原位合成Au/泡沫鎳磁性基底用于表面增強拉曼快速檢測血清中免疫抑制劑代謝物

劉堯堯，李朵朵，郭小玉，文 穎，楊海峰

（上海師范大學 化學與材料科學學院，上海 200234）

硫唑嘌呤（Azathioprine）是免疫抑制劑，臨床用于惡性葡萄胎、急性白血病、絨毛膜上皮癌、紅斑狼瘡、血小板減少性紫癜、器官移植免疫抑制以及免疫治療腫瘤與自身免疫性疾病等。其藥理為硫唑嘌呤進入人體后，快速降解為代謝物6-巰基嘌呤（6-MP）。6-巰基嘌呤呈現嘌呤拮抗免疫抑制作用，能抑制腺嘌呤與鳥嘌呤合成，進而抑制合成相關DNA，達到抑制抗原敏感淋巴細胞增殖的作用，阻止其轉化成免疫母細胞［1-2］。硫唑嘌呤原藥在體內代謝快，很難直接檢測。因此，定量檢測血清中6-巰基嘌呤濃度，研究其藥代動力學過程［3］，對指導患者合理用藥和避免過度服用導致不良反應的臨床意義重大。6-MP的常用檢測方法有高效液相色譜（HPLC）法、分光光度法、電化學分析法和熒光光譜法等［4-8］，但上述方法存在無法快速檢測或分析靈敏度不高的問題。

1928 年，拉曼觀察到光非彈性碰撞現象，發現其頻率位移與分子振動特征頻率相關［9］。水分子拉曼散射效應弱、干擾小，拉曼光譜適合于分析水體系樣品。但大多數分子的散射截面積小于10-30，拉曼技術難以用于常規分析。20 世紀70 年代，表面增強拉曼散射（SERS）現象被偶然發現，并揭示了其物理化學機理［10］，隨著激光技術的發展，SERS 的應用場景被大大拓展。SERS 具有高靈敏度、分子特征性、樣品用量少和無需復雜樣品前處理的優點，又可實現無損分析［11］，有望成為藥物代謝研究的重要分析手段［12-13］。

生物樣本如血清、尿液等基質成分復雜，對檢測其中有機小分子的背景干擾大。本文基于多孔泡沫鎳片（0.25×0.25 cm2）原位還原制備納米金，獲得納米金-泡沫鎳基底（Au-NFs），可作為磁性SERS基底。該磁性基底呈現超順磁特性，賦予其高的保存穩定性；基于磁分離，可有效減少共存物光譜的干擾，提高分析選擇性；外加磁場，富集磁性基底，優化局域等離子場分布，增加了SERS 熱點“hot spots”的形成，能進一步提高光譜檢測靈敏度［14-15］。利用Au-NFs 快速SERS 分析6-巰基嘌呤，檢出限低至1×10-9mol/L，能滿足體內微量藥物監測的要求。Au-NFs 磁性基底制備和用于硫唑嘌呤原藥代謝產物6-巰基嘌呤SERS分析的示意圖如圖1。

圖1 Au-NFs磁性基底合成及對6-MP分子檢測示意圖Fig.1 Schematic diagram of the preparation of magnetic Au-NFs substrates and SERS assay for 6-MP as azathioprine metabolite molecule

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

4-巰基吡啶（4-MPy，分析純）和氯金酸（分析純）購于國藥試劑有限公司。6-巰基嘌呤（89.4%）購于中國標準品生物制品檢定所。實驗用水為三次去離子水。泡沫鎳（孔徑0.23 mm，厚度0.3 mm，蘇州佳士德泡沫金屬有限公司）用水洗凈備用。玻璃器皿在王水溶液（鹽酸∶硝酸=3∶1）中浸泡24 h，用水多次洗滌后干燥備用。人血清樣品來自醫院健康志愿者，在低溫冰箱內（-20 ℃）保存備用。

1.2 儀器設備

用掃描電子顯微鏡（SEM，S-4800，日本Hitachi 公司）表征Au-NFs 復合基底的形貌。利用X 射線能譜儀（EDS，S-4800，日本Hitachi 公司）分析復合基底的元素組成。用紫外-可見分光光度計（型號為7504，上海鑫茂儀器有限公司）采集金納米粒子的表面等離子體共振光譜。采用SuperLabramⅡ型共聚焦顯微激光拉曼儀（氦-氖離子激光器，半導體冷卻的CCD 檢測器，法國Dilor 公司）進行拉曼測定，每次光譜采集曝光時間為8 s，累積次數為3 次。使用液相色譜儀（LC20A，日本島津公司）檢測加標人血清中6-MP的含量。

1.3 磁性復合SERS基底制備

先用剪刀將泡沫鎳剪成小片（0.25×0.25 cm2）。在室溫下，將泡沫鎳小片置于濃氨水中浸泡30 min，去除表面氧化層至呈現金屬光澤。水洗后，在1% HAuCl4溶液中靜置，反應10 min 后進行磁分離，水洗獲得Au-NFs片備用。

1.4 磁性SERS基底檢測4-MPy

稀釋4-巰基吡啶標準溶液，獲得不同濃度的分析溶液，將Au-NFs 浸入其中自組裝，靜置1 h 后磁分離，用吸水紙吸去多余液體，進行SERS檢測。對氯金酸用量、反應時間進行了實驗條件優化。

1.5 Au-NFs基底用于6-MP快速檢測

分別配制5×10-5、5×10-6、5×10-7、5×10-8、5×10-9mol/L 的6-MP 溶液，在磁場優化條件下，利用Au-NFs片進行SERS定量性能考察。

將血清與甲醇1∶1（體積比）混合均勻，6 000 r/min 離心15 min。取上清液用去離子水稀釋10 倍，6-MP 加標濃度分別為5×10-4、5×10-5、5×10-6mol/L，與基底等體積混合均勻，磁吸分離和聚集后進行SERS檢測。

2 結果與討論

2.1 Au-NFs磁性SERS基底的制備

Au-NFs 磁性SERS 基底制備過程的SEM 表征結果見圖2。SEM 圖（圖2A、B）表明氨水作用后泡沫鎳的表面光滑干凈。在1%氯金酸溶液中反應10 min 后基底的SEM 圖如圖2C、D 所示，圖中可見泡沫鎳表面變得粗糙，形成了花簇狀納米金，且在表面均勻分布，有利于形成局域等離子場熱點。Au-NFs磁性SERS基底的EDS表征結果表明有Au和Ni元素存在（圖3A）。

圖2 氨水處理后的泡沫鎳（A、B）和Au-NFs磁性復合材料（C、D）的SEM表征圖Fig.2 SEM characterizations of cleaned surface nickel foam by using ammonia solution（A，B）and Au-NFs magnetic composites（C，D）

圖3 Au-NFs磁性SERS基底的EDS圖與元素分布（A）以及超聲處理后金納米溶液的紫外表征結果（B）Fig.3 EDS image and elemental distribution of magnetic SERS substrates for Au-NFs（A），UV characterization of the Au nanoparticles removed from composites by supersonic assay（B）

將Au-NFs磁性基底放入有水的小燒杯中，超聲處理15 min，取上層淡紅色溶液進行紫外表征。圖3B 中533 nm 處的峰歸屬于納米金表面等離子體共振（SPR）吸收。綜上所述，成功制備了磁性復合SERS基底Au-NFs。

2.2 基質制備條件的優化

以4-MPy 為探針分子，優化Au-NFs 磁性復合材料的制備條件，包括泡沫鎳與1%氯金酸反應時間和氯金酸的濃度。從圖4A 及圖2D 的SEM 圖中可見，不同反應時間（5、10、15 min）得到的復合基底形貌不同。反應時間過短（5 min）時，金納米過于分散，不利于形成強的局域表面等離子場耦合，SERS效果不理想。延長反應時間（15 min），則導致納米金過度團聚，大大減弱其SERS效應。從圖4B 可見，1%氯金酸與泡沫鎳片反應10 min獲得的SERS信號最強。實驗選擇最佳反應時間為10 min。

圖4 泡沫鎳與1% HAuCl4靜置反應不同時間Au-NFs上采集的4-MPy（10-5 mol/L）的SEM圖（A）與SERS光譜（B）Fig.4 SEM images（A） and SERS spectra（B） of 4-MPy（10-5 mol/L） on Au-nickel foam magnetic composite synthesized by the reaction of nickel foam with 1% HAuCl4 for different time a：5 min；b：15 min

反應時間設為10 min，對反應中氯金酸溶液的用量（0.1%、1%、4%和5%）進行了優化。結果顯示，氯金酸溶液濃度過低時，泡沫鎳表面的粗糙度變化小，形成的納米金形貌無規則；濃度過高時，在泡沫鎳表面有大量的針尖狀納米金生成，并嚴重堆積，不利于SERS檢測。將泡沫鎳與不同濃度的氯金酸反應10 min后檢測10-5mol/L的4-巰基吡啶，圖5顯示用1%氯金酸溶液反應制得的基底SERS效應最優。

圖5 泡沫鎳與不同濃度 HAuCl4 靜置反應10 min獲得不同Au-NFs基底上4-MPy的SERS光譜Fig.5 SERS spectra of Au-nickel foam magnetic composite synthesized by the reaction of nickel foam in different concentrations of HAuCl4 solutions for 10 min and 4-MPy（10-5 mol/L） as Raman probe

2.3 基于磁性Au-NFs基底檢測4-MPy

采用在最優條件下制得的Au-NFs 磁性基底檢測不同濃度的4-MPy 溶液，如圖6A 所示，其可以檢測低至1×10-9mol/L 的4-MPy，證明該基底的靈敏度很高。選擇1 577.8 cm-1處的峰值強度，繪制標準曲線（如圖6B）。在5×10-5~5×10-9mol/L 范圍內線性良好（r2=0.946），檢出限（S/N=3）為5×10-9mol/L。

圖6 最優條件下制得Au-NFs磁性復合基底檢測不同濃度4-MPy溶液的SERS光譜（A）；基于1 577 cm-1處SERS峰值強度和相應濃度4-MPy繪制的標準曲線（B）Fig.6 SERS spectra of 4-MPy solutions with different concentrations on the optimal Au-NFs magnetic composite（A），standard curve plotted based on the peak intensities of SERS at 1 577 cm-1 and the corresponding concentrations of 4-MPy solutions（B）concentration of 4-MPy（a-f）：5×10-5，5×10-6，5×10-7，5×10-8，5×10-9，1×10-9 mol/L

考察了基底的穩定性，實驗結果顯示，基底在25 ℃下儲存13 天后，檢測4-MPy（10-5mol/L）的SERS強度基本保持穩定，相對標準偏差為3.1%。因此，Au-NFs基底具有良好的穩定性。

2.4 基于磁性Au-NFs基底檢測6-MP

考察了基于Au-NFs 磁性基底對6-MP SERS 分析的定量性能。圖7 為固體6-MP 的常規拉曼光譜及SERS光譜圖，比較可見，436 cm-1處的拉曼峰來自C—S的變形振動，863 cm-1處的峰可歸屬為υC8-H+υN7-C8+υN9-C8組合振動，證明6-MP分子以Au—S鍵吸附在金表面上。在1 001 cm-1和1 141 cm-1附近的峰是嘌呤環的呼吸振動；1 330 cm-1處的SERS峰歸屬為C5-N7變形振動；1 260 cm-1和1 281 cm-1處的拉曼峰分別歸屬于C2-N1-C6 和N1-C2-N3 的變形振動；1 399 cm-1處的峰對應于H-C8-N9 的變形振動［14］。

圖7 固體 6-MP的拉曼光譜（藍）及最優Au-NFs磁性基底測得的SERS光譜（紅）Fig.7 Raman spectrum of solid 6-MP（blue） and SERS spectrum of 6-MP on the optimal substrate（red）inset is the structure of 6-MP

利用不同濃度梯度6-MP溶液與Au-NFs磁性基底孵化組裝，磁富集優化后，采集SERS光譜圖。如圖8A 所示，在大于1 200 cm-1之后的范圍內，空白基底無明顯的背景信號，因此，以1 260 cm-1處的特征峰進行6-MP 的定量分析，可避免干擾。圖8B 為對應的峰強度與濃度關系圖，如內插圖所示，其在5×10-7~1×10-8mol/L濃度范圍內呈線性關系（r2=0.94），檢出限可達1×10-9mol/L。

圖8 基于Au-NFs復合基底檢測不同濃度6-MP溶液以及基底空白的SERS光譜（A），1 260 cm-1處的峰強與6-MP濃度關系圖（B）Fig.8 SERS spectra of different concentrations of 6-MP solutions and blank substrate on Au-NFs composite substrates（A），and the plot on SERS peak intensities at 1 260 cm-1 versus 6-MP concentrations （B）concentration of 6-MP（a-g）：5×10-5，5×10-6，5×10-7，5×10-8，5×10-9，1×10-9 mol/L and blank substrate；the inset is the linear relationship between the peak intensity and lgc（6-MP） from 5×10-7 to 1×10-8 mol/L（B）

基于Au-NFs 基底，采用SERS 檢測了人血清中加標6-MP 的模擬樣品。如圖9 所示，血清中的6-MP 濃度低至5×10-6mol/L 仍有較強的拉曼信號。利用公式P=（C2-C1）/C3×100%估算加標回收率，其中，P為回收率，C1為未加標空白樣中的6-MP 含量，C2為加標后樣品的6-MP 測定值，C3代表加標值。結果顯示，SERS 分析和HPLC 分析加標1×10-5mol/L 6-MP 的回收率分別為94.8%和95.8%，均在合理范圍內，驗證了基于Au-NFs 基底SERS方法的可靠性。但HPLC 無法檢出人血清中更低濃度的6-MP。本SERS方法檢測血清加標nmol/L濃度水平的6-MP，其回收率為92.8%~107%（表1），表明基于Au-NFs 基底，磁優化后檢測6-MP 的分析可靠性好，無需復雜的樣品前處理。

圖9 Au-NFs磁性基底檢測血清中不同濃度6-MP的SERS譜圖Fig.9 SERS spectra of different concentrations of 6-MP in serum detected by Au-NFs magnetic substrate

配制血清中可能存在的干擾物質與6-MP 混合溶液如下：1×10-6mol/L 6-MP、1×10-6mol/L 多巴胺（DA）、1×10-6mol/L 抗壞血酸（AA）、1×10-3mol/L 葡萄糖（Glucose）和5×10-4mol/L 半胱氨酸（Cysteine）。如圖10 所示，基于1 298 cm-1處6-MP 的特征SERS 峰定量，在磁性基底Au-NFs 上分析6-MP 具有良好的選擇性。

圖10 Au-NFs基底檢測1×10-6 mol/L 6-MP、1×10-6 mol/L DA、1×10-6 mol/L AA、1×10-3 mol/L 葡萄糖和 5×10-4 mol/L 半胱氨酸的SERS圖（A）以及基于1 298 cm-1處峰值強度統計（B）Fig.10 SERS spectra of 1×10-6 mol/L 6-MP，1×10-6 mol/L DA，1×10-6 mol/L AA，1×10-3 mol/L glucose，and 5×10-4 mol/L cysteine detected by Au-NFs substrate（A），and corresponding statistical bars based on the peak intensities at 1 298 cm- 1（B）

與文獻中SERS 基底檢測6-MP 的方法進行了分析性能比較。如表2 所示，基于Au-NFs 基底SERS方法有較低的檢出限、較寬的線性范圍及較高的回收率，且基底制備過程簡單快速，可用于臨床代謝藥物檢測。

表2 不同SERS基底用于檢測6-MP的方法性能比較Table 2 Method performance comparison of SERS detection of 6-MP

3 結 論

本研究原位制備的磁性基底Au-NFs具有高的SERS活性，分析6-巰基嘌呤的檢出限低至1×10-9mol/L。利用磁富集分離和磁優化基底聚集，能實現對血清中免疫抑制劑硫唑嘌呤代謝物6-巰基嘌呤的快速和高靈敏定量分析，血清中加標6-巰基嘌呤經SERS 檢測的回收率為92.8%~108%，表明方法可靠。該分析策略結合便攜式拉曼，有望為臨床治療提供高靈敏、快速的藥物代謝檢測方法。