。近年來，GIOP受到廣泛關注，但是如何規范防治仍是目前亟待解決的難題。中醫學將GIOP歸為“骨痿”“骨痹”“腰痛”范疇，把外源性藥物GC歸為“藥邪”“壯火之品”。長期大量使用外源性GC必然會傷及人體。初期會助陽生熱，日久則真陰損傷而表現為陰虛陽亢，虛火內動，灼傷陰精，精不足則化骨無源［9］；中期陰精耗損，陽隨陰衰，陽氣虛衰則筋骨痿軟［10］；后期則陰陽俱衰，正氣虧損，五臟六腑元氣衰微，腎精化生無源，氣血精髓無法濡養筋骨而致骨枯而痿［11］。

山東中醫藥大學附屬醫院內分泌專家張洪，師從全國名老中醫程益春先生，作為學術繼承人研究老年人病理、生理和臨床特點，從肝腎入手，精選藥物研制成骨寶膠囊。骨寶膠囊方中鹿角膠為君，味咸性溫，能補肝腎、益精血、強筋骨；骨碎補為臣，入肝腎經，長于補腎壯骨，續筋止痛；白芍、當歸為佐，其中白芍配甘草，酸甘化陰，既能制約壯火之品導致的陰陽失衡，又能緩急止痛。當歸能養血補血，且兼能活血化瘀，通行血脈減輕肢體疼痛。諸藥配伍，補益肝腎，強筋壯骨，對因骨質疏松而引起的疼痛癥狀改善明顯。盡管骨寶膠囊已取得較好的臨床效果［12］，但其防治GIOP的效果尚未被證實。為此本研究通過動物實驗成功造出糖皮質激素性骨質疏松Wistar大鼠模型，并應用骨寶膠囊干預，同時與臨床常用藥物鈣爾奇D相比較。

本次實驗生化結果發現，給藥組大鼠血生化指標中，血清鈣水平有顯著提高，血清磷、堿性磷酸酶則與空白組、模型組相比差異不明顯。馮佳等［13］通過實驗研究對比了去勢、糖皮質激素、維甲酸誘導不同造模方式下對血清生化指數的影響，結果顯示糖皮質激素造模方式與正常組對比，血清磷、堿性磷酸酶無顯著差異，與本研究結果相一致。骨密度是診斷骨質疏松癥的金標準，可反映骨骼的礦物質水平［14］。GIOP大鼠模型造模成功后，骨密度顯著低于空白組。不同藥物干預后，各組大鼠骨密度均有提高，證明骨寶膠囊和鈣爾奇D可以有效地改善糖皮質激素性骨質疏松。

Micro-CT技術是一種敏感且可靠的定量定性分析技術，可用于分析骨骼骨礦含量及重塑骨骼微細結構［15］，本實驗采用Micro-CT技術對大鼠股骨進行分析，研究發現與模型組比較，給藥組顯著升高了BV/TV、Tb.N，且Tb.Sp明顯降低，骨小梁數量增多、排列結構整齊，骨質改善效果更佳。說明骨寶膠囊不僅可以提高GIOP大鼠的骨密度，還可以改善其骨微細結構，有效預防GIOP的發生。此外，HE染色中給藥組也有良好表現，給藥組骨小梁數量增加、密度增大，且具有連續性，反映出骨密度較高，對糖皮質激素性Wistar大鼠骨質疏松狀況改善顯著。

同時，本研究存在一定不足，各組樣本量較小，對研究結果可能存在一定的影響；對骨密度、骨微結構、骨代謝角度研究較多，缺乏骨寶膠囊治療GIOP靶點通路的深入探究。

綜上，本研究成功建立糖皮質激素誘導的骨質疏松大鼠模型，骨寶膠囊對其進行干預后，從血清生化指標、骨密度相關參數、Micro-CT、三維重建和組織病理學染色多方面評估骨寶膠囊對大鼠骨質疏松的影響，相較以往臨床試驗而言，本研究通過體內實驗發現骨寶膠囊能明顯改善糖皮質激素誘導大鼠的骨質疏松，不僅能為GIOP相關動物實驗研究提供參考，還為骨寶膠囊在臨床中的應用提供數據支撐及理論依據。