強志組方調控PI3K/Akt/TNF-α信號通路干預抽動障礙的實驗研究

詹婷，姜韞赟，王妹，靳無菲，李婷，閻兆君

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014）

抽動障礙（tic disorder，TD）是一類常見于兒童與青少年的突然的、反復出現(xiàn)的、無節(jié)律的以運動或發(fā)聲為主的神經(jīng)精神障礙性疾病［1］。本病病情復雜，常伴注意力缺陷多動障礙、強迫障礙、睡眠障礙等，對患者的生活質量與身心健康造成不良影響。最新的全國精神病學流行病學調查結果顯示，我國兒童及青少年抽動障礙的發(fā)病率為2.5%，且發(fā)病率呈上升趨勢［2］。西醫(yī)以藥物治療為主，但患者治療后不良反應及復發(fā)率較高，遠期預后較差［3］，而中醫(yī)藥治療具有不良反應小、無依賴性的優(yōu)點，在臨床運用廣泛。閻兆君教授在研究中醫(yī)文獻和長期臨床實踐基礎上，基于《黃帝內經(jīng)》從志意辨證角度出發(fā)，提出TD患者病機為“腎志不足”，以益腎強志為主要治法，自擬強志組方治療TD患兒。強志組方由制巴戟天、制遠志、清半夏、山藥、木香、茯神、生白術組成，具有強志定意、安魂助勇的功效［4］。Meta分析結果顯示，強志組方治療TD具有較好療效［5］。網(wǎng)絡藥理學研究顯示，強志組方主要作用在多巴胺系統(tǒng)、感染、炎癥反應以及miRNA通路，PI3K/Akt、雌激素、腫瘤壞死因子信號通路三個重要途徑參與強志組方對TD的治療［6］。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/腫瘤壞死因子（TNF-α）信號通路與TD的關聯(lián)已在實驗中得到驗證［7］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，強志組方通過作用于大鼠DA、NE系統(tǒng)，能明顯緩解大鼠的抽動癥狀與刻板行為［8-9］。為進一步研究強志組方治療TD的作用機制，本研究以PI3K/Akt/TNF-α信號通路為出發(fā)點，探究TD的發(fā)病機制，進一步研究強志組方通過PI3K/Akt/TNF-α信號對TD模型大鼠的影響，為強志組方的臨床運用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠 42只（北京維通利華實驗動物有限公司），3～8周齡，體質量（200±20）g，實驗動物使用許可證號：SCXK（京）2021-0011。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物房，溫度（23±2）℃，濕度（55±5）%，12 h光照/黑暗循環(huán)（08：00～20：00），自由進食飲水，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。本實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學動物實驗倫理審查委員會批準（倫理批號：SDUTCM20220224001）。

1.2 藥物

強志組方組成：制巴戟天9 g，制遠志9 g，清半夏9 g，山藥24 g，木香6 g，茯神24 g，生白術18 g；飲片由亳州市滬譙藥業(yè)有限公司提供。使用純水浸泡飲片30 min后置于砂鍋內，加入藥材5倍量的水，煎煮2次，每次30 min。將2次藥液混合，制備成含生藥量為1 g/mL的藥液，保存于4 ℃冰箱備用。鹽酸硫必利片（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號：LY210105），藥物研磨成粉后，制備成0.1 mg/mL的硫必利混懸液。亞氨基二丙腈（iminodipropionitrile，IDPN）（美國Sigma公司，批號：317306），將IDPN溶液稀釋至30 mg/mL備用。

1.3 主要試劑與儀器

BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0010S）；RIPA組織/細胞裂解液、脫脂奶粉（北京索萊寶科技有限公司，貨號：R0020、D8340）；磷酸酶抑制劑（美國APEXBIO公司，貨號：K1015）；PVDF 膜（德國 Millipore公司，貨號：IPVH00005）；PI3K、Akt、p-Akt、TNF-α兔單克隆抗體（英國Abcam公司，貨號：ab191606、ab179463、ab192623、ab205587）；GAPDH 兔多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：10494-1-AP）；辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體（北京中衫金橋有限公司，貨號：ZB2301）；ECL超靈敏化學發(fā)光檢測試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號：SQ202）；多色熒光成像系統(tǒng)（美國GE公司，型號：GE Amersham Imager600）；總RNA提取試劑（Biosharp生物公司，貨號：BS259A）；快速逆轉錄試劑盒（上海奕衫生物科技有限公司，貨號：RT001）；SYBR Green Fast qPCR Mix（ABclonal生物科技有限公司，貨號：RX21203）；PI3K、Akt、TNF-α引物（上海生工生物工程股份有限公司，貨號：2413357427、2413357429、2413357431）；TNFα、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號：JL13202、JL20884）；SuperMaze動物行為分析系統(tǒng)（上海欣軟有限公司，型號：XR-Xmaze）；紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司，型號：NANODROP 2000）；PCR儀（美國BIO-RAD公司，型號：T100）；全波長酶標儀（美國BioTek公司，型號：BioTek Cytation5）。

2 方法

2.1 動物模型復制及評價

采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為空白組（7只）與造模組（35只）。除空白組外，其余大鼠依據(jù)文獻［10］的方法腹腔注射IDPN 300 mg/（kg·d）制備模型，連續(xù)7 d。根據(jù)文獻［11-12］中對造模組大鼠進行刻板行為與運動行為進行評分，評分 ≥ 2分時，說明大鼠造模成功。

2.2 動物分組與給藥

造模成功后的大鼠隨機分為模型組、硫必利組和強志組方低、中、高劑量組，每組7只。按照人鼠等效劑量換算［13］，強志組方低、中、高劑量組分別按照4.455、8.91、17.82 g/（kg·d）劑量灌胃強志組方水煎液，硫必利組給予0.027 g/（kg·d）硫必利混懸液，空白組與模型組大鼠給予等劑量生理鹽水，連續(xù)干預28 d。

2.3 行為學測試

2.3.1 運動行為評分

參考文獻中［11］的評分方法，在造模前、造模后、灌胃28 d后對大鼠進行運動行為評分。先用75%乙醇清潔鼠籠，將大鼠放入鼠籠內適應10 min。采用雙盲法，由兩名不知道動物分組信息的實驗人員觀察20 min，并記錄評分，最終結果取兩名實驗人員評分的平均值。0分：安靜或正常活動；1分：過度興奮表現(xiàn)；2分：探索行為增加，不連續(xù)吸鼻；3分：不停跑動；4分：不停跑動伴驚跳。

2.3.2 刻板行為評分

根據(jù)Diamond等［12］的方法，在造模前、造模后、灌胃28 d后對大鼠進行刻板行為評分。先用75%乙醇清潔鼠籠，將大鼠放入清潔干燥的鼠籠里適應10 min，采用雙盲法，由兩名不知道動物分組信息的實驗人員觀察20 min，并記錄評分，最終結果取兩名實驗人員評分的平均值。0 分：無刻板行為；1 分：旋轉行為；2 分：頭和頸部過多垂直運動；3 分：頭、頸部的垂直運動和旋轉行為；4 分：頭部側擺合并頭頸部的垂直運動過多。

2.4 標本采集

末次給藥后，大鼠禁食不禁水8 h，采用2%戊巴比妥鈉，2 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。大鼠腹主動脈取血4 mL，靜置后離心備用。將大鼠斷頭，冰盒上剝離雙側紋狀體組織，急投液氮，取材完成后放入-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)檢測。

2.5 Western blot檢測大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α蛋白表達水平

將紋狀體組織稱重后加入組織裂解液、PMSF、磷酸酶抑制劑，放入鋼珠后研磨提取蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，根據(jù)濃度，加入5×loading buffer與PBS，金屬浴95 ℃加熱5 min使其變性后備用。采用制膠試劑盒制膠后，準備電泳，依次上樣各組蛋白樣本與Marker。電泳結束后采用濕轉法轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST沖洗后裁膜放入一抗PI3K、Akt、p-Akt、TNF-α、GAPDH（1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育過夜后。TBST沖洗3次，室溫二抗搖床孵育1 h。TBST沖洗3次后，均勻滴加ECL顯影液后進行顯影，以全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描。用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內參，目的蛋白灰度值比上內參灰度值即樣本蛋白的相對表達量，磷酸化指標用磷酸化蛋白比上總蛋白計算該蛋白的表達是否改變。

2.6 qPCR檢測大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達水平

稱取10～20 mg的紋狀體組織置于研磨管，TRIZOL法提取RNA，Nanodrop檢測其濃度，使用快速逆轉錄試劑盒配制反應體系，將RNA反轉錄為cDNA，引物由上海生工有限公司設計合成，見表1。按照說明書，設定程序進行于實時熒光定量PCR儀中進行擴增，反應程序如下：95 ℃預變性 3 min，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，45個循環(huán)；60 ℃ 30 s，45個循環(huán)。反應完成得到CT值，將GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCT法計算出樣本mRNA相對表達量。

表1 PCR引物序列

ΔCT=目的基因CT值 - 內參基因CT值

ΔΔCT=實驗組ΔCT值 - 對照組ΔCT

2.7 ELISA檢測大鼠血清IL-6、TNF-α含量

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒測定。血液樣本稀釋5倍后待用，將標準品按照說明書進行梯度稀釋，加樣后，37 ℃恒溫箱內孵育1 h后棄液。每孔加入抗體工作液，孵育1 h后棄液，洗板3次。每孔加入濃縮酶結合物，孵育1 h后棄液，洗板5次。加入底物，避光孵育1 h，加入終止液，在酶標儀450 nm處測得各孔OD值。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS27.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，三個及以上獨立樣本均值差異采用F檢驗（單因素方差分析），結果P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠行為學結果比較

3.1.1 運動行為評分比較

造模后，與空白組比較，造模組大鼠出現(xiàn)異常運動行為。藥物干預28 d后，與模型組比較，硫必利組與強志組方各劑量組大鼠運動行為評分顯著降低（P＜0.001）。見表2。

表2 各組大鼠運動行為評分比較（±s，分）

表2 各組大鼠運動行為評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，***P ＜ 0.001；與模型組比較，###P ＜ 0.001。

組別空白組模型組硫必利組強志組方低劑量組強志組方中劑量組強志組方高劑量組造模28 d后0 3.23±0.40 2.19±0.25###2.41±0.37###1.96±0.34###1.93±0.37###n7 7 7 7 7 7造模前0 0 0 0 0 0造模后0 2.86±0.30***2.89±0.33***2.89±0.20***2.82±0.27***2.93±0.34***

3.1.2 刻板行為評分比較

造模前，各組大鼠未發(fā)現(xiàn)刻板行為。造模后，除空白組外其余各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的刻板行為。藥物干預28 d后，與模型組比較，硫必利組、強志組方各劑量組大鼠刻板行為評分降低（P＜ 0.05）。見表3。

表3 各組大鼠刻板行為評分比較（±s，分）

表3 各組大鼠刻板行為評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，***P ＜ 0.001；與模型組比較，#P ＜ 0.05。

造模前造模28 d后0 2.71±0.43#2.23±0.42#2.23±0.37#2.21±0.38#2.23±0.49#組別空白組模型組硫必利組強志組方低劑量組強志組方中劑量組強志組方高劑量組n7 7 7 7 7 7 0 0 0 0 0 0造模后0 2.60±0.42***2.70±0.39***2.91±0.32***2.90±0.37***2.81±0.28***

3.2 各組大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α蛋白表達水平比較

與空白組比較，模型組大鼠紋狀體PI3K、TNF-α蛋白表達水平及p-Akt/Akt磷酸化水平升高（P＜0.01，P＜ 0.001，P＜ 0.05）。與模型組比較，強志組方低劑量組的大鼠紋狀體PI3K、TNF-α蛋白表達水平降低（P＜ 0.05），p-Akt/Akt磷酸化水平有降低趨勢（P＞ 0.05）；強志組方中、高劑量組大鼠紋狀體PI3K、TNF-α蛋白及p-Akt/Akt磷酸化表達水平降低（P＜0.001，P＜ 0.05），硫必利組紋狀體蛋白表達水平無明顯變化。見表4。

表4 各組大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與模型組比較，#P ＜ 0.05，###P ＜ 0.001。

TNF-α/GAPDH 0.72±0.08 1.06±0.07***0.92±0.17 0.84±0.09#0.87±0.06#0.87±0.08#組別空白組模型組硫必利組強志組方低劑量組強志組方中劑量組強志組方高劑量組n3 3 3 3 3 3 PI3K/GAPDH 0.94±0.18 1.29±0.13**1.14±0.09 1.03±0.09#0.85±0.11###0.77±0.21###p-Akt/Akt 0.78±0.10 1.07±0.06*0.96±0.26 0.94±0.11 0.70±0.11#0.79±0.20#

3.3 各組大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達水平比較

與空白組比較，模型組紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達水平升高（P＜ 0.001，P＜ 0.01，P＜ 0.05）；與模型組比較，強志組方低劑量組紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達水平降低（P＜ 0.05），強志組方中劑量組與高劑量組紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達水平降低（P＜ 0.01，P＜ 0.05），硫必利組紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表5。

表5 各組大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達水平比較（±s）

表5 各組大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

TNF-α 1.00±0.10 1.18±0.11*1.16±0.12 0.98±0.09#0.96±0.03#0.97±0.06#組別空白組模型組硫必利組強志組方低劑量組強志組方中劑量組強志組方高劑量組n3 3 3 3 3 3 PI3K 0.45±0.02 1.05±0.12***0.96±0.06 0.88±0.06#0.84±0.08##0.86±0.02##Akt 1.00±0.04 1.26±0.13**1.17±0.09 1.05±0.09#1.01±0.10##1.03±0.04##

3.4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α含量升高（P＜ 0.001，P＜ 0.01）。與模型組比較，硫必利組血清IL-6含量降低（P＜ 0.01），TNF-α水平無明顯變化（P＞ 0.05）；與模型組比較，強志組方各劑量組血清IL-6含量降低（P＜ 0.001）；強志組方低、中、高劑量組血清TNF-α含量降低（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。見表6。

表6 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較（±s）

表6 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001。

TNF-α 5.03±0.61 6.74±0.48**7.38±0.43 5.31±0.24##4.84±0.73##5.47±1.00#組別空白組模型組硫必利組強志組方低劑量組強志組方中劑量組強志組方高劑量組n4 4 4 4 4 4 IL-6 12.92±1.71 58.94±5.01***44.83±6.56##33.47±3.04###27.22±8.15###30.34±3.37###

4 討論

TD是一類不自主的、快速的、無節(jié)律的，以運動抽動或發(fā)聲抽動為主要表現(xiàn)的神經(jīng)精神障礙。西醫(yī)治療TD以藥物為主，包括DA受體阻滯劑、DA系統(tǒng)穩(wěn)定劑、選擇性單胺能拮抗劑、中樞性α受體激動劑、抗癲癇藥等，但復發(fā)率高，不良反應明顯。硫必利是目前治療TD的一線藥物，臨床使用過程中發(fā)現(xiàn)其有頭暈、惡心、乏力，嗜睡等不良反應［14］。

圖1 蛋白電泳圖

中醫(yī)學并無TD的病名，據(jù)TD臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于“瘛疭”“慢驚風”范疇。《靈樞·本藏》言：“志意者，所以御精神，收魂魄，適寒溫，和喜怒者也”“志意和則精神專直，魂魄不散，悔怒不起，五臟不受邪”。志意調和者，能夠正常馭收精神與魂魄活動，對外界環(huán)境變化的感知適應能力強，從而免受邪氣的侵襲。《內經(jīng)》早已明確了志意在精神、動作、行為駕馭、馭收、發(fā)用及對內外環(huán)境的感知、反饋、調適的生理作用［15］。閻兆君教授以《內經(jīng)》為理論基石，修復并創(chuàng)建志意辨證理論，廣泛運用于精神動作行為疾病中，創(chuàng)新性提出TD總的病機為腎志不足，脾意任越，魂魄不安［16］。腎志不足，志少于行，則會出現(xiàn)反復的、不可控制的眨眼、聳肩、清嗓、喉中發(fā)聲等行為；腎志不足，對情緒、情感活動的控制力減弱，則會表現(xiàn)出脾氣急躁、易沖動；腎志不足，則行為不夠果斷勇敢，膽小遇事易退縮。均符合TD患者的疾病及性格特點。

基于志意辨證理論，閻兆君教授自擬強志組方治療TD，方中巴戟天補腎增志，木香強志，遠志益志開竅，茯神開心益智、安定魂魄，清半夏調和陰陽，山藥強腎志、安神魂、定精魄，白術健脾益氣，諸藥共行益腎強志之功。

PI3K/Akt信號通路［17］是常見的炎癥信號通路，具有廣泛的生物學效應。PI3K家族在炎癥、免疫、腫瘤、肥胖等疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，細胞內PI3K在外界信號刺激后，會有不同程度的升高［18］。Akt是PI3K下游的直接靶蛋白，磷酸化后的PI3K與Akt的PH結構域結合，使得Akt磷酸化［19］。磷酸化的Akt進一步激活Akt下游炎性蛋白TNF-α。已有實驗證明了PI3K/Akt信號通路與TD的相關性。HONGYAN等［7］研究發(fā)現(xiàn)，使用PI3K抑制劑抑制LY294002能明顯緩解TD大鼠的抽動癥狀，顯著降低大鼠紋狀體與血清炎癥因子水平，說明PI3K/Akt信號通路可能介導了TD的病理過程。

TD伴隨著免疫功能紊亂，ZHONG等［20］研究顯示，IDPN建立的TD大鼠模型腦內IL-6和TNF-α等細胞因子明顯高于正常組。TAO等［21］對1 724例TD患者和550例對照組患者分別進行細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平的檢測，結果發(fā)現(xiàn)TD患者血清IL-6濃度明顯高于對照組。一項對多發(fā)性抽動癥患者的促炎細胞因子和T細胞的Meta分析結果顯示，多發(fā)性抽動癥患者包括IL-6、TNF-α在內的促炎因子水平增加［22］。本實驗研究結果與上述文獻研究結果一致。

本實驗成功復制TD大鼠模型，通過Western blot、qPCR與Elisa法探究強志組方是否通過調控PI3K/Akt/TNF-α信號通路發(fā)揮防治TD的作用。實驗結果顯示，強志組方能夠降低大鼠運動行為與刻板行為評分，下調紋狀體PI3K、Akt、TNF-α蛋白及mRNA表達水平，降低血清IL-6、TNF-α水平。說明強志組方能抑制大鼠紋狀體PI3K/Akt/TNF-α通路的激活和外周炎癥因子生成，有效減輕TD大鼠抽動癥狀。

5 結論

強志組方能改善TD大鼠異常的運動行為與刻板行為，其機制與調控紋狀體PI3K/Akt/TNF-α通路的過度激活，降低外周炎癥因子有關。本研究從PI3K/Akt/TNF-α信號通路入手，為TD發(fā)病機制及有效防治提供新思路和新靶點。但TD的發(fā)病是多因素作用的結果，強志組方治療TD的深入病因機制仍需進一步研究。