實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測石蠟樣本結(jié)核DNA時有關(guān)切片量的控制及優(yōu)化

蔣鴻雁,何 姣,王浩君,陳忠宜

(遂寧市中心醫(yī)院,四川 遂寧 629000)

結(jié)核病(TB)由結(jié)核分枝桿菌引起,通過呼吸道在人與人之間傳播,具有傳播速度快、傳播面廣、易感染的特點(diǎn)。結(jié)核分枝桿菌具有高致病性,常引起肺部感染,且淋巴結(jié)、腦、腎臟和脊柱也會受到侵襲[1]。最常見的檢查手段為影像學(xué)和免疫學(xué)檢查,但也有局限性,在鑒別肺部結(jié)核和感染性疾病方面較為困難,需取活組織進(jìn)行病理學(xué)檢查確診,而傳統(tǒng)病理診斷主要依靠鏡下形態(tài)和抗酸染色結(jié)果相結(jié)合,但抗酸染色陽性率低、費(fèi)力、耗時[2],也逐漸被分子檢測所取代[3-5]。在分子檢測中,最常用的就是實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。在實驗操作過程中,由于實驗人員對切片數(shù)量、切片厚度的把控不同,導(dǎo)致了對切片量的控制不同,直接影響核酸的提取效率,影響樣本的濃度和純度,在一定程度上會影響實驗的效果。有學(xué)者[6]指出,高質(zhì)量的DNA是分子檢測的基礎(chǔ),而DNA的質(zhì)量一般從DNA的濃度、純度以及DNA的完整性三方面進(jìn)行評估。因此,本文著重探討規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量對RT-PCR檢測石蠟樣本結(jié)核DNA濃度和純度的影響,以提高樣本DNA的效用,確保結(jié)核病理診斷準(zhǔn)確性,為臨床和患者提供可靠診療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2022年11月—2023年5月遂寧市中心醫(yī)院病理科診斷為疑似結(jié)核的石蠟樣本組織216 例,根據(jù)診斷需要,切取一定量的石蠟樣本組織,用于RT-PCR檢測,并記錄其DNA的濃度和純度。本實驗經(jīng)遂寧市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

醫(yī)脈賽核酸提取/純化試劑盒(嘉興醫(yī)脈賽科技有限公司,中國),結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑盒(天隆科技有限公司,中國),PCR儀(Roche,德國),核酸濃度檢測儀(艾德生物,中國)以及實驗用槍頭、Leica石蠟切片機(jī)、移液槍、PCR八聯(lián)管、試管架等耗材均由遂寧市中心醫(yī)院病理科提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 石蠟樣本組織的切片

規(guī)范前,根據(jù)實驗人員對石蠟樣本組織的評估,對需要做結(jié)核DNA檢測的石蠟樣本大組織(見圖1a)進(jìn)行切片,切片厚度為4 μm,切片數(shù)量為10張;對石蠟樣本中等大小的組織(見圖1b)進(jìn)行切片,切片厚度為4 μm,切片數(shù)量為12張;對石蠟樣本小組織(見圖1c)進(jìn)行切片,切片厚度為4 μm,切片數(shù)量為15張。

(a)為大組織;(b)為中等大小組織;(c)為小組織

規(guī)范后,實驗人員通過前期摸索,根據(jù)實驗需要對需要做結(jié)核DNA檢測的石蠟樣本大組織(見圖1a和圖1b)進(jìn)行切片,切片厚度為6 μm,切片數(shù)量為4～6張;對中等大小的穿刺組織(見圖2)進(jìn)行切片,切片厚度為6 μm,切片數(shù)量為8～15張;對石蠟樣本小組織(見圖1c)進(jìn)行切片,切片厚度為6 μm,切片數(shù)量為15～20張。

圖2 石蠟樣本穿刺組織

1.3.2 核酸提取

參考醫(yī)脈賽核酸提取/純化試劑盒對石蠟樣本組織進(jìn)行DNA提取,詳細(xì)操作步驟如下。第一,樣本前處理:將切取的石蠟組織切片轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中;加入300 μL石蠟樣本液,150 μL石蠟消化液A和20 μL蛋白酶K,置于56 ℃恒溫金屬浴消化過夜;次日,將150 μL石蠟消化液B加入標(biāo)本管,充分混勻后,70 ℃恒溫金屬浴消化2 h。第二,DNA的提取:4 ℃,10 000 g離心10 min;離心后,小心吸取全部下層液體,加入300 μL裂解吸附液、20 μL核酸提取磁珠、10 μL核酸提取液顛倒混勻15 min;用磁分離架吸附磁珠1 min,棄上清;加入600 μL洗滌液Ⅰ洗滌磁珠,顛倒混勻洗滌1 min,吸附磁珠,棄上清;再次加入600 μL洗滌液Ⅱ洗滌磁珠1 min,吸附磁珠,棄上清;加入600 μL洗滌液Ⅲ洗滌磁珠1 min,吸附磁珠,棄上清;盡量吸棄上清后,靜置5 min,去除乙醇?xì)埩?加入50 μL洗脫液,50 ℃混合均勻洗脫10 min;磁場吸附磁珠,回收含基因組DNA的洗脫液至另一干凈離心管內(nèi),以備實驗需要(-20 ℃儲存)。

通過核酸濃度檢測儀,對樣本進(jìn)行濃度和純度檢測,參照操作說明書:用焦碳酸二乙酯(DEPC)水調(diào)零后,吸取2 μL待測DNA溶液滴在檢測探頭上,放下懸臂,檢測讀取A260/A280和DNA的濃度值。提起懸臂,用干凈衛(wèi)生紙除去DNA溶液,用DEPC水清洗,擦去DEPC水后檢測下一個樣本,并記錄詳細(xì)數(shù)值。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

參照試劑說明書,根據(jù)實驗需要,將提取到的DNA溶液取4 μL加入到36 μL的體系中按預(yù)設(shè)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增(40個循環(huán)),實驗結(jié)束后收集FAM通道熒光信號,并記錄數(shù)據(jù)。

1.4 參考標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 DNA的濃度

不同檢測方法或檢測試劑盒對被檢查樣本的DNA濃度要求不盡相同。根據(jù)不同實驗?zāi)康?、實驗方法和檢測平臺的需要,認(rèn)為將DNA濃度控制在60.00～600.00 ng/μL比較好[6]。

1.4.2 DNA的純度

DNA的A260/A280的正常值為1.80～2.00[6]。

2 結(jié) 果

2.1 規(guī)范前后石蠟樣本組織的DNA濃度評價

實驗過程中,對每一個樣品進(jìn)行濃度檢測,其中詳細(xì)記錄樣本濃度者216 例。本研究通過統(tǒng)計規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量前后的DNA濃度發(fā)現(xiàn),規(guī)范切片前,樣本DNA濃度為2.25～1 373.00 ng/μL,平均濃度128.70 ng/μL。規(guī)范切片后,樣本DNA濃度范圍為6.20～1 380.00 ng/μL,DNA的濃度有所增加,平均濃度149.20 ng/μL,其濃度主要集中在20～200 ng/μL(見圖3)。對實驗中兩次DNA濃度超過1 300.00 ng/μL的樣本均稀釋10倍進(jìn)行實驗。

圖3 規(guī)范前和規(guī)范后石蠟樣本組織DNA濃度比較

2.2 規(guī)范前后石蠟樣本組織的DNA純度評價

實驗過程中,對每一個樣品進(jìn)行濃度檢測并記錄A260/A280的數(shù)值,其中詳細(xì)記錄樣本純度者216 例。DNA純度1.80～2.10為樣本純度較高,否則會存在一定的污染[6]。本研究通過統(tǒng)計規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量前后的DNA純度發(fā)現(xiàn),規(guī)范切片前DNA純度范圍為1.10～2.20。規(guī)范切片后,DNA的純度有所改善,濃度主要集中在1.80～2.27(見圖4)。

圖4 規(guī)范前和規(guī)范后石蠟樣本組織DNA純度

本研究通過收集規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量前后的DNA濃度和純度,發(fā)現(xiàn)規(guī)范切片前,DNA濃度相對較低的樣本,其純度也較低,實驗室統(tǒng)計抗酸染色和RT-PCR的符合率(數(shù)據(jù)待發(fā))發(fā)現(xiàn),均為陰性的符合率為40%,均為陽性的符合率為23%。規(guī)范切片后,組織的DNA濃度有所增加,純度也較高,相對而言改善了樣本的質(zhì)量,實驗室統(tǒng)計抗酸染色和RT-PCR的符合率(數(shù)據(jù)待發(fā)),均為陰性的符合率為44%,均為陽性的符合率為25%,在一定程度上確保了實驗結(jié)果。本研究出現(xiàn)的兩個石蠟樣本組織的濃度超過1 300 ng/μL,純度處于2.00～2.10,屬于質(zhì)量較好的樣本,根據(jù)實驗所需,我們稀釋了10倍進(jìn)行實驗,結(jié)果符合臨床癥狀,且與相關(guān)檢驗/檢查相符合,滿足診斷需求。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原體。結(jié)核病發(fā)展快速且不可逆[7],是由于其獨(dú)特的致病性和發(fā)病過程,導(dǎo)致了結(jié)核病診斷面臨著發(fā)病率高和檢出率低的情況[8]。有學(xué)者[4]指出,當(dāng)痰涂片和抗酸染色結(jié)果出現(xiàn)陰性時,病理診斷在結(jié)核病的確診中意義重大。隨著分子病理學(xué)的迅速發(fā)展,RT-PCR實驗技術(shù)的應(yīng)用在提高石蠟樣本結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的檢出中發(fā)揮著重要作用。RT-PCR檢測石蠟樣本抗酸桿菌復(fù)合群時,最主要的一步是檢測DNA分離;不嚴(yán)格控制石蠟組織的切片量,會影響所提取的DNA的濃度和純度,進(jìn)而影響RT-PCR檢測的靈敏度[9]。因此,我們要重視RT-PCR在石蠟樣本結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測中的重要性,為結(jié)核病的精準(zhǔn)診治提供可靠的病理學(xué)依據(jù)[10]。

在小標(biāo)本、肺穿刺組織的結(jié)核診斷中,常因為標(biāo)本較小,實驗人員會盡可能地多切組織標(biāo)本,從而提高總基因組中結(jié)核分枝桿菌DNA的數(shù)量,但實驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)樣本切得過多時,組織消化不夠,導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌不能完全釋放,會影響實驗結(jié)果。但是,每個實驗人員對于組織的大小、切片厚度和切片數(shù)量的把握都存在一定的差異,因此規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量就極為迫切;同時也希望在未來的工作中有效能更高的試劑盒來輔助提取石蠟樣本中的結(jié)核分枝桿菌DNA,最大限度使結(jié)核分枝桿菌釋放出來;或通過特殊濾網(wǎng)攔截基因組較大的標(biāo)本DNA,濾過相對較小的結(jié)核分枝桿菌DNA,盡可能地保留結(jié)核分枝桿菌DNA,進(jìn)而提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率[11]。

本研究結(jié)果表明規(guī)范切片后樣本DNA的濃度和純度均有所提高?？偟膩碚f,為滿足本實驗室的需要,將樣本控制在100～400 ng/μL較為適宜。對DNA濃度超過范圍的樣本進(jìn)行適度稀釋后再進(jìn)行實驗,這與2018年楊軍等[6]在甲醛固定石蠟包埋的組織中提取DNA樣本質(zhì)量評價的多中心調(diào)研中提出的方法一致,該調(diào)查提出切片量過多和過少都會使實驗結(jié)果出現(xiàn)誤差,對DNA濃度過低的樣本需要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上增加切片量,如增加切片厚度或是增加切片張數(shù)等。除了樣本DNA的濃度外,DNA的純度同樣對實驗結(jié)果有影響,樣本污染程度也會影響實驗結(jié)果,這與實驗操作過程中是否嚴(yán)格消毒實驗環(huán)境、規(guī)范操作流程有關(guān)[6]。

本研究所使用的標(biāo)本均為石蠟樣本,而石蠟樣本的DNA質(zhì)量是獲得正確結(jié)果的重要保障[12]。本研究基于樣本濃度和純度的結(jié)果分析,根據(jù)石蠟樣本組織的大小,總結(jié)了規(guī)范切片厚度和切片數(shù)量前后的樣本DNA濃度和純度的變化情況(未做統(tǒng)計學(xué)分析),而有關(guān)樣本DNA的完整性還有待進(jìn)一步分析和探討。

綜上所述,基于本實驗室情況,我們根據(jù)組織的大小,將切片量控制在24～120 μm,切片厚度為6 μm,詳細(xì)切片厚度和切片總量參考表1。在整個切片過程中,需要根據(jù)組織的大小在建議范圍內(nèi)控制切片量,有利于在進(jìn)行RT-PCR檢測時提高樣本DNA的濃度和純度,有助于提高實驗的精確性,減少不必要損耗,確保診斷的正確性。

表1 不同大小組織切片厚度和切片總量參考表