導航模板注射鋰基生物玻璃水凝膠修復股骨頭壞死的效應研究

馬橋橋,吳澤睿,查國春,郭開今,蔣守海,張傳開*

(1.徐州仁慈醫院關節外科,江蘇 徐州 221000;2.徐州醫科大學附屬醫院關節外科,江蘇 徐州 221000)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一種涉及骨細胞壞死的骨關節疾病,表現為骨細胞和骨髓成分進行性死亡,引起股骨頭塌陷,最終發展為髖關節炎,導致髖關節疼痛和功能喪失,嚴重影響患者生活質量[1-2]。據統計,中國至少有超800萬人罹患股骨頭壞死,而全球范圍內股骨頭壞死患者每年增加3～5萬,且多數為中青年患者[3]。由于修復壞死骨難度大、高致殘率以及一些患者需長期使用激素,股骨頭壞死一直受到廣泛關注[4]。對于發展為骨塌陷或是骨關節炎的股骨頭壞死患者,可能需要實施全髖關節置換術(total hip arthroplasty,THA),但中青年患者更希望避免或是推遲這種手術。因此,早期治療股骨頭壞死十分必要[5]。

基于生物材料的工具在骨重建方面具有廣闊的應用前景。然而,目前只有少數生物材料是專門為激素引起股骨頭壞死設計。據報道,聚醚醚酮或鈦棒等材料在改性后表現出良好的骨再生性能[6-7]。然而,有效物質用完后,其原有的生物惰性就會暴露出來。例如,鈦棒產生的磨屑會導致骨溶解。因此,理想的生物材料在修復壞死骨細胞后也應該能夠順利降解。介孔生物玻璃納米顆粒(mesoporous bioglass nanoparticles,MBN)因其獨特的工藝、更大的比表面積、更高的載藥量和更好的釋放性能,多年來一直是人們關注的焦點[8]。因此,它適合作為藥物輸送載體或生物注射材料。通過調整比例和添加元素,可以制備出不同性能的MBN,以達到不同的效果[9]。然而,MBN是一種剛性修復材料,無法協調骨再生。此外,由于其物理特性,它不能固定和聚集在缺陷中。因此,對MBN進行修飾和性能優化,可能會更有利于股骨頭壞死區的骨修復。

近年來,治療性離子鋅、鈣、鎂、鋰等金屬離子被作為生物材料的組成部分受到人們的關注,因為它們對成骨有積極作用。眾所周知,鋰(Li)是人類營養中一種重要的微量營養素,是治療雙相情感障礙的一線藥物。先前的研究表明,氯化鋰(LiCl)促進成骨,加速骨折愈合時間。Huang等[10]將LiCl應用于骨質疏松模型,證明LiCl有利于骨髓間充質干細胞的增殖,并通過調節自噬促進成骨。Peng等[11]發現,適當添加鋰可以增強細胞附著并刺激成骨。Geng等[12-13]的研究已經證明,LiCl可能通過抑制破骨細胞分化和促進成骨來促進界面骨整合,以及具有調節納米鈦顆粒刺激的巨噬細胞極化和促進成骨方面的作用。然而,到目前為止,關于鋰對血管生成分化潛能的影響以及具體機制,人們還知之甚少。此外,金屬離子與MBN結合的方式、結合濃度的選擇以及釋放金屬離子的穩定性還有待進一步探索,因為低濃度無效,而高濃度可能引起中毒。

利用3D打印技術制作股骨頭壞死病灶區導航模板,可以精確定位骨壞死區域,有效清除壞死病灶[14]。甲基丙烯酰化明膠(gelatin methacryloyl,GelMA)是一種半天然合成水凝膠,具有成熟的合成技術[15],其高度的生物相容性和豐富的孔隙使細胞和血管能夠更自由地附著和發育[16-17]。甲基丙烯酰的接枝使得GelMA能夠光固化并具有可塑性和緩釋能力[18-19]。在本研究中,筆者制備了一種可注射鋰基生物玻璃水凝膠(GelMA and Li-mesoporous bioglass,GM/M-Li),并利用3D打印導航模板精確注入GM/M-Li填充壞死病灶區,為促進股骨頭壞死的骨修復,提供了一種新的策略,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 時間及設計 2019年9月至2022年3月,前瞻性隨機對照研究。

1.2 材料與準備

1.2.1 鋰基介孔生物玻璃(Li-mesoporous bioglass,M-Li)的合成 根據文獻合成了MBN[20],按照說明合成M-Li[21]。以十六烷基三甲基溴化銨為模板劑,在60 ℃下將7.092 g三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽粉末溶于250 mL去離子水中,然后將1.5 g十六烷基三甲基溴化銨與溶液混合。當溶液攪拌至澄清后,向溶液中滴加10.8 mL正硅酸乙酯、0.9 mL磷酸三乙酯、2.45 g四水合硝酸鈣[Ca(NO3)2·4H2O]和0.125 g LiCl,溫和攪拌約30 min。之后將溶液猛烈攪拌16 h,直到它變成乳白色。收集沉淀物,用無水乙醇和去離子水輪流洗滌3次,離心后沉淀在60 ℃烘箱中干燥24 h,最后將固體研碎并在650 ℃空氣中煅燒3 h,設置溫度每分鐘上升2 ℃。結束后將得到的M-Li粉末收集在試管中備用。

1.2.2 水凝膠的制備 以苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰(LAP)為光引發劑。簡單地說,在5 mg LAP中加入20 mL磷酸鹽緩沖液,在50 ℃下攪拌,直至透明,遠離光線。然后,在50 ℃下,將50 mg凍干的GelMA加入1 mL LAP溶液中,持續攪拌,與溶液合成預聚體。待溶液完全溶解后,在紫外光(EFL-ls-1600-405,蘇州,中國)照射5～10 s。在預聚物溶液中加入3%(w/v終值)的MBN或M-Li粉末,混合均勻,然后在紫外光下曝光5～10 s,得到生物水凝膠(GM/M)和GM/M-Li。

1.2.3 M-Li的表征 為了分析M-Li樣品的形貌,分別進行掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)、透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察M-Li,此外,采用小角X射線衍射(small angle X-ray diffraction,SA-XRD)對Cu源進行結構分析。

1.2.4 GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠的表征 為了觀察GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠的微觀結構形態,在12.5 kV電壓下制備樣品并進行SEM分析。利用傅里葉紅外光譜(學研會科研平臺,鄭州,中國)發現GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠中的鍵變化(對樣品和背景進行32次掃描,4 cm-1分辨率,波長范圍為400～4 000 cm-1)。

1.2.5 測試壓縮模量及穩定性 將水凝膠制成直徑為9 mm、厚度為3 mm的圓盤,用機械試驗機(上海恒儀精密儀器有限公司,中國)以1 mm/min的下降速率進行測量。在37 ℃下,用流變應力6 000流變儀(Thermo Scientific)對水凝膠進行流變學測試,以分析水凝膠的穩定性。

1.2.6 離子釋放試驗 將水凝膠制成直徑9 mm、厚度3 mm的圓盤。然后將模擬體液(士諾達生物科技有限公司,安徽,中國)在37 ℃下,勻速搖床上浸泡7、14、21和35 d。最后在每個時間點收集上清液,通過BioTek(侖昌碩生物科技有限公司,中國)檢測。

1.2.7 細胞培養物制備 RAW 264.7細胞購自中國科學院上海細胞庫。從兔體內分離骨髓間充質干細胞。骨髓間充質干細胞在α-MEM中培養,均加入10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素,在37 ℃、5% CO2下的氣氛中培養。在細胞培養工作之前,納米顆粒在紫外燈下乙醇中消毒一夜,然后用消毒過的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌。

1.2.8 細胞活力和增殖評價 采用Live/Dead染色法(Invitrogen公司,美國)檢測各組水凝膠的細胞活力。簡單地說,用不同組的水凝膠提取物將骨髓間充質干細胞(1.0×104個細胞/孔)接種在爬行細胞上。培養1 d后,去除培養基,用活/死染色試劑盒避光染色,然后用熒光顯微鏡(蔡司,德國)觀察樣品。

1.2.9 細胞增殖實驗 細胞增殖實驗(cell counting kit-8,CCK-8)試劑(新賽美生物科技有限公司,蘇州,中國)用于本研究。將骨髓間充質干細胞(5×103個/孔)接種于96孔板(100 μL/孔)。第1、3和5天,更換為100 μL新鮮培養基(含10% CCK-8溶液),在37 ℃、5% CO2下孵育。2 h后,平板用酶標儀(Biotek,USA)在450 nm光密度下進行驗證。

1.3 方法

1.3.1 細胞形態及免疫熒光染色 骨髓間充質干細胞(每孔2×104個細胞)接種在水凝膠盒上,在37 ℃、5% CO2下孵育3 d。到達時間點時,樣品在4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)的冰上固定1 h。之后去除固定物并洗滌,然后用不同濃度的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水,每個15 min。隨后用CO2臨界點干燥儀干燥約2 h,噴金45 s。最后通過SEM采集圖像。

1.3.2 羅丹明染色 將骨髓間充質干細胞(1×104個/孔)接種于24孔板中不同組的水凝膠提取物中。孵育12 h和48 h后,溫和洗滌樣品,隨后在冰上加4% PFA 30 min。然后去除固定物,加入0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich,USA)10 min。PBS洗滌3次后,將羅丹明(翌圣科技有限公司,上海,中國)按1︰500的比例溶于PBS中,溫和添加到孔中。37 ℃孵育1 h后,用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)對細胞核進行染色,樣品用熒光顯微鏡采集(蔡司,德國)。

1.3.3 堿性磷酸酶活性 用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)測定試劑盒(碧云天生物技術,上海,中國)測定成骨能力。將不同組的骨髓間充質干細胞(1×104個細胞/孔)接種在24孔板上。7 d后,在4% PFA中洗滌3次并固定后,加入ALP染色液(300 μL/孔),避光至少30 min。最后在光學顯微鏡下觀察陽性細胞。

1.3.4 成骨礦化分析 磷酸鈣是評價成骨特性的關鍵因素。因此,本研究使用茜素紅S(alizarin red S,ARS)染色試劑盒(塞葉,廣州,中國)進行驗證。將不同組的骨髓間充質干細胞(1×104個/孔)以水凝膠的方式接種在24孔板上。培養21 d后,分別洗3次,4% PFA固定30 min,每孔加入ARS染色液,室溫下保證細胞完全覆蓋約1 h。然后,細胞被清洗幾次以充分去除染料。用光學顯微鏡觀察得到鈣結節。為了定量ARS染色,每孔加入5%過氯酸,在吸光度(optical density,OD)490 nm處測量。

1.3.5 血管生成評價 為了觀察水凝膠的血管生成能力,使用生長因子降低的基質凝膠(100 μL/孔,康寧,美國)。播種細胞前,每孔加入60 μL基質,37 ℃孵育30 min成膠。然后用水凝膠提取液將人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein,HUVECs)(3.5×104個/孔)接種到每孔中。在37 ℃、5% CO2下孵育后,用光學顯微鏡在0、3和6 h觀察并采集,結果通過Image J進行分析。

1.3.6 遷移實驗 將GelMA、GM/M或GM/M-Li水凝膠提取物置于下腔,而將200 μL HUVECs懸液(2.5×105個/mL)置于上腔,在37 ℃、5% CO2下孵育。培養16 h后,取出小室,用棉簽小心去除膜上部,在4% PFA中固定20 min。然后用0.1%的結晶紫溶液(索萊寶,北京,中國)對細胞染色并在顯微鏡下觀察。用Image J對結果進行量化。

1.3.7 劃痕實驗 劃痕實驗是評價血管生成的一種方法。簡而言之,將HUVECs(4×105個/孔)接種到6孔板中,在37 ℃、5% CO2下孵育。當細胞90%融合后,用200 μL移液管尖端在細胞層形成劃痕。用無菌PBS沖洗3次以清除細胞碎片,用含GelMA、GM/M或GM/M-Li水凝膠提取物的0.5%血清替換培養基。在0、12和24 h,使用倒置顯微鏡捕捉圖像。用Image J計算相應的數據(即遷移區域)。

1.3.8 體外抗炎評價 體外采用RAW 264.7細胞觀察Li+對炎癥反應的影響。簡單地說,將1×104的RAW 264.7細胞接種到24孔板中,在37 ℃、5% CO2下孵育。培養12 h后,用100 ng mL-1的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和25%葡萄糖(高糖)誘導細胞再培養12 h。然后,細胞固定0.5 h,然后用0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich,美國)固定10 min。然后,一抗一氧化氮合酶(M1標記物)和Arg1(M2標記物)用F4/80與細胞孵育,在4 ℃保存過夜。第2天,用PBS沖洗3次后,避光加入二抗。孵育1 h后,充分洗滌細胞后加入DAPI。熒光顯微鏡拍攝圖片。

1.3.9 實時聚合酶鏈反應定量分析 向6孔板細胞中加入1 mL Trizol,裂解5 min。(1)裝入1.5 mL EP管,加入200 μL氯仿,充分搖勻,冰上靜置10 min;(2)12 000轉/min,4 ℃離心15 min;(3)小心吸取透明上清液,轉移至新EP管,加入等量異丙醇,輕輕混勻,冰上靜置10 min;(4)12 000轉/min,4 ℃離心15 min;(5)棄上清,擦凈內壁液體,配置75%乙醇-焦碳酸二乙酯水,沖洗核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)沉淀,12 000轉/min,4 ℃離心15 min;(6)棄上清,加入20 μL焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)吹勻,測RNA濃度;(7)將樣品測得的RNA濃度按1 μg總量進行配平,加入100 μL DEPC水逆轉錄,獲得互補mRNA的脫氧核糖核酸分子(complementary DNA,cDNA)。將所獲得的cDNA按照,2 μL cDNA、5 μL SYBR qPCR master mix、1 μL Primer 1+Primer 2、2 μL雙氧水配置擴增體系后上機。

1.3.10 GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠條件培養基的制備 收集水凝膠條件培養基進一步誘導骨生成和血管生成。簡單地說,RAW264.7細胞(每孔4×105個細胞)在含有10%胎牛血清的6孔板上,在培養基中,在37 ℃、5% CO2下培養。孵育12 h后,用100 ng/mL的LPS誘導培養基12 h。最后,分別收集不同組的上清液,在無菌環境下過濾,去除凝膠和細胞碎片。濾液保存在-80 ℃,用于培養骨髓間充質干細胞和HUVECs。

1.3.11 動物模型 動物方案經醫院動物倫理委員會(倫理號202103A481)批準。所有動物均養在單獨的籠子里,溫度25 ℃,濕度55%。為建立股骨頭壞死兔模型,參照文獻造模方法[22-23],為降低造模死亡率,對造模方式進行改良。使用LPS聯合用甲波尼龍琥珀酸鈉(MP,輝瑞制藥,500 mg)。首先,前3天每天1次于動物臀中肌肌注(50 mg/kg)。第4天行兔耳緣靜脈注射LPS,20 μg/kg劑量。造模時間6～8周。通過病理組織學及Micro-CT檢測空骨陷窩率、骨細胞凋亡率、股骨頭囊性變等指標評價股骨頭壞死情況。

1.3.12 3D打印導航模板的制作及水凝膠的注射 對成功造模股骨頭壞死的兔模型進行股骨頭及股骨近端micro-CT掃描并3D打印,根據3D打印模型及病灶區域,制作病灶區導航模板(見圖1);在導航模板的定位下精確清除股骨頭壞死的病灶區,完成病灶清理后,向內分別注入GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠填充缺損,并用骨蠟覆蓋骨皮質缺損窗。同時采用正常大白兔作為正常對照,股骨頭壞死模型未手術組作為陽性對照,各實驗組左側股骨頭為自身對照。

1.3.13 水凝膠作用評價 水凝膠植入8周后,處死動物行組織學、骨計量學、分子生物學等途徑進行分析。采用micro-CT對兔股骨頭微觀結構進行分析,獲得的2D和3D圖像評價新骨形成。組織學采用蘇木素伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色及免疫熒光染色分析骨壞死程度、骨小梁結構、成骨細胞、脂肪情況;動物處死前第14天和第7天使用鈣黃綠素肌注進行骨熒光標記。

1.3.14 組織學染色 術后2、4和8周,取股骨(每組6根右側股骨頭),在10%福爾馬林中固定至少48 h進行組織學分析,然后用10%乙二胺四乙酸脫鈣1個月。然后,將骨切割后嵌入特定位置,并切成6 μm厚的切片。常規HE和Masson染色觀察標本在光學顯微鏡下的形態學變化。

2 結 果

2.1 MBN和水凝膠的表征 將MBN溶于GelMA溶液制備了GM/M和GM/M-Li水凝膠,并在405 nm波長的紫外光照射下進行光交聯(見圖2a)。通過SEM觀察到GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠的多孔海綿狀結構沒有太大差異,說明這類合成方法可能不會對結構產生影響。利用TEM發現,合成的生物玻璃呈現了均勻地球形結構,且尺寸均<100 nm,可以證明其為納米顆粒(見圖2b)。

a 水凝膠光交聯前后的方案 b 3種水凝膠SEM圖像和M-Li的TEM納米顆粒形貌

黏度和可塑性對于植入和修復至關重要,例如幫助組織連接和細胞附著。另外,可注射性是原位用藥的一種重要又簡便的方法,因此通過直接觀察和流變性試驗對水凝膠進行了評估(見圖2c)。可見,水凝膠性能穩定,但GM/M-Li水凝膠具有較高的儲能模量,證明其具有更好的可塑性。此外,這種水凝膠可以畫出想要的形狀,比如心形或“ABC”。總體而言,這些特點有利于將手術創傷降至最低,這意味著患者將更快地康復。

采用傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)檢測GelMA、GM/M和GM/MLi水凝膠中鍵是否發生改變。1 080、1 240和1 630 cm-1處的峰分別代表Si-O-Si鍵、P-O鍵和C=O鍵(見圖2d)。有趣的是,FTIR顯示GelMA、GM/M和GM/M-li之間沒有明顯的變化。然后用SA-XRD測定了納米顆粒的孔徑。MBN和M-Li納米顆粒均在2 ℃(0.361)處出現峰值,對應孔徑為24 nm(見圖2e)。

水凝膠的溶脹度、含水率和直徑具有關鍵的參考意義,反映了水凝膠的穩定性,決定了是否會對局部組織的修復形成干擾。與GelMA和GM/M相比,GM/M-Li水凝膠的重量和直徑能在較短時間內達到平衡,證明了其良好的穩定性(見圖2f～2k)。

2.2 離子釋放實驗和礦化實驗 GM/M-Li水凝膠中Si4+和Li+離子成功釋放,有利于骨修復(見圖2l～2m)。如上所述,隨著離子釋放,表面形成羥基磷灰石層(hydroxyapatite,HA),增強了細胞、組織和骨骼之間的連接,這些因素對骨骼重建至關重要。為此,對M-Li和GM/M-Li水凝膠的礦化潛力做了相關研究。第7天用SEM-X射線能譜觀察M-Li和GM/M-Li水凝膠,發現M-Li表面完全被有序的沉積物覆蓋(見圖3),GM/M-Li水凝膠表面呈花椰菜狀團聚分布(見圖4),證明M-Li和GM/M-Li水凝膠有效促進了礦化。

圖3 M-Li表面完全被有序的沉積物覆蓋

2.3 細胞增殖實驗 用CCK-8法研究了細胞在水凝膠上的增殖情況。結果表明,GM/M和GM/M-Li5水凝膠具有最佳的生物相容性以促進細胞生長(見圖5)。因此,在隨后的所有實驗中,選擇了5% LiCl來制備GM/M-Li水凝膠。

圖5 骨髓間充質干細胞在不同濃度鋰的水凝膠下的細胞增殖結果

2.4 細胞骨架染色 將骨髓間充質干細胞種在GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠上,在12 h和48 h分別對細胞進行骨架染色,結果發現,12 h的細胞形態在各組之間差異無統計學意義;但在培養48 h后,GM/M-Li水凝膠在細胞數量和鋪展面積都優于其他組(見圖6)。

圖6 不同材料骨髓間充質干細胞骨架phalloidin(紅色)和DAPI(藍色)染色(×50 μm)

2.5 活/死染色 將骨髓間充質干細胞培養在不同材料上,3 d后對其進行活/死染色。結果顯示,在培養3 d后,3種材料均未見明顯死細胞,表明這些材料對細胞均無明顯毒性作用(見圖7)。

圖7 水凝膠提取物中培養的骨髓間充質干細胞的活細胞(綠色)和死細胞(紅色箭頭)(×200 μm)

2.6 掃描電鏡下細胞形態 將骨髓間充質干細胞種在水凝膠表面,利用SEM檢測。結果清晰地展示了三組水凝膠在同一尺寸下,GM/M-Li水凝膠上的細胞鋪展地更大,偽足更多,而其他兩組細胞皺縮,鋪展不佳,這與圖6結果相吻合,證明GM/M-Li水凝膠具有更好的生物相容性,有利于體內組織和細胞生長(見圖8)。

2.7 水凝膠成骨能力評價

2.7.1 成骨相關染色評價 水凝膠能否在原位缺損處誘導成骨至關重要。因此,研究了這些水凝膠的潛在成骨能力。首先,在不同水凝膠表面培養骨髓間充質干細胞,以檢測作為早期成骨分化標志的ALP活性。可以看到,在第7天的ALP染色,GelMA和GM/M-Li水凝膠中ALP表達均明顯上調,且GM/M-Li水凝膠表達水平明顯更高。筆者也檢測了ALP活力,表明了GM/M-Li水凝膠的ALP活力更高。此外,在誘導了21 d骨髓間充質干細胞后,進行了ARS染色,也觀察到了類似的結果(見圖9a～9c)。GelMA和GM/M水凝膠中鈣結節小而少,而GM/M-Li水凝膠鈣結節明顯增多,表明其顯著的成骨能力。

a 培養7 d的ALP染色和21 d的ARS染色(×200 μm) b ALP活性的定量評價 c OD值(490 nm)下ARS的定量

利用了免疫熒光染色對誘導3 d后的骨髓間充質干細胞進行Runt相關轉錄因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)染色來評價成骨能力。前者位于成骨分化早期指標,表達在細胞核內;后者位于質膜上,在骨代謝調節中起重要作用。GM/M-Li水凝膠顯著上調Runx2和OCN的表達,優于GelMA和GM/M水凝膠(見圖9d),證明GM/M-Li水凝膠中的Li+進一步促進了骨髓間充質干細胞的成骨分化。

2.7.2 成骨相關蛋白和基因表達 利用蛋白印記(western blotting,WB)和反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術,驗證OCN、Runx2和Osterix成骨相關蛋白和基因來揭示其成骨能力。結果表明,與GelMA和GM/M組相比,GM/M-Li組OCN、Runx2和Osterix的蛋白表達明顯上調,表明GM/M-Li水凝膠的成骨能力最優(見圖10)。同樣,PCR的結果得到了類似結論(見圖11)。綜上所述,GM/M-Li水凝膠具有良好的體外促成骨能力。

圖10 OCN、Osterix和Runx2蛋白的WB

2.8 成血管能力評價 利用劃痕實驗評價體外成血管能力。半定量分析顯示,GM/M-Li水凝膠在12 h和24 h的遷移速度較快。隨后進行血管形成實驗,發現6 h后,GM/M-Li水凝膠顯著促進HUVEC管狀、結節和分支的形成,這與GelMA和GM/M組形成鮮明對比,表明水凝膠釋放的Li+具有優異的血管生成能力。在Transwell實驗中,GM/M-Li水凝膠組有更多的細胞轉移到膜另一側,而其他組幾乎沒有細胞(見圖12a～12f)。同時,研究血管生成相關蛋白血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),驗證GM/M-Li水凝膠突出的血管生成生物活性(見圖12g～12h)。結果表明,GM/M-Li水凝膠釋放的Li+有積極的促血管再生的作用。

a 傷口愈合(×200 μm) b 血管形成(×100 μm) c 遷移試驗(×100 μm)

2.9 水凝膠成脂抑脂能力評價 使用3T3-L1前體脂肪細胞評價脂肪生成和抑制能力。通過油紅O染色發現,GM/M-Li水凝膠顯著抑制了3T3-L1前體脂肪細胞的成脂分化,脂滴數量相較于其他兩組數量明顯減少,表明Li+有良好的抑制脂肪生成的能力(見圖13)。

圖13 不同水凝膠對3T3-L1細胞抑制脂肪生成能力評價(×100 μm)

2.10 水凝膠植入對體內骨重建影響的評價

2.10.1 兔股骨頭HE染色 GM/M-Li水凝膠在體內是否具有令人滿意的效果還有待進一步研究。因此,對不同組的水凝膠在體內的應用進行了評價。對兔股骨頭組織行HE染色,發現模型組相較于對照組,骨小梁結構丟失,脂滴增加。在GM/M-Li水凝膠的干預后顯著減少了股骨頭脂滴、核固縮(見圖14)。

圖14 股骨頭壞死對照組、模型組及治療組的HE染色(×100 μm)

2.10.2 兔股骨頭免疫組織熒光染色 通過組織免疫熒光染色對股骨頭壞死的成骨成血管進行研究。結果發現,GM/M-Li水凝膠有效促進了Runx2成骨指標和成骨表達。對骨組織進行鈣黃綠素/茜素紅熒光雙標,發現GM/M和GM/M-Li水凝膠均有明顯成骨表現,證明GM/M和GM/M-Li水凝膠均有良好促成骨能力。另外,GM/M-Li水凝膠在Li+的作用下,成血管指標CD31的表達上升,表明其有效促進血管新生,而這有助于股骨頭壞死的骨重建(見圖15)。綜上所述,認為GM/M-Li水凝膠在成骨、成血管方面有良好表現。

圖15 股骨頭壞死對照組及治療組組織熒光染色(×50 nm)

3 討 論

股骨頭壞死是一種機制復雜的疾病,表現為進行性的骨細胞壞死和修復,最終可能導致髖關節炎和股骨頭塌陷。由于股骨頭壞死的骨修復能力下降,血管再生能力差,往往壞死速度大于修復速度[24]。

股骨頭壞死常見原因之一是糖皮質激素導致,盡管糖皮質激素(glucocorticoids,GCs)誘導的股骨頭壞死的確切機制仍不明確,但研究人員發現,脂質代謝紊亂學說及相關信號通路的激活抑制是GCs介導股骨頭壞死的主要發病機制之一[1,22]。骨髓間充質干細胞具有自我更新和分化能力,在正常骨代謝中起著重要作用[25]。研究人員在兔子模型中使用了大量GCs后,發現骨髓間充質干細胞的活性降低,趨向于分化為成脂細胞而非成骨細胞,導致脂質累積在細胞內。同時在GCs的作用下,體內血清總膽固醇、甘油三酯水平升高,導致脂肪分布異常,最終造成骨內壓的升高,壓迫股骨頭微循環而減少其血供,導致股骨頭壞死[26]。同理,酗酒會導致肝細胞損傷和甘油三酯合成增多,肝細胞線粒體受損,引起脂質代謝紊亂,血液中的游離脂質增加,最后脂滴的堆積促進了股骨頭微循環發生脂肪栓塞,最終引起股骨頭壞死[27]。Wnt/β-catenin經典通路是決定成骨與成脂平衡的分子開關。當Wnt信號存在時,Wnt信號和卷曲蛋白結合,激活經典Wnt信號通路,通過抑制糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)活性抑制了β-catenin磷酸化,使其在胞質內大量聚集,繼而入核表達,誘導成骨分化[28]。研究發現,GCs可能作用于Wnt信號通路,激活GSK-3β,抑制β-catenin的活化和入核表達,最終減少成骨分化[29]。因此,促進骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞、恢復股骨頭血供,在預防股骨頭壞死中顯得尤為必要。

骨骼是堅固和可再生的器官。單純的骨折或缺陷可以由身體自己修復,但股骨頭壞死由于其微環境失衡,修復能力有限[30]。因此,本研究研究了加速骨重建的水凝膠生物材料。生物材料應該具有良好的生物相容性。理想的生物材料放置在體內意味著“內”與“外”的兼容、互惠互利,而不是引發致命的排斥反應。Pluharova等[31]曾報道,在酰胺基團和鈣離子之間存在離子-偶極相互作用。因此,筆者利用這種作用結合了MBA和GelMA。MBN具有海綿狀結構,為細胞交互提供了空間,便于新陳代謝、信號傳遞和營養運輸。同時,穩定的HA層對骨形成是必不可少的,因為它證明了MBN與微環境的聯系。本研究發現,盡管GelMA和GM/M水凝膠無明顯的毒性,但基于此特性在GM/M-Li水凝膠上的生長表現更佳。

眾所周知,骨骼是一種高度血管化的器官。在許多情況下,由于缺乏血管化,會導致骨再生失敗。文獻表明,成骨-血管偶聯對完整的骨再生很重要[32-33]。本研究驗證了GM/M-Li水凝膠在體外成骨和血管生成中的作用,發現GM/M-Li水凝膠的表現令人滿意。然而,在股骨頭壞死情況下,血管再生和成骨能力會大打折扣。因此,股骨頭壞死下的骨重建是一項具有挑戰性的工作。

股骨頭壞死時,成骨-成脂能力平衡破壞,前體脂肪細胞多向成脂分化而非成骨分化,導致骨組織減少發生塌陷。因此,筆者在體外模擬了GM/M-Li水凝膠抑制3T3-L1前體脂肪細胞分化為脂肪細胞能力的實驗。實驗發現,成脂細胞數量相對GelMA和GM/M水凝膠有所減少,證明了GM/M-Li水凝膠釋放的Li+有一定抑脂作用。然而,體外與體內環境完全不同。因此,為了進一步研究,本研究建立了股骨頭壞死的兔模型,利用3D打印導航模板技術清理死骨后注射水凝膠進行治療。通過對兔股骨頭組織HE染色、免疫組化染色發現,GM/M-Li水凝膠有效促進了成骨與成血管。既往研究已經使用含有重組骨形態發生蛋白2、鍶或銅介孔生物玻璃達到促成骨目的[20-21,34-36];然而,在股骨頭壞死環境下,基礎炎癥水平的升高、脂肪代謝紊亂等因素可能會限制生物材料的成骨和血管生成能力。因此,為骨再生創造合適的微環境是必要的。本研究用鋰修飾了介孔生物玻璃。與已報道的改性介孔生物玻璃相比,GM/M-Li水凝膠除了具有成骨的雙重作用,還有助于股骨頭壞死的骨修復。

在過去的幾十年里,研究人員建立了許多動物模型,包括小鼠、大鼠、兔子、狗和豬。每種動物模型都有自己的優點和局限性,根據其獨特的特點,設計了基于不同動物模型的各種研究。兔子模型是最常用的動物模型之一,兔子在組織學、形態學、血流動力學等方面與人有相似之處[37],大/小鼠股骨頭較小,不利于導航模板水凝膠注入,因此本研究選擇了大白兔作為實驗動物模型。

盡管GM/M-Li水凝膠的骨組織仍未完全修復,未能獲得最佳數據,但這些結果仍表明GM/M-Li水凝膠具有促進骨再生和新生血管生成,同時調節骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化,降低激素性股骨頭壞死的破壞程度。在未來,筆者還將改進不同濃度鋰離子以及其他促骨生成金屬與水凝膠結合療效。同時繼續研究水凝膠與干細胞、生長因子、慢病毒等相互之間的結合作用以及精確度和控釋問題,進一步研究探索長期骨重建中組織的功能修復和再生能力。