線粒體活性氧靶向成像熒光探針概述

李穎穎，瞿 瑛，朱凌云

（國防科技大學(xué) 理學(xué)院，湖南 長沙 410073）

1 線粒體的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 線粒體簡介

1980 年，德國生物學(xué)家Altmann 通過光學(xué)顯微鏡在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種顆粒狀的物質(zhì)，并將其命名為小體（Bioblast），但Altmann 認(rèn)為小體是一種共生于細(xì)胞的細(xì)菌。隨后，1897 年生物學(xué)家Benda也觀察到了小體并將其命名為線粒體（Mitochondria）。隨著對線粒體的研究和認(rèn)識不斷加深，1948年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)線粒體是細(xì)胞進(jìn)行三羧酸循環(huán)的場所。自此，科學(xué)家逐漸認(rèn)識到線粒體在生命活動(dòng)中的重要位置，并對其開展了深入的研究［1-2］。

線粒體是一類包含雙層膜的封閉細(xì)胞器，一般為短棒狀或者球狀，直徑約為0.5~10 mm［3］。常規(guī)的線粒體，其長度約3 μm，直徑1 μm 左右，部分細(xì)胞中的線粒體長度可達(dá)10~20 μm（圖1A）［4］。線粒體的數(shù)量在不同類型的細(xì)胞中也存在差別，一般而言，每個(gè)細(xì)胞含有幾百到幾千不等的線粒體，但在心臟、肝臟、小腸等代謝旺盛的器官中，需要消耗更多能量，因此組成這些器官的細(xì)胞的線粒體數(shù)目更多，以為細(xì)胞活動(dòng)提供充足的能量。上述細(xì)胞中線粒體在細(xì)胞質(zhì)中所占的比例也較大，如在心肌細(xì)胞中，線粒體占細(xì)胞質(zhì)的50%。此外，線粒體在細(xì)胞中的分布也存在一定的規(guī)律，在細(xì)胞代謝旺盛的區(qū)域，其分布密度更大，如在腎細(xì)胞中線粒體緊靠微血管分布，而在動(dòng)物精子中，線粒體分布在鞭毛中區(qū)。在細(xì)胞代謝過程中，當(dāng)細(xì)胞對能量的需求發(fā)生改變時(shí)，線粒體會根據(jù)細(xì)胞的需要，在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行定向運(yùn)動(dòng)、變形、增殖以及相互融合［5］。總之，線粒體是一種動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，是細(xì)胞能量的“能量工廠”，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中起著較為關(guān)鍵的作用。

圖1 線粒體的基本結(jié)構(gòu)［4］（A），線粒體內(nèi)ROS的生成及其基本種類（B）Fig.1 The basic structure of mitochondria［4］（A），the generation of ROS in mitochondria and its general species（B）

線粒體作為細(xì)胞內(nèi)主要的能源產(chǎn)生室，在多種細(xì)胞事件中發(fā)揮著重要作用，例如三磷酸腺苷（ATP）的產(chǎn)生以及細(xì)胞死亡、凋亡等過程。線粒體除了給細(xì)胞提供生命活動(dòng)所需的能量，還是細(xì)胞的“化工廠”，是細(xì)胞中物質(zhì)氧化分解的場所。此外，線粒體還有維持細(xì)胞機(jī)能的各種功能，比如調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原水平、維持細(xì)胞的Ca2+穩(wěn)態(tài)、氧自由基的生成、細(xì)胞凋亡、電解質(zhì)平衡、調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期等。

1.2 線粒體內(nèi)的活性氧

線粒體進(jìn)行三羧酸循環(huán)時(shí)，消耗氧氣（O2），傳遞電子，最后將二磷酸腺苷（ADP）氧化磷酸化生成三磷酸腺苷（ATP），這一過程伴隨著活性氧（ROS）的產(chǎn)生［6］。線粒體中ROS的種類很多，最常見的有超氧化陰離子、過氧化氫（H2O2）、過氧亞硝基陰離子（ONOO-）等（圖1B）。其主要形成原理是，氧原子的最外電子層含有兩個(gè)未配對的電子，O2得到1 個(gè)電子形成，得到2 個(gè)電子并結(jié)合質(zhì)子（H+）后形成過氧化氫（H2O2），方程式為H2O2通過芬頓反應(yīng)得到3 個(gè)電子后，產(chǎn)生高活性的羥自由基（.OH）—（Fe2++H2O2→Fe3++.OH+OH–）［7］。ROS 作為信使分子參與許多生理過程［8-9］，因此線粒體功能紊亂會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈產(chǎn)生過量的ROS，并導(dǎo)致疾病發(fā)生。當(dāng)ROS含量超過細(xì)胞允許濃度時(shí)，則會造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激（Oxidative stress），從而影響細(xì)胞的正常生理過程，甚至?xí)T導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致衰老、神經(jīng)性退行等疾病的發(fā)生［10-11］。與此同時(shí)，研究者也利用ROS 殺死瘧原蟲或癌細(xì)胞，如青蒿素及其衍生物含有過氧橋（—O—O—）結(jié)構(gòu)，瘧原蟲代謝所產(chǎn)生的螯合鐵或者癌細(xì)胞中的鐵可使過氧橋還原，從而產(chǎn)生ROS 殺死瘧原蟲或癌細(xì)胞［12-14］。由此可見，對線粒體內(nèi)的ROS進(jìn)行研究，了解其在線粒體中的濃度和時(shí)空分布的變化，對揭示活性氧與生命體的相互作用有著重要的意義。目前用于檢測不同類型活性氧的方法很多，其中熒光成像具有高時(shí)空分辨率、高靈敏等優(yōu)勢，是監(jiān)控線粒體中ROS 的首選方法。ROS 在體內(nèi)存在的半衰期僅為15 s 左右，大量靈敏的熒光成像方法被開發(fā)并應(yīng)用于ROS成像和檢測，下文將對近幾年報(bào)道的活性氧熒光探針進(jìn)行簡單介紹。

2 線粒體內(nèi)活性氧的熒光探針

2.1 具有線粒體靶向功能的O2?-熒光探針

圖2 基于ICT的探針設(shè)計(jì)策略（A），探針HQ的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理［17］（B），探針HKSOX-1的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理［18］（C），探針1的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理［19］（D）Fig.2 The ICT based probe（A），the structure and response mechanism of probe HQ［17］（B），the structure and response mechanism of probe HKSOX-1［18］（C），the structure and response mechanism of probe 1［19（］D）

圖3 基于PET的探針設(shè)計(jì)策略（A），O2.-探針MF-DBZH的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理［20］（B）Fig.3 The strategy of the PET based probes（A），the structure and response mechanism of probe MF-DBZH［20］（B）

2.2 具有線粒體靶向功能的次氯酸熒光探針

作為生物體內(nèi)最重要的活性氧簇之一，次氯酸（HClO）/次氯酸鹽（ClO-）是髓過氧化物酶（MPO）催化H2O2和氯離子（Cl-）所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物。在免疫系統(tǒng)中，HClO 能夠?qū)ξ⑸锏娜肭制鸬揭欢ǖ姆烙饔谩?jù)報(bào)道，人體體液中HClO/ClO-的平均濃度約200 μmol/L，當(dāng)HClO/ClO-的含量低于或高于平均濃度時(shí)，會產(chǎn)生致病性氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生［21］。

目前的次氯酸熒光探針主要有3類。首先是以C=C 鍵為HClO/ClO-識別基團(tuán)的熒光探針，其結(jié)構(gòu)中的飽和C=C 鍵可以延長共軛結(jié)構(gòu)，使熒光發(fā)射波長紅移。但當(dāng)其與ClO-反應(yīng)時(shí)，探針內(nèi)的C=C鍵被破壞，形成醛基和環(huán)氧化合物等基團(tuán)，使得探針分子的共軛結(jié)構(gòu)及電子分布發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致探針的熒光增強(qiáng)或者發(fā)射波長改變。如Zhang 等［22］以吡啶陽離子為線粒體靶向基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的比率型熒光探針Zcp-Me（圖4A）用于 HClO/ClO-檢測。在420 nm 的光激發(fā)下，該探針發(fā)生FRET，在波長486 nm 下有微弱熒光，在波長609 nm 下有較強(qiáng)熒光。基于同樣的反應(yīng)機(jī)理，Yin等［23］設(shè)計(jì)合成了探針PZ-PY（圖4B），該探針具有選擇性高、檢出限（17.9 nmol/L）低等優(yōu)點(diǎn)。彭孝軍課題組［24］在2013年也報(bào)道了一種以C=C鍵為識別基團(tuán)的熒光探針PTZ-Cy2（圖4C），該探針是一種比率型的熒光探針，其通過將苯并噻嗪和半菁以雙鍵相連，可實(shí)現(xiàn)HeLa細(xì)胞線粒體中內(nèi)源性ClO-的成像。

圖4 次氯酸熒光探針Zcp-Me［22］（A），PZ-PY［23］（B）及PTZ-Cy2［24］（C）的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.4 The structures and response mechanism of HClO probes Zcp-Me［22］（A），PZ-PY［23］（B） and PTZ-Cy2［24］（C）

由于HClO/ClO-具有強(qiáng)氧化性，含硫族化合物（S 和Se）的熒光分子可以和HClO/ClO-發(fā)生氯化或氧化反應(yīng)生成相應(yīng)的氧化物，引起熒光探針光譜信號的變化。利用這一特性，彭孝軍課題組設(shè)計(jì)合成了用于ClO-檢測的熒光比色探針SeCy7［25］（圖5A），該探針以七甲川菁為熒光基團(tuán)，Se 為檢測基團(tuán)，具有響應(yīng)速度快、近紅外發(fā)光的優(yōu)勢，可實(shí)現(xiàn)活體大鼠體內(nèi)ClO-的成像。

圖5 次氯酸熒光探針SeCy7［25］（A），MitoClO［26］（B），Rh-Py［27］（C）以及RMClO-2［28］（D）的結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)理Fig.5 The structures and response mechanism of HClO probes SeCy7［25］（A），MitoClO［26］（B），Rh-Py［27］（C） and RMClO-2［28］（D）

HClO/ClO-的強(qiáng)氧化性使之可以和一系列基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，也可以將醛肟基團(tuán)氧化為相對應(yīng)的醛、羧酸或腈氧化物。基于這一氧化還原反應(yīng)可設(shè)計(jì)合成HClO 的反應(yīng)型熒光探針。2013 年，Peng 課題組［26］以氟硼二吡咯化合物（BODIPY）為熒光母體，肟基為HClO/ClO-識別基團(tuán)，合成了反應(yīng)型熒光探針MitoClO（圖5B）。該探針是一種熒光增強(qiáng)型探針，其與NaClO 反應(yīng)后，熒光增強(qiáng)35 倍，可被用于活體細(xì)胞MCF-7線粒體內(nèi)ClO-的監(jiān)測。

HClO/ClO-的強(qiáng)氧化性還可將酰肼/磺酰肼氧化為醛基和羧酸等基團(tuán)。Li 等［27］以羅丹明為母體，設(shè)計(jì)合成了檢測ClO-的關(guān)開型熒光探針Rh-Py（圖5C）。該探針與ClO-結(jié)合后，羅丹明上的酰肼部位發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，使羅丹明母體的熒光恢復(fù)。Rh-Py 可被用于檢測HeLa 細(xì)胞線粒體中的ClO-分子。Hou 等［28］將香豆素與羅丹明進(jìn)行連接，設(shè)計(jì)合成了探針RMClO-2（圖5D），該探針是首例用于檢測線粒體內(nèi)ClO-含量的比率熒光探針。RMClO-2對ClO-的響應(yīng)非常快（5 s內(nèi)），且靈敏度高、選擇性好，可用于線粒體外源性和內(nèi)源性ClO-的檢測。

2.3 具有線粒體靶向功能的H2O2熒光探針

H2O2是線粒體中一種重要的ROS［29］，正常生理濃度下的H2O2是有益的，但其含量異常會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，比如炎癥性疾病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病和心血管疾病等。

硼酸頻哪醇是常見的H2O2檢測基團(tuán)，在H2O2的氧化下，硼原子上形成氫鍵，然后經(jīng)過遷移、重排和水解生成羥基化合物，含有硼酸頻哪醇的探針結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其熒光性質(zhì)也隨之改變（圖6A）。如Shao 等［30］以甲基硼酸頻哪醇酯作為H2O2的反應(yīng)基團(tuán)，季銨喹啉單元作為線粒體的靶向基團(tuán)構(gòu)建了探針Mito-H2O2，該探針與H2O2反應(yīng)后“開啟”，釋放出咔唑衍生物的熒光，使體系在527 nm 處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)33 倍（圖6B）。Chang 等［31］基于該原理設(shè)計(jì)了具有線粒體靶向功能的熒光探針MitoPY1，可用于監(jiān)控氧化應(yīng)激情況下線粒體中過氧化氫的濃度變化（圖6C）。Kim 等［32］使用苯硼酸頻哪醇酯作為H2O2識別基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了可以檢測線粒體H2O2含量的比率型熒光探針SSP-Mito，可以檢測到深度大于100 μm的組織中的H2O2含量（圖6D）。

圖6 基于硼酸酯的H2O2熒光探針（A），H2O2熒光探針Mito-H2O2［30］（B），MitoPY1［31］（C），SSP-Mito［32］（D）的結(jié)構(gòu)及其與H2O2的反應(yīng)機(jī)理Fig.6 The borate-based fluorescent probe of H2O2（A），the structures and response mechanism of H2O2 probes of Mito-H2O2［30］（B），MitoPY1［31］（C），SSP-Mito［32］（D）

2.4 具有線粒體靶向功能的NO與ONOO-熒光探針

Xiao 等［33］以內(nèi)酰胺為NO 識別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了能夠檢測線粒體內(nèi)源性NO 的熒光探針Mito-Rh-NO（圖7A）。該探針可通過與NO 反應(yīng)，使內(nèi)酰胺開環(huán)并使羅丹明分子的熒光恢復(fù)。Guo 等［34］以鄰苯二胺為反應(yīng)位點(diǎn)，基于NO 與鄰苯二胺的成環(huán)反應(yīng)可阻止PET 使體系熒光恢復(fù)構(gòu)建的探針（圖7B）也可用于內(nèi)源性NO成像。

圖7 NO熒光探針Mito-Rh-NO［33］（A）及探針1［34］（B）的結(jié)構(gòu)式及其反應(yīng)原理Fig.7 The structures and response mechanism of NO probes Mito-Rh-NO［33］（A） and probe 1［34］（B）

Lu小組［35］設(shè)計(jì)了一種三苯胺衍生物比率型熒光探針TP-1Bz，該探針帶有1個(gè)乙烯基連接的N-甲基苯并噻唑，可用于線粒體中粘度和ONOO-的雙重成像（圖8A）。TP-1Bz 可與商業(yè)化線粒體燃料Mito Tracker Green 相媲美，共定位率高達(dá)0.98，已被用于活體組織內(nèi)ONOO-的檢測。Zhang 等［36］設(shè)計(jì)了一個(gè)可在數(shù)秒內(nèi)快速響應(yīng)ONOO-的熒光增強(qiáng)型探針1，其與ONOO-反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了85 倍，而且檢出限低至 4 nmol/L。Cheng 等［37］基于FRET 機(jī)理，設(shè)計(jì)了一個(gè)靶向的線粒體ONOO-雙光子比率型熒光探針MITO-CC（圖8B），其在試管溶液中對ONOO-的檢出限低至11.30 nmol/L，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了93 倍，20 s內(nèi)即可快速響應(yīng)ONOO-。

圖8 ONOO-熒光探針TP-1Bz［35］（A）和MITO-CC［37］（B）的結(jié)構(gòu)及其反應(yīng)機(jī)理Fig.8 The structures and response mechanism of ONOO-probes TP-1Bz［35］（A） and MITO-CC［37］（B）

3 總結(jié)與展望

靶向線粒體的ROS熒光探針對闡明線粒體內(nèi)ROS對活細(xì)胞、組織和生物體的復(fù)雜影響具有重要意義。通過合理巧妙的設(shè)計(jì)和改造能夠提高這些探針的特異性、動(dòng)力學(xué)響應(yīng)和應(yīng)用范圍，監(jiān)測線粒體內(nèi)H2O2、HClO、NO、ONOO-等ROS。雖然此類探針眾多，但其水溶性、靈敏度和準(zhǔn)確度仍有待進(jìn)一步提高；此外，活細(xì)胞超分辨熒光成像技術(shù)發(fā)展迅猛，如受激輻射損耗（STED）顯微術(shù)，突破了傳統(tǒng)顯微鏡200 nm 的分辨率極限，可觀測數(shù)十甚至數(shù)納米尺度死亡細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)，但高功率STED 對熒光團(tuán)的快速光漂白以及對細(xì)胞的光損傷很大程度上限制了其應(yīng)用。因此開發(fā)亮度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的熒光染料以滿足特定的成像要求，將有助于活體診斷和成像等生物醫(yī)學(xué)研究。