基于主要農藝性狀的25份涼粉草種質資源遺傳多樣性分析與綜合評價

蘭秀 阮麗霞 馬仙花 楊海霞 李恒銳 梁振華 黃小娟 張秀芬 周春衡

關鍵詞：涼粉草；種質資源；農藝性狀；遺傳多樣性；綜合評價

涼粉草（Mesona hLnensis Benth.）又稱仙草、仙人草、仙人凍等，是唇形科涼粉草屬的草本宿根型植物，原產于中國南部、印度和馬來西亞等地，在我國主要分布于浙江、江西、貴州、廣東、福建、廣西、臺灣等地區。涼粉草具有很高的營養和醫藥價值，是一種藥食同源的植物。《中藥大辭典》中介紹涼粉草具有清暑解渴、涼血之功效，能夠治療中暑、熱毒、消渴、高血壓、腎臟病、糖尿病、關節肌肉疼痛等。現代醫學研究發現，涼粉草還具有美容養顏、補充維生素、提高免疫力等作用。涼粉草也是很多食品工業和化學工業產品的重要原料：例如，涼粉草的枝葉經水煮可提出涼粉草膠用于制龜苓膏、仙草凍、仙草露、仙草膠等；目前市場上流行的80%的涼茶飲料都是以涼粉草為主要原料。涼粉草還可用來提取咖啡色色素，還是一些草本洗面奶、沐浴露、洗潔精等日用品的原料之一。目前已知的涼粉草有50多個品種，但主栽品種較單一，且產量不高、抗病性差，導致種質退化嚴重，因此亟需篩選出適合市場需求的優異、高產、抗病良種。

遺傳多樣性是生物學的核心之一，研究植物的遺傳多樣性，有助于對植物資源進行評價、選擇、保存和利用，而表型農藝性狀多樣性是遺傳多樣性的具體表現，是遺傳基礎與環境多樣性的綜合體現。我國有著較為豐富的涼粉草種質資源，但近年研究主要關注涼粉草的有效成分、栽培、加工等方面。雖然對其也開展了一些有關遺傳多樣性的研究，但采用的多是傳統的分子標記方法，例如：夏微采用SLAF-seq技術開發了涼粉草的SNP分子標記技術，并用其揭示了我國涼粉草種質資源的遺傳背景：李曉暉采用SCoT和ISSR兩種分子標記技術對7份涼粉草種質材料進行遺傳多樣性分析，發現其栽培種間有著明顯的遺傳差異，并將7份種質分為3大類群；張桂芳等對19個涼粉草樣品進行RAPD指紋圖譜的構建與遺傳相似性研究，證明了種質間存在豐富的遺傳多樣性：陳菁瑛等采用ISSR分子標記技術對20份不同種源的仙草進行遺傳多樣性及親緣關系分析，結果發現種源間的遺傳差異與地理分布關系不密切而與形態差異有一定聯系；Zhang等采用RAPD分子標記對來自于19個地區的涼粉草樣品進行了聚類分析，結果顯示，涼粉草種質間存在著豐富的遺傳多樣性，其地理分布與親緣關系間有一定的相關性。雖然分子標記技術具有操作快速、能有效避免自然環境干擾的特點，但分析結果不能反映種質資源在產量、環境脅迫與適應性等方面的特征，而對種質資源的描述和評價仍然主要依靠農藝表型。但目前尚缺乏對涼粉草主要農藝表型遺傳多樣性的系統研究。因此，本研究以25份涼粉草種質資源為材料，對其12個農藝性狀進行遺傳多樣性分析，并基于相關性分析、聚類分析和主成分分析對這25份種質材料進行綜合評價，以期為篩選適種于廣西龍州的涼粉草種質資源及拓寬其基因譜、選育新品種提供參考。

1材料與方法

1.1試驗區概況

本試驗于2021年2月在位于廣西龍州縣的廣西南亞熱帶農業科學研究所基地進行。試驗區地處東經106°33'～107°12'、北緯22°8'～22°44'之間，海拔200～1045m，坡度8°～15°。屬明顯的南亞熱帶季風氣候，熱量豐富，日照充足。年平均氣溫22.3～23.0℃，年極端高溫為41.6℃，年極端低溫為-3.0℃。日照時數1582.7h，無霜期達350d天以上。雨量充沛，年均降水量1174～1752mm，年蒸發量1569mm，雨熱同期。

1.2試驗材料

本試驗所用涼粉草種質材料于2020年6-10月分別采集于越南及我國的臺灣、廣西、廣東、福建和江西等省份（區），并保存在廣西南亞熱帶農業科學研究所涼粉草種質資源圃（母本園）中，共25份，編號V1-V25，具體信息見表1。

1.3調查性狀與試驗方法

試驗采取隨機區組設計，小區面積5m2（1mx5m），每份材料種植3個小區，種植行距20cm、株距15cm，重復間留1m寬過道。觀察并記錄整個生育期每份種質的抗性情況，于成熟期（6月）每個小區隨機選10株，數取分枝數，并從中選5片以上成熟葉片，用便攜式SPAD-502葉綠素儀測定葉綠素含量（SPAD值），用游標卡尺測葉厚，用鋼卷尺測量葉長、葉寬、分枝長；收獲時，每個小區隨機取5株，調查單株產量并計算葉重率（除去雜物后，每100g干涼粉草中葉片和葉柄的質量總和）和水分含量。

每個小區隨機取15株，在2月中旬（氣溫12℃）觀察植株抗寒性，在4月中旬（生長盛期）觀察植株病蟲害情況，在6月（氣溫32℃以上）觀察植株萎蔫情況，分別記錄植株受害程度（≥75%、50%～75%、25%～50%、≤25%）。為了便于統計分析，對抗性性狀（抗旱性、抗寒性、抗病蟲害）進行等級劃分并賦值：受害程度≥75%，抗性弱，賦值1；受害程度為50%～75%，抗性較弱，賦值2；受害程度為25%～50%，抗性較強，賦值3；受害程度≤25%，抗性強，賦值4。

1.4數據處理與統計分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2010進行整理，采用SPSS26.0進行Pearson相關性分析及主成分分析，以各個主成分的特征值作為系數構建用于綜合評價的函數式。基于歐式距離，采用Ward離差平方和法進行聚類分析。用CONA-C0 5畫PCA圖。用變異系數（CV）表示種質間性狀值的離散特性，用Shannon-Wiener指數（H）進行遺傳多樣性分析評價。

參考唐鳳等的方法，對其他性狀進行分級，共分為10級，劃分標準見表2，計算每個性狀的平均觀測值（X）和標準差。根據X±Ko（K=0，1，2，3，4）計算每個性狀每級的相對頻率，最后計算H。計算公式如下：

2結果與分析

2.1涼粉草種質資源間農藝性狀的變異分析及遺傳多樣性分析

由表3可知，涼粉草種質間各農藝性狀均具有廣泛的變異，變異系數在7.33%～50.90%之間，差異均達顯著（P<0.05）或極顯著水平（P<0.01）。其中，除了分枝數（7.75%）和葉厚（7.33%）的變異系數小于10.00%（弱變異）外，其他農藝性狀的變異系數均大于10.00%，分枝長（50.90%）、單株產量（45.50%）、水分含量（35.22%）甚至超過30%（強變異），說明25份涼粉草種質材料間農藝性狀的差異較明顯。

由表4可知，各農藝性狀的多樣性指數H變化范圍為1.219～2.111。其中，葉長的H'最高（2.111），在第1、4、7、9級中出現的頻率均相同（為0.129），在第5、6級的出現頻數最高；其次是分枝長（H為2.055），在第3、4、6級中出現的頻率也相同（為0.202），在第7、9級的出現頻數最高。說明這兩個性狀遺傳基礎較廣，改良潛力最大。葉重率的多樣性指數H'最低，即多樣性低，變異性較小，是涼粉草種質中相對穩定的遺傳性狀。抗旱性、抗寒性、抗病蟲害3個抗性性狀分別在第2、3、2級的頻數最高，說明涼粉草種質資源均具有較強的抗性。

2.2涼粉草種質資源農藝性狀的相關分析

對25份涼粉草種質材料的12個農藝性狀進行相關性分析，結果（表5）顯示，單株產量與分枝數、分枝長、葉長、葉重率均呈極顯著正相關關系（P<0.01），相關系數分別為0.607、0.790、0.674、0.766，說明莖葉增加與產量增加具有一致性。葉綠素相對含量與其他性狀均呈負相關關系，除與葉長和單株產量的相關性達顯著水平外，與其他性狀的相關系數均較小，總體說明葉綠素對其他性狀的影響不大。另外，分枝數與葉長、分枝長與葉重率呈極顯著正相關（P<0.01），說明分枝與葉的發育具有一致性：抗寒性與抗旱性、抗病蟲害均呈極顯著正相關（P<0.01），說明這3個抗性的增強具有一致性；分枝長與抗寒性、抗病蟲害呈顯著正相關（P<0.05），說明植株抗性與涼粉草分枝特性也存在一定關系。

2.3涼粉草種質資源農藝性狀的主成分分析

為了明確涼粉草農藝性狀中起主導作用的因素，運用主成分分析法對多性狀進行綜合評判。由表6可知，從12個農藝性狀中共提取到4個主成分（特征值大于1），貢獻率分別為33.594%、19.319%、11.433%、10.735%，累積貢獻率達75.081%．可反映涼粉草種質12個農藝性狀的主要信息。其中，第一主成分（PCI）的特征值為4.031，載荷值較大的性狀是單株產量、分枝長．葉重率，載荷值分別為0.927、0.877、0.854，反映的是分枝越長、葉重率越大，單株產量就越高，與相關分析結果一致；第二主成分（PC2）的特征值為2.318，載荷值的絕對值較大的性狀是抗寒性、分枝數和葉長，載荷值分別為0.836、-0.718和-0.697，說明分枝數和葉長增大對植株抗寒性具有不良影響：第三主成分（PC3）的特征值為1.372，反映的是植株水分含量和抗旱性，載荷值分別為0.781和-0.709，說明植株水分含量越高越抗旱；第四主成分（PC4）的特征值為1.288，反映的是葉寬和葉厚，載荷值分別為0.659和0.597。4個主成分所反映的性狀均不同，這些性狀都是決定涼粉草種質特征及差異的重要農藝指標。

對前兩個主成分進行分析（圖1）發現，25份涼粉草種質材料在圖中的分布沒有明顯規律，且分布范圍較大，再次說明這些種質材料間確實存在廣泛的遺傳多樣性。廣西區域內外的涼粉草種質在圖中的分布趨勢存在一定的差異，但是沒有出現明顯的分離，說明不能簡單依靠地域對種質進行劃分，要充分考慮選取區域的范圍大小及環境的影響，可通過選取多方面性狀對特定環境和區域的涼粉草種質進行評價，以篩選特異種質。

2.4 25份涼粉草種質材料的綜合評價

根據主成分分析結果，得到各主成分與12個農藝性狀間的關系式：

然后用綜合評價函數F=[入1／（入1+入2+入3+入4）]F1+[入2/（入1+入2+入3+入4）]F2+[入3/（入1+入2+入3+入4）]F3+[入4/（入1+入2+入3+入45）]F4（入1、入2、入3、入4分別為4個主成分對應的特征值）計算綜合得分，結果見表7，綜合得分越高，表示性狀綜合表現越優良。可見，25份涼粉草種質材料中排名前5的為V18、V16、V22、VIO、V11，尤其前3位的V18、V16和V22，綜合得分明顯高于其他種質，可作為選育涼粉草新品種的優良種質。

2.5涼粉草種質資源農藝性狀的聚類分析

基于12個農藝性狀對25份涼粉草種質進行聚類分析，在歐氏距離為10處可將其劃分為3大類群（圖2），各類群的性狀見表8。其中，第1類包括V4-V23共20份種質，占所有種質的80入，該類群葉片最厚，單株產量適中（232.900g），抗性中等偏強，其余指標均居其他兩個類群之間。第Ⅱ類包括V1、V2和V3共3份種質，該類群葉綠素相對含量最高，葉寬最大，抗旱性和抗寒性較弱或弱，弱抗病蟲害，單株產量（109.667g）及其他性狀最低。第Ⅲ類包括V24、V25共2份種質，該類群葉綠素相對含量和葉寬最低，葉厚居中，抗旱性較強，抗寒性中等偏強，抗病蟲害較強或強，單株產量（401.500g）及其他性狀均最高。三個類群總體表現為第Ⅲ類最好，第Ⅱ類最差，第1類居兩者之間。

3討論

涼粉草既是一種中草藥，又是制作涼茶、涼粉的原料，市場需求量逐年增大。就廣西而言，目前種植的涼粉草品種較單一，產量不高，沒有自主選育的品種，國內已通過品種認定的適宜當地種植的品種也很少。因此，亟需選育優良的適栽品種。植物種質資源的遺傳多樣性是遺傳改良及其相關研究的基礎，可通過遺傳多樣性分析評價篩選出特異或優良的種質，以供育種生產及科研利用。雖然已有利用多種分子標記（SNP、RAPD、ISSR等）或基于表型性狀對涼粉草遺傳多樣性進行研究的報道，但材料和性狀較少。本研究選用25份來自多個產區的涼粉草種質材料，利用12個農藝性狀，采用遺傳多樣性指數（H'）、變異系數（CV）及相關分析、主成分分析及聚類分析等對其進行遺傳多樣性分析。結果表明，各農藝性狀種質間差異均達顯著水平，變異系數在7.33%～50.90%之間，除分枝數和葉厚屬于弱變異（CV<10%）外，其他性狀均屬于中、強變異（CV>10%），以分枝長的變異系數最大，說明該性狀具有較高的遺傳改良潛力。各農藝性狀的H變化范圍為1.219～2.111，其中葉長的H最高，葉重率的H最低，說明供試涼粉草種質間遺傳多樣性豐富，遺傳基礎廣泛，這與夏薇采用SLAF-seq方法分析的涼粉草遺傳多樣性結果一致。另外發現，大部分涼粉草種質的再生能力和適應性較強，且具有較強的抗病蟲性，這可能是因為涼粉草能揮發出一種特殊氣味，以避免被采食。

相關分析結果表明涼粉草的這幾個性狀可作為涼粉草種質資源評價的主要指標。同時，通過主成分分析（PCA）對25份涼粉草種質材料進行綜合評價，共提取到4個主成分，累積貢獻率為75.081%。其中，第一主成分主要與單株產量、分枝長、葉重率有關，第二主成分主要與抗寒性、分枝數和葉長有關，第三主成分主要與植株水分和抗旱性有關，第四主成分主要與葉寬和葉厚有關。單株產量與分枝數、分枝長、葉長、葉重率呈極顯著正相關，且載荷值較高，說明這些性狀是引起涼粉草種質資源表型多樣化的主要因素。經綜合評價，V18、V16和V22三份種質綜合表現較好，可考慮用作遺傳育種的優異種質。

進一步的聚類分析可將25份涼粉草種質劃分為3類：第1類共20份種質，包括上述3個綜合表現好的種質，該類群各性狀表現多處于中上水平，增產潛力較強。第Ⅱ類共3份種質，該類群各性狀表現不佳，產量低，抗性弱，還需優化改良，不建議用于優良栽培品種選育。第Ⅲ類包含2份種質，該類群綜合表現最好，單株產量最高，抗性強，適于用作選配優質、高產品種的雜交親本。本研究還發現，種質聚類與產區分布并不一致，說明原始生境不是造成種質資源遺傳多樣性差異的唯一因素，各種質都經歷了遺傳分化但又存在頻繁的基因交流，種質評價時需綜合考慮多方面因素。

4結論

本試驗選用的25份涼粉草種質遺傳多樣性較豐富，改良潛力較大，并篩選出V18、V16和V22三個綜合評價較好的種質，可用作優良品種選育時的親本。基于農藝性狀對涼粉草遺傳多樣性進行評價的方法簡單可行，然而，對表型性狀的選擇和觀測鑒定易受栽培條件及生態環境等的影響，評價結果仍有一定局限性。今后可結合市場需求，對涼粉草品質方面的遺傳多樣性進行深入研究，以實現其藥食同源保健功能育種開發的新目標。