基于能量轉(zhuǎn)移的光響應(yīng)型生物探針在分子醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用

黃文文，張 玉，李 琪，方興如，劉洪林

（合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)時代進入到精密分子醫(yī)學(xué)時代，需要從分子水平上，即通過對DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物等的識別、定量與定位等方式來揭示疾病的發(fā)生與發(fā)展［1-3］。開發(fā)各種生物分析方法精準(zhǔn)測定疾病相關(guān)特定生物分子與相關(guān)微環(huán)境的變化，并在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中監(jiān)測這些動態(tài)過程，有助于解析這些生物分子與相關(guān)微環(huán)境變化在疾病發(fā)生、發(fā)展與治療中的作用。生物傳感與成像技術(shù)具有無創(chuàng)性、近實時反饋、高精度、高可靠性等特點，逐漸成為藥物發(fā)現(xiàn)、疾病診斷和治療預(yù)后的重要技術(shù)手段［4］。在各種生物傳感和成像探針中，光譜分析法［5］、熒光分析法［6］和光學(xué)成像法［7］等光學(xué)方法由于具有高特異性和高靈敏度等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。目前已開發(fā)出許多能夠在細(xì)胞甚至單分子水平上監(jiān)測生物事件發(fā)生發(fā)展的光學(xué)納米探針，可用于疾病的早期檢測、準(zhǔn)確診斷和治療。基于光學(xué)納米探針的生物傳感和光學(xué)成像具有能夠連續(xù)監(jiān)測關(guān)鍵的代謝物、成像靈敏度高（在μmol/L范圍內(nèi)）、成本低等特點，能夠提供高分辨率圖像，無需使用放射性造影劑、無電離輻射，是一種方便、安全的可視化生物過程和疾病進展的先進實驗技術(shù)［4，8-11］。光學(xué)生物傳感和光學(xué)生物成像技術(shù)能輔助疾病的鑒定與治療。例如，檢測生物標(biāo)志物變化（如pH值［12-13］），對細(xì)胞或代謝產(chǎn)物的種類與含量等進行定位［14-17］與定量分析［18-22］。其中，基于能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)生物傳感和生物成像技術(shù)除了具備高特異性和高靈敏度的優(yōu)點外，還具有靈活精確的距離控制［23］，可以實現(xiàn)更靈敏、更廣泛和更精準(zhǔn)的傳感。上述優(yōu)點使基于能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)探針特別適合于研究活細(xì)胞體系中的分子事件動態(tài)變化，逐漸應(yīng)用于腫瘤成像、藥物篩選和疾病標(biāo)志物等醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用。

各種能量轉(zhuǎn)移模式如生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）、化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（CRET）、F?rster 共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）及等離子體參與的納米金屬表面能轉(zhuǎn)移（NSET）和等離子體共振能量轉(zhuǎn)移（PRET）等被廣泛應(yīng)用。其中BRET 使用生物發(fā)光蛋白產(chǎn)生的生化能量激發(fā)熒光團，是一種基于遺傳編碼和鄰近距離的檢測工具，用于研究生物分子間的相互作用，但由于其需要利用遺傳編碼技術(shù)，對含有外源性報告基因的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性問題阻礙了該技術(shù)在人類研究中的應(yīng)用［24-26］。CRET通過化學(xué)發(fā)光供體向相應(yīng)受體進行非輻射能量轉(zhuǎn)移，由于其背景自發(fā)熒光可忽略而在生物傳感方面顯示出巨大潛力，但仍受到其復(fù)雜化學(xué)偶聯(lián)和短半衰期發(fā)光的限制［27］。FRET是最廣泛應(yīng)用于生物分析、傳感和成像的分子標(biāo)尺，其能量供體和能量受體均為熒光團，但能量轉(zhuǎn)移效率依賴于散射光譜和受體分子吸收光譜之間的重疊程度，且其發(fā)生距離在1~10 nm 范圍內(nèi)［28-29］。NSET 效應(yīng)中的能量供體和能量受體分別是熒光團和等離子體納米粒子，與FRET 效率高度依賴于能量供體-受體光譜重疊和作用距離范圍不同，NSET在光譜重疊方面沒有明確的要求，且突破了FRET 作用距離的壁壘，具有更大的距離分辨率，極大地擴展了NSET 的應(yīng)用領(lǐng)域［30］。PRET 效應(yīng)中等離子體納米粒子作為能量供體，熒光團作為能量受體，通過等離子體納米金屬的瑞利散射光譜進行信號反饋，避免了熒光團自猝滅和光漂白現(xiàn)象，具有更高的信噪比和穩(wěn)定性，在單個納米顆粒水平的精確跟蹤和敏感檢測方面具有無與倫比的優(yōu)勢［31］。本文總結(jié)了目前基于3種能量轉(zhuǎn)移方式（即FRET、NSET及PRET）的光學(xué)探針在分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一些應(yīng)用范例。

1 基于FRET的光學(xué)探針及其生物傳感和成像應(yīng)用

1948年，F(xiàn)?rster在理論上首次建立了FRET模型［28］。在FRET模型中，能量從供體熒光團轉(zhuǎn)移到受體熒光團，其發(fā)生距離在1~10 nm范圍內(nèi)［28-29］。在FRET中，供體和受體均被認(rèn)為是點偶極子，被激發(fā)的供體將非輻射激發(fā)能轉(zhuǎn)移給受體。這一過程由高能共振中供體發(fā)射和受體吸收的過渡偶極矩之間的偶極-偶極相互作用驅(qū)動。FRET 技術(shù)非常方便，可在單分子檢測極限下常規(guī)應(yīng)用。目前，基于FRET過程，研究人員開發(fā)了相關(guān)納米尺模型，其是最廣泛應(yīng)用于生物分析、傳感和成像的分子標(biāo)尺。FRET納米尺熒光靈敏度高，成本相對低，具有在活細(xì)胞中進行實時生物化學(xué)測定和多路復(fù)用等優(yōu)勢［32］。

1.1 基于FRET的生物傳感

基于FRET 能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)生物傳感器已獲得廣泛應(yīng)用，其因獨特的檢測性能在疾病診斷和治療中發(fā)揮著非常重要的作用，可從多種類型的臨床標(biāo)本（體液、細(xì)胞、組織）中量化靶標(biāo)（蛋白質(zhì)、核酸、代謝物、藥物、毒素、人體細(xì)胞和其他病原體）［33-35］，用于多種類型的癌癥生物標(biāo)志物監(jiān)測［36］。快速和高靈敏度的DNA 檢測是診斷遺傳病的關(guān)鍵，基于FRET 的光學(xué)傳感器在基因診斷和分析以及癌癥風(fēng)險預(yù)測等方面發(fā)揮了重要作用。如Wabuyele 等［37］利用單對熒光共振能量轉(zhuǎn)移（spFRET）檢測KRAS癌基因的點突變，能夠直接從未擴增的基因組DNA 中檢測低豐度點突變，處理時間僅為5 min，比傳統(tǒng)方法快近100 倍。作者基于連接酶的點突變檢測試驗，使用等位基因特異性鑒別靶標(biāo)引物和普通引物，兩種引物各具有10個堿基對（bp）的互補臂，在其5'和3'端用熒光染料標(biāo)記；各有一個能夠與點突變的目標(biāo)DNA 模板鏈互補配對的臂序列，以供FRET 過程的發(fā)生發(fā)展。當(dāng)這兩個引物與發(fā)生點突變的目標(biāo)DNA模板鏈完美匹配時，熱穩(wěn)定的DNA連接酶將兩個相鄰的引物以共價鍵形式連接，形成一個分子信標(biāo)，此時熒光標(biāo)簽距離變近，F(xiàn)RET 發(fā)生。相反，未連接的引物不發(fā)生FRET。因此，根據(jù)FRET 熒光信號的變化，可以鑒別DNA 鏈?zhǔn)欠癜l(fā)生突變，從而推斷癌癥發(fā)生的可能性（圖1A）。除了能監(jiān)測DNA是否發(fā)生突變之外，基于FRET 的光學(xué)生物傳感器還能對極低濃度靶標(biāo)分子進行量化分析。如Zhang等［38］構(gòu)建了一種基于FRET 技術(shù)的超靈敏納米傳感器，該傳感器能夠以無分離形式檢測低濃度靶標(biāo)DNA，檢測限低至5 fmol/L。該系統(tǒng)使用量子點（QD）與DNA探針相連以捕獲DNA靶標(biāo)鏈。DNA靶標(biāo)鏈與染料標(biāo)記的報告鏈結(jié)合，從而促使FRET 供體-受體間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移過程。QD 還被用作集中器，通過將幾個DNA 靶標(biāo)限制在納米級域中放大目標(biāo)信號，即使與少量DNA靶標(biāo)（約50個拷貝或更少）結(jié)合，它們也會產(chǎn)生非常明顯的FRET 信號，其中未結(jié)合的納米傳感器產(chǎn)生接近零的背景熒光（圖1B）。這種一個能量供體捕獲多個受體的能力不僅有助于提高整體的能量轉(zhuǎn)移效率、放大熒光信號達到高精度檢測低豐度靶標(biāo)，還可以通過熒光信號強度對靶標(biāo)進行定量研究。蛋白質(zhì)也是疾病的生物標(biāo)志物之一，對蛋白質(zhì)構(gòu)象變化進行監(jiān)控有利于了解疾病的發(fā)生與發(fā)展。Lo等［39］開發(fā)了一種時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）生物傳感器，用于在高通量篩選（HTS）平臺上檢測神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的一種內(nèi)在紊亂蛋白（IDPs），即微管結(jié)合蛋白Tau（Microtubule-associated protein Tau，Tau）低聚物和單體構(gòu)象的微小變化。此外，HTS 平臺與細(xì)胞熒光生物標(biāo)志物結(jié)合，可以應(yīng)用于開發(fā)其它基于IDPs引起的神經(jīng)退行性疾病的藥物（圖1C）。近來，Xiao 等［40］利用QD 為能量供體和水溶性AIEgen 染料（（E）-4-（4-（二苯基氨基）苯基）-1-（3-（三甲氨基）丙基）吡啶-1-溴化鋁，命名為TVP）為能量受體，設(shè)計了一種基于FRET 信號的細(xì)胞外囊泡（EV）膜蛋白檢測系統(tǒng)（EV－MPDS），該系統(tǒng)消除了EV 的提取和純化，從而快速簡便地診斷肺癌。具體來說，使用TVP 標(biāo)記EV 膜，附加適體的量子點（AP-QDs）作為特異性蛋白標(biāo)記探針標(biāo)記癌細(xì)胞分泌的EV 膜上的目標(biāo)蛋白，利用FRET 技術(shù)不分離地檢測癌細(xì)胞分泌的EV，當(dāng)FRET 信號開啟，表明TVP 和AP-QDs 共同標(biāo)記同一個EV 粒子膜上，證實此EV 與癌細(xì)胞分泌相關(guān)，這種雙標(biāo)記系統(tǒng)可用于評估目標(biāo)EV濃度。與傳統(tǒng)ELISA檢測方法相比，該系統(tǒng)在癌癥診斷方面顯示出更高的準(zhǔn)確性（100%與65%）和靈敏度（100%與55%），且該系統(tǒng)能夠直接從細(xì)胞培養(yǎng)上清液或血液中分析EV，消除了復(fù)雜的EV提取過程，從而避免了樣品的異質(zhì)性和潛在的誤差，具有幫助肺癌診斷和早期篩查的潛力（圖1D）。

圖1 用于分析KRAS癌基因低豐度點突變的單對熒光共振能量轉(zhuǎn)移（spFRET）檢測示意圖［37］（A）；基于FRET的單量子點DNA納米傳感器示意圖［38］（B）；用于篩選Tau低聚物和單體構(gòu)象的微小變化的時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）生物傳感器檢測示意圖［39］（C）；基于FRET的EV-MPDS用于準(zhǔn)確便捷診斷肺癌示意圖［40］（D）Fig.1 Schematic diagram of single-pair fluorescence resonance energy transfer（spFRET） detection for the analysis of low abundant point mutations in KRAS oncogenes［37］（A）；schematic diagram of FRET-based single-QD DNA nanosensor［38］（B）；schematic diagram of time-resolved fluorescence resonance energy transfer（TR-FRET） biosensor detection for screening Tau oligomers and small changes in monomer conformation［39］（C）；schematic illustration of EV-MPDS based on FRET for accurate and convenient diagnosis of lung cancer［40］（D）

1.2 基于FRET的生物成像

基于FRET技術(shù)的光學(xué)探針可在活細(xì)胞體系中可視化相關(guān)的分子事件，并且基于FRET的生物成像技術(shù)可以利用活細(xì)胞成像研究生物系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境變化分析或進行疾病診斷等。如Wen 等［41］報道了一種基于萘酰亞胺－羅丹明的FRET 比例熒光探針用于細(xì)胞pH 的感應(yīng)，該探針通過比例熒光強度精確地響應(yīng)不同的pH 值，可以根據(jù)細(xì)胞中不同的熒光信號強度區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞（圖2A）。Lei等［42］開發(fā)了一種FRET-肽測定方法，用于分析甲狀腺乳頭狀癌（PTC）和甲狀腺結(jié)節(jié)（TN）患者的各種細(xì)胞系和臨床甲狀腺組織樣本中的多重基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性（圖2B）。Huang等［14］報道了一種基于FRET的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR），用于在單個細(xì)胞和組織切片中高度敏感和選擇性地原位可視化腫瘤相關(guān)mRNA 的表達。該策略基于3個可編程DNA 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的使用，即H1、H2和H3 3種發(fā)夾結(jié)構(gòu)。H1被設(shè)計為包含與靶標(biāo)TK1 mRNA 互補的序列。在適當(dāng)?shù)奈恢梅謩e用熒光受體羧基四甲基羅丹明（TAMRA）和供體羧基熒光素（FAM）標(biāo)記H2 和H3。在靶標(biāo)mRNA 存在的情況下，H1 被靶標(biāo)通過互補配對作用打開，打開的H1 與H2 的粘性末端配對，H2 通過無偏差鏈位移置換反應(yīng)打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)。新暴露的H2 與H3粘性末端配對，打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，露出H3上的粘性末端，從而再次打開H2。靶標(biāo)mRNA 的每個拷貝均可在H2和H3發(fā)夾結(jié)構(gòu)之間產(chǎn)生雜交連鎖反應(yīng)，形成有切口的雙鏈體。每對H2-H3雜交事件均會產(chǎn)生FRET 信號，形成級聯(lián)效應(yīng)來放大熒光信號。然而，當(dāng)沒有靶標(biāo)mRNA 存在時，由于各發(fā)夾結(jié)構(gòu)是閉合的，保持亞穩(wěn)態(tài)，不發(fā)生FRET 過程（圖2C）。這種級聯(lián)效應(yīng)放大熒光信號策略可以避免多次洗滌步驟，并在一定程度上避免由于探針積累或降解而產(chǎn)生的假陽性信號。半胱天冬酶可通過天冬氨酸特異性裂解多種細(xì)胞底物介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥，與多種疾病密切相關(guān)［43］。近來，Procházková 等［44］合成了一種新型的基于FRET 的光穩(wěn)定熒光探針，在熒光顯微鏡下對細(xì)胞中半胱天冬酶的酶活性進行長期敏感和選擇性的監(jiān)測。此探針由1 個具有半胱天冬酶特異性可切割肽組成，在肽的兩側(cè)分別修飾有能量供體QD和黑洞猝滅劑-2（BHQ2），在沒有半胱天冬酶時，QD和猝滅劑BHQ2發(fā)生FRET，QD激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移給BHQ2，QD 的熒光信號關(guān)閉；當(dāng)存在半胱天冬酶時，連接QD 和BHQ2 的肽段被切割，QD 和BHQ2的距離超過FRET 作用距離，QD 的熒光信號恢復(fù)。根據(jù)細(xì)胞成像結(jié)果，可監(jiān)測半胱天冬酶活性。這種發(fā)光探針比商業(yè)產(chǎn)品提供了更長的半胱天冬酶成像時間，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)光信號的穩(wěn)定性超過14 天。此探針用QD和BHQ2作為FRET的能量供體-受體，避免了傳統(tǒng)熒光團的光漂白和自猝滅，使成像效果更穩(wěn)定（圖2D）。

圖2 基于FRET的比例熒光探針通過監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)pH區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的工作原理［41］（A）；Au/Ag@SiO2底物的制備及FRET肽微陣列MEF檢測MMPs活性的原理［42］（B）；基于FRET的HCR法原位檢測TK1 mRNA的工作原理［14］（C）；基于FRET的光穩(wěn)定熒光探針用于單個細(xì)胞內(nèi)半胱天冬酶活性長時間成像的工作原理［44］（D）Fig.2 Working principle for distinguish cancer cells from normal cells by monitoring intracellular pH in living cells using the FRET-based proportional fluorescent probes［41］（A）；preparation of Au/Ag@SiO2 substrate and the principle of FRET-peptide microarray-based MEF detection for multiple profiling of MMPs activities［42］（B）；working principle for the in situ detection of TK1 mRNA using the FRET-based HCR method［14］（C）；working principle for a long-time imaging of active caspases inside individual cells［44］（D）

現(xiàn)有基于FRET 能量轉(zhuǎn)移構(gòu)建的傳感器或診療技術(shù)，往往受限于FRET 檢測量程（＜10 nm）。并且，F(xiàn)RET 模型中涉及的熒光團不可避免地存在光漂白、自猝滅、可選擇性有限等弊端。但是，基于FRET能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)生物傳感和生物成像技術(shù)在基礎(chǔ)研究和臨床診斷等方面仍具有一定的潛力和應(yīng)用前景。

2 基于NSET的光學(xué)探針及其生物傳感與成像應(yīng)用

2005年，Strouse課題組［30］首次報道了NSET模型。在NSET模型中，能量從供體熒光團轉(zhuǎn)移到受體納米金屬表面，其檢測量程打破了傳統(tǒng)FRET 的障礙，即＞10 nm。在NSET 中，供體熒光團被認(rèn)為是點偶極子，而受體納米金屬表面被看作薄膜鏡面以容納更多的能量［30］。Strouse 課題組研究表明，對于直徑1.4 nm 的金納米顆粒（AuNPs），NSET 檢測量程可擴展到22 nm，這是傳統(tǒng)FRET 檢測極限的兩倍多。與FPRE 分子間的偶極-偶極相互作用機制不同，NSET 過程中存在等離子體納米粒子，其主要由偶極子-納米金屬表面非輻射能量轉(zhuǎn)移機制驅(qū)動，即從分子偶極子轉(zhuǎn)移到納米金屬表面的強相互作用。此外，NSET 的顯著優(yōu)點不僅在于探測距離比FRET 更長，還在于NSET 猝滅效率更高，具有較優(yōu)異的高信噪比和靈活的檢測距離，能夠?qū)崿F(xiàn)更靈敏、更廣泛的傳感探測與分析［23］。

2.1 基于NSET的生物傳感

基于NSET過程構(gòu)建的生物傳感器已被用于疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的檢測。如Griffin等［45］報道了超敏感的基于金納米顆粒的NSET 方法用于篩查丙型肝炎病毒RNA，獲得了優(yōu)異的靈敏度（800 fmol/L）和選擇性（單堿基對錯配）（圖3A）。Yuan 等［46］利用4-磺酸苯基卟啉（TPPS4）為能量供體和金納米棒（AuNRs）為能量受體構(gòu)建的NSET 平臺，高選擇性、高靈敏度地痕量檢測人尿液中惡性腫瘤標(biāo)志物精胺含量，用于癌癥的早期診斷。當(dāng)精胺不存在時，具有雙鏈結(jié)構(gòu)的小牛胸腺DNA（ctDNA）對AuNRs 表現(xiàn)出更強的靜電相互作用，從而驅(qū)使TPPS4 遠(yuǎn)離AuNRs 表面，使TPPS4 熒光恢復(fù)。當(dāng)精胺存在時，在酸性條件下，精胺表現(xiàn)出多陽離子性質(zhì)，通過靜電吸引和凹槽結(jié)合，對ctDNA 陰離子磷酸主鏈具有很強的親和性，形成縮聚聚集并從AuNRs 表面釋放，TPPS4 被吸附到AuNRs 表面，激發(fā)態(tài)能量從能量供體TPPS4轉(zhuǎn)移到能量受體AuNRs 上，導(dǎo)致TPPS4 的熒光發(fā)生猝滅，且猝滅效率與精胺的濃度成正比（圖3B）。Pramanik 等［47］利用羅丹明6G（Rh-6G）染料和金納米星分別作為能量供體和能量受體構(gòu)建了基于NSET過程的傳感平臺，可用于檢測和滅活冠狀病毒SARS-CoV-2。在沒有抗原或病毒存在時，Rh-6G 染料偶聯(lián)刺突蛋白特異性適配體附著在金納米星上，此時，Rh-6G 的激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移給金納米星，發(fā)生NSET，Rh-6G 的熒光信號關(guān)閉，當(dāng)SARS-CoV-2抗原或病毒存在時，由于刺突蛋白特異性適配體與抗原或病毒上的刺突蛋白結(jié)合，金納米星與染料之間的距離增加，熒光信號持續(xù)存在。通過NSET 信號變化可以檢測抗原或病毒并根據(jù)信號強度進行定量研究，且此探針具有快速檢測刺突抗原和病毒的能力，可在不到10 min 的時間內(nèi)獲得結(jié)果，具有高度敏感性，對SARS-CoV-2 刺突重組抗原的檢測限低至130 fg/mL，對病毒的檢測限為8顆粒/mL。且作者證明了附著有刺突蛋白特異性適配體的金納米星可以通過阻斷宿主血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2受體和病毒的結(jié)合以及破壞病毒的脂質(zhì)膜來阻止病毒感染（圖3C）。各種蛋白質(zhì)之間的受體-配體相互作用對維持正常的生理代謝至關(guān)重要，發(fā)展原位觀察活細(xì)胞系統(tǒng)中受體-配體相互作用的策略有助于開發(fā)基于適體的診斷方法。基于NSET 過程開發(fā)光學(xué)納米尺也被用于測量活細(xì)胞膜表面受體蛋白水平上兩配體結(jié)合位點之間的分離距離。如譚蔚泓院士課題組［48］基于NSET過程開發(fā)了一種光學(xué)納米尺，用于測量活細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（CD71）上兩配體結(jié)合位點之間的分離距離。首先采用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（SELEX）策略獲得稱為XQ-2d 的ssDNA 適配體，此XQ-2d適配體能特異性結(jié)合在腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞（PL45）膜表面的CD71 上。使用XQ-2d 適配體修飾一系列不同直徑的金顆粒，使用熒光蛋白標(biāo)記抗體，分別作為能量轉(zhuǎn)移受體和供體構(gòu)建NSET 納米尺，來測量XQ-2d和抗CD71抗體在PL45細(xì)胞膜表面受體蛋白CD71上兩個不同結(jié)合位點之間的距離，基于“當(dāng)金顆粒的半徑在2~8 nm 范圍內(nèi)時，r0是常數(shù)”的前提，測得兩結(jié)合位點之間的距離約為15 nm（圖3D）。為分子醫(yī)學(xué)的研究提供了一種新的方向。同樣地，本課題組基于NSET 過程開發(fā)了一種具有單核堿基分辨率的納米尺，與譚蔚泓院士課題組設(shè)計的納米尺不同，本課題組利用熒光染料標(biāo)記的適體和單一尺寸的金納米顆粒-抗體復(fù)合物分別作為能量轉(zhuǎn)移供體和受體，在活細(xì)胞膜上推斷CD71蛋白亞基水平上兩個結(jié)合配體之間的分子距離［49］。本課題組建立的能量供體-受體體系，降低了材料合成的復(fù)雜程度，使用單一尺寸金納米顆粒提高了制備穩(wěn)定性和可重復(fù)性；相比于熒光蛋白標(biāo)記抗體，小分子熒光團標(biāo)記適體更簡便快速、成本低廉。另一方面，我們利用單一尺寸的金納米顆粒與熒光團作為能量轉(zhuǎn)移受體和供體構(gòu)建的NSET納米尺，具有確定的r0值。此外，通過在XQ-2d適配體末端修飾帶有不同堿基對數(shù)目的熒光團，可以精細(xì)調(diào)控?zé)晒鈭F與金顆粒表面距離，控制分子間距；該納米尺具有較高的精度，從分子距離的角度，將適體的每個堿基在生物系統(tǒng)的特定平面上進行原位投影，對于建立靈敏、可靠、便捷的基于適體的診斷方法具有重要意義（圖3E）。

圖3 基于NSET過程的傳感器用于篩查丙型肝炎病毒RNA［45］（A）；基于NSET過程的傳感平臺痕量檢測人尿液中惡性腫瘤標(biāo)志物精胺含量的示意圖［46］（B）；基于NSET過程的傳感平臺用于冠狀病毒超靈敏檢測與滅活的示意圖［47］（C）；基于NSET過程的光學(xué)納米尺用于測量活細(xì)胞膜表面CD71上兩個配體結(jié)合位點之間距離的示意圖［48］（D）；利用單核堿基分辨率的NSET納米尺原位測量活細(xì)胞膜上CD71蛋白亞基水平上兩個結(jié)合配體之間分子距離的示意圖［49］（E）Fig.3 Schematic diagram for screening hepatitis C virus RNA based on NSET process［45］（A）；schematic diagram for trace detection of spermine，a malignant tumor marker，in human urine based on NSET［46］（B）；schematic diagram for ultrasensitive detection and inactivation of Corona Virus of the sensing platform based on NSET［47］（C）；schematic diagram for measuring the separation distance between two ligand binding sites on CD71 on the surface of living cell membranes using the optical nanoruler based on NSET process［48］（D）；schematic illustration of in situ measurement of the molecular distance between two binding ligands at the CD71 protein subunit level on the living cell membrane using NSET nanoscale with single-nucleobase resolution［49］（E）

2.2 基于NSET的生物成像

基于NSET 能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)探針除了能通過檢測生物標(biāo)志物進行疾病診斷，還可通過生物成像技術(shù)進行腫瘤成像引導(dǎo)治療。如Li 等［50］開發(fā)了一種基于NSET 模型的納米探針，不僅能夠?qū)崟r和原位監(jiān)測癌細(xì)胞凋亡，而且能夠評估肽誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡程度和給藥治療效果，因此有望成為癌癥成像診斷和后期治療的靶向載體。在該傳感和成像系統(tǒng)中，作者首先合成功能肽包被的金納米團簇（AuNCs），隨后可通過NSET 過程使功能肽上修飾的熒光團處于熒光關(guān)閉狀態(tài)。此外，修飾在AuNCs 表面的肽保留了其固有的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，在進入癌細(xì)胞后可被凋亡蛋白（caspase 3）水解并產(chǎn)生顯著的熒光信號。通過監(jiān)測熒光信號的打開與關(guān)閉，分步實現(xiàn)了caspase 3 指示的細(xì)胞凋亡的實時成像和通過添加藥物前后熒光強度變化評估給藥治療效果的目標(biāo)（圖4A）。Sun 等［51］提出了一種可原位激活并包含阿霉素（Dox）的“納米簇炸彈（AuNCs/Dzs-Dox）”，由內(nèi)源性腫瘤細(xì)胞過表達的豆科蛋白引爆，利用NSET過程增強腫瘤成像和控制藥物釋放。利用功能肽作為生物配體，制備了具有靶向性、正電荷和豆科蛋白特異性以及TAMRA 環(huán)的AuNCs，此時TAMRA 作為能量供體將能量轉(zhuǎn)移給能量受體AuNCs，TAMRA 的熒光通過NSET 過程被形成的AuNCs 完全猝滅。同時AuNCs 可以保護脫氧核酶（DNAzyme）和Dox 組成的治療物質(zhì)（Dzs-Dox），聚集成更大的AuNCs/Dzs-Dox納米顆粒，這些納米顆粒通過整合素介導(dǎo)的內(nèi)吞作用選擇性地內(nèi)化到癌細(xì)胞中，然后在溶酶體中豆科蛋白的幫助下局部水解。隨后監(jiān)測到一種“炸彈樣”行為和“火花樣”熒光，這是由于TAMRA 和AuNCs 的NSET 過程減弱以及Dzs-Dox 的藥物釋放引起。結(jié)果表明，豆蔻素觸發(fā)的基于NSET 過程的AuNCs/Dzs-Dox 分解方式顯著提高了成像對比度。同時，體外細(xì)胞毒性實驗表明，基于AuNCs/Dzs-Dox 的引爆策略很容易實現(xiàn)有效的基因/化療聯(lián)合治療。此外，通過在體內(nèi)治療異種移植的MDA-MB-231 腫瘤模型，進一步證明了聯(lián)合治療的超強效果（圖4B）。這種治療性納米簇炸彈設(shè)計利用內(nèi)源性刺激反應(yīng)性，建立起多管齊下的成像和給藥治療聯(lián)用策略，為高對比度成像和按需給藥的精確癌癥治療提供了一種新的策略。

圖4 基于NSET模型的納米探針用于caspase 3指示的細(xì)胞凋亡實時成像示意圖［50］（A）；基于NSET效應(yīng)的納米簇炸彈系統(tǒng)（L-AuNCs/Dzs）合成示意圖以及用于對比度增強型癌癥成像和聯(lián)合治療的引爆策略［51］（B）；基于NSET過程的傳感器用于監(jiān)測阿霉素在活細(xì)胞內(nèi)釋放的示意圖［52］（C）；以CPT為基礎(chǔ)的聚合物前藥包覆AgNPs的NSET效應(yīng)示意圖［53］（D）Fig.4 Schematic illustration of real-time imaging for caspase 3 directed apoptosis of based on NSET model nanoprobes［50］（A）；schematic illustration of nanocluster-bomb system（L-AuNCs/Dzs） synthesis and the detonation strategy for contrast enhanced cancer imaging and combination therapy based on NSET［51］（B）；schematic illustration for monitoring adriamycin release in living cells based on NSET process sensor［52］（C）；schematic illustration of NSET effect of AgNPs coated by the CPTbased polymeric prodrug［53］（D）

基于NSET 的生物成像技術(shù)不僅能用于腫瘤成像引導(dǎo)治療，還可以利用熒光強度變化進行生物成像來檢測細(xì)胞內(nèi)藥物的釋放，評估治療效果。Wang 等［52］開發(fā)了一種藥物遞送系統(tǒng)，基于NSET 過程監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)藥物釋放。通過酸不穩(wěn)定的連接將Dox 與聚乙二醇間隔物拴在AuNPs 表面，此時，由于Dox與AuNPs 發(fā)生NSET，能量從能量供體Dox 轉(zhuǎn)移給能量受體AuNPs，使Dox 的熒光信號關(guān)閉；當(dāng)此偶聯(lián)物進入細(xì)胞并在酸性細(xì)胞器中響應(yīng)性地在細(xì)胞內(nèi)釋放Dox 后，熒光信號打開。通過監(jiān)測熒光信號，可以可視化Dox的細(xì)胞內(nèi)響應(yīng)釋放（圖4C）。Li等［53］通過將化療藥物喜樹堿（CPT）的光響應(yīng)性聚合物前藥系在銀納米顆粒（AgNPs）表面上，開發(fā)了一種混合藥物遞送系統(tǒng)。當(dāng)AgNPs被基于CPT的聚合物前藥包裹時，CPT 與AgNPs 之間的距離足夠近，基于NEST 過程，CPT 的能量轉(zhuǎn)移給AgNPs，使CPT 的熒光被AgNPs猝滅；當(dāng)混合納米顆粒釋放CPT分子后，CPT的熒光恢復(fù)。因此，可以通過觀察細(xì)胞內(nèi)CPT熒光強度的變化來追蹤細(xì)胞內(nèi)藥物釋放過程和藥物分布（圖4D）。熒光強度的變化與藥物釋放行為息息相關(guān)，使得基于NSET的藥物傳遞系統(tǒng)可以追蹤細(xì)胞內(nèi)藥物釋放過程，觀察釋放的藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布和治療效果。因此，基于NSET的生物傳感和生物成像在生物化學(xué)和分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

雖然基于NSET的光學(xué)探針和基于FRET的光學(xué)探針均在分子檢測和腫瘤治療等方面應(yīng)用廣泛，但由于NSET打破FRET作用距離的壁壘，基于NSET的光學(xué)探針在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用范圍更廣，比如在構(gòu)建光學(xué)納米尺方面具有FRET和PRET不具備的絕對優(yōu)勢，有助于開發(fā)全新的診斷方法。

現(xiàn)有基于NSET構(gòu)建的傳感器或診療技術(shù)，雖然其檢測量程突破了FRET 量程的壁壘。但仍然存在一些弊端，例如，熒光團的光漂白、自猝滅，金屬納米材料的細(xì)胞毒性，關(guān)鍵參數(shù)r0的不準(zhǔn)確。總而言之，基于NSET 能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)生物探針和生物成像技術(shù)在現(xiàn)代分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等方面具有重要應(yīng)用價值。

3 基于PRET的光學(xué)探針及其生物傳感和成像應(yīng)用

2007年，Liu等［54］在暗場顯微鏡下觀察到從單個AuNPs到吸附的細(xì)胞色素c引起的AuNPs散射光的猝滅，這是PRET過程的首次發(fā)現(xiàn)。在PRET模型中，能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在等離子體納米顆粒和有機染料之間［55］。與FRET 過程類似，PRET 同樣是基于等離子體納米顆粒供體和受體分子之間通過偶極子-偶極子相互作用的非輻射能量轉(zhuǎn)移過程。當(dāng)?shù)入x子體納米顆粒的局部表面等離子體共振帶的頻率與吸附在納米粒子上或距離納米粒子幾納米的分子的電子吸收帶頻率非常匹配時，就會產(chǎn)生瑞利散射信號的相應(yīng)變化［56］。其能量轉(zhuǎn)移效率在很大程度上取決于等離子體納米顆粒的散射光譜和受體分子的吸收光譜之間的重疊程度［23］，這與NSET 有明顯差異。然而，等離子體納米材料比熒光分子具有更好的光穩(wěn)定性和更大的光學(xué)橫截面［57］，使得PRET 模型具有更高的靈敏度、光譜分辨率以及優(yōu)異的選擇性，并逐漸在光學(xué)生物成像方面?zhèn)涫荜P(guān)注。

3.1 基于PRET的生物傳感

近年來，基于PRET 的生物傳感和生物成像技術(shù)已被作為一種非破壞性和無標(biāo)記的活細(xì)胞實時監(jiān)測方法［58］，不僅可用于蛋白酶活性研究，還可以定量檢測生物分子以觀察細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)代謝活動。如基于簡單的靜電吸附，Yan等［59］利用海膽狀的金納米等離子體（UGPs）和氧化態(tài)的3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯氨（oxTMB）建立了一種新的PRET 供受體對，用于酸性磷酸酶（ACP）的靈敏檢測。當(dāng)ACP 不存在時，由于oxTMB 的電子共振峰與UGPs 的等離激元共振峰重疊，能量從oxTMB 轉(zhuǎn)移到UGPs 上，使UGPs 的散射強度減弱即發(fā)生PRET 過程。當(dāng)ACP 存在時，ACP 催化2-磷酸-L-抗壞血酸三鈉鹽（AAP）分解產(chǎn)生的水解產(chǎn)物抗壞血酸水解物（AA）能有效地將oxTMB還原為TMB，從而阻斷PRET過程（圖5A）。

圖5 基于PRET納米傳感器用于酸性磷酸酶靈敏檢測的示意圖［59］（A）；基于PRET的等離子體納米探針GNPs@CD對活細(xì)胞中NO成像機制的示意圖［60］（B）；基于PRET的生物傳感器用于血漿中前列腺特異性抗原定量分析的原理圖［62］（C）Fig.5 Schematic illustration for sensitive detection of acid phosphatase based on PRET nanosensor［59］（A）；schematic illustration for the imaging mechanism of NO in living cells using the plasmonic nanoprobe GNPs@CD based on PRET［60］（B）；schematic diagram for the quantitative analysis of prostate-specific antigens in plasma using the PRET-based biosensor［62］（C）

3.2 基于PRET的生物成像

基于PRET 的生物成像技術(shù)在單個納米顆粒水平的精確跟蹤和敏感檢測方面提供了無與倫比的優(yōu)勢。Wang等［60］提出了一種基于PRET過程的傳感策略，用于活細(xì)胞中一氧化氮（NO）的超靈敏成像。將具有獨特剛性結(jié)構(gòu)和環(huán)形空腔的超分子環(huán)糊精（CD）分子連接在金納米顆粒（GNPs）上，并對其進行修飾，構(gòu)建了PRET納米傳感器。在沒有NO分子時，羅丹明B衍生物（RdMs）通過疏水相互作用進一步插入到CD 分子的空腔中，形成主客體結(jié)構(gòu)。在NO 分子存在的情況下，RdMs 與目標(biāo)物反應(yīng)并生成羅丹明（RdB）。由于GNPs和CD 分子偶聯(lián)物（GNPs@CD）和RdB 分子之間的光譜重疊，能量從RdB 分子轉(zhuǎn)移到GNPs@CD 上，PRET 發(fā)生導(dǎo)致GNPs@CD 的散射強度降低，此傳感平臺實現(xiàn)了活細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性NO分子的單粒子成像分析（圖5B）。同樣地，此課題組［61］利用基于PRET過程的主客體結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)對0.02 ~2.0 μmol/L線性范圍內(nèi)的膽固醇進行檢測，并達到6.7 nmol/L的檢測限，可直接用于檢測血清樣品中的膽固醇，具有高靈敏度和特異性。這種基于PRET 的策略為檢測膽固醇和其他疾病相關(guān)生物標(biāo)志物提供了一種有效的臨床潛在手段。Liu等［62］利用由AuNPs和QD作為供-受體對的PRET生物傳感器，前列腺特異性抗原（PSA）作為模型抗原評估基于PRET的均質(zhì)免疫分析法的性能。結(jié)果表明，這種基于PRET 的生物傳感器可對血漿中的前列腺特異性抗原進行定量分析，建立了一種無分離的均質(zhì)免疫測定方法，具有定量各種生物標(biāo)志物的潛能（圖5C）。本課題組利用PRET 過程設(shè)計了一種無連接子單分子偶極的PRET 納米尺模型，在活細(xì)胞受體蛋白分子水平上檢測了位點間分離距離和蛋白質(zhì)相互作用［63］。與傳統(tǒng)PRET 模型相比，本課題組的無連接模型以單一分子為受體，單一大小的GNPs 為供體，證明了以單分子偶極子為受體的無連接體PRET 模型的可行性，對于未來測量生命系統(tǒng)中的單分子事件具有重要意義。此外，與利用NSET模型檢測配體分離距離相比，本課題組構(gòu)建的基于PRET 的納米尺避免了染料光漂白的特性，以及不同尺寸的GNPs和染料種類之間不確定r0值，具有觀察單分子事件的獨特優(yōu)勢，可以作為納米尺度距離測量的替代工具。

然而，目前基于等離子體納米粒子的PRET 在大范圍光譜檢測方面受限，限制了對化學(xué)物質(zhì)的連續(xù)跟蹤或?qū)罴?xì)胞分泌分子的分析［64］。此外，由于單個等離子體納米粒子具有特定且狹窄的光譜寬度，因此只能檢測到吸收峰靠近納米粒子等離子體共振的分子，可能會破壞用于監(jiān)測各種類型分子的多路PRET 方法。基于此，Kim 等［65］提出了一個基于PRET 的超表面驅(qū)動的多路復(fù)用納米光譜平臺。利用間隙等離激元和光柵效應(yīng)，首次在整個可見光范圍內(nèi)設(shè)計了具有工程散射光譜的像素化的超表面，有效地擴大了PRET 檢測的光譜范圍。3種不同的生物分子（即葉綠素a、葉綠素b和細(xì)胞色素c）被應(yīng)用于超表面作為調(diào)色板，以獲得選擇性分子指紋成像。當(dāng)元像素散射峰與特定共軛生物分子的吸收頻率相匹配時，超表面與生物分子之間會發(fā)生強PRET，導(dǎo)致散射譜發(fā)生高效率猝滅，通過在整個細(xì)胞區(qū)域進行連續(xù)監(jiān)測來推進分子傳感。該平臺可以檢測分子之間的電子轉(zhuǎn)移和細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生（圖6）。這種超表面驅(qū)動的PRET高光譜成像，擴大了PRET檢測的光譜范圍，將為多路實時分子傳感和成像方法開辟了一條新的途徑，擴大了基于PRET的光學(xué)生物傳感和生物成像技術(shù)的應(yīng)用范圍。基于PRET的光學(xué)探針是通過等離子體納米粒子的瑞利散射光譜變化進行信息反饋，對比基于NSET和FRET構(gòu)建的光學(xué)探針通過熒光信號進行信息反饋，避免了熒光團的光漂白、自猝滅的影響，具有更高的精確度和穩(wěn)定性。

圖6 多路PRET分子成像元表面的示意圖［65］Fig.6 Schematic illustration of the metasurfaces for multiplexed PRET molecular imaging［65］

基于PRET 的光學(xué)探針在生物傳感和分子檢測方面具有更優(yōu)異的精確度，在單個納米顆粒水平的精確跟蹤和敏感檢測方面擁有比基于FRET、NSET 的光學(xué)探針望塵莫及的優(yōu)勢，這些優(yōu)點使其在疾病診斷方面具有極大潛力。但在腫瘤治療或藥物遞送應(yīng)用等方面具有極大挑戰(zhàn)性，由于基于PRET 的光學(xué)探針是通過瑞利散射光譜變化進行信號輸出，光譜信號采集受到生物體組織深度的限制。

現(xiàn)有基于PRET 構(gòu)建的傳感器或診療技術(shù)，具有更高的靈敏度、光譜分辨率以及良好的穩(wěn)定性。但仍然存在一些弊端，例如，等離子體納米材料的細(xì)胞毒性，PRET 供-受體對的可選擇性有限等。總之，基于PRET 能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)生物傳感和生物成像技術(shù)在現(xiàn)代分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等方面仍具有重要應(yīng)用價值，有望在基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷和治療等方面得到持續(xù)發(fā)展。

4 基于能量轉(zhuǎn)移的其它光學(xué)探針

除了上述列舉的基于FRET、NSET 和PRET 能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)探針，還有基于金屬增強熒光（MEF），也稱為表面增強熒光（SEF），以及等離子體增強熒光（PEF）等能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)探針，其中熒光團與金屬納米顆粒的近場相互作用可能在特定條件下產(chǎn)生較大的熒光增強。這種熒光信號的放大可以大大提高檢測靈敏度和增強對比度，從而提高基于熒光的傳感和成像技術(shù)的性能。MEF/SEF 和PEF 能量轉(zhuǎn)移在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究越來越廣泛，包括生物標(biāo)志物的檢測，如DNA［66］、RNA［67］和蛋白質(zhì)［68］監(jiān)測等，免疫測定［69］和腫瘤成像［70］等。但其熒光增強效應(yīng)受到供體-受體間分離距離的限制，精確的距離控制是誘發(fā)熒光增強效應(yīng)的關(guān)鍵。誘發(fā)MEF/SEF過程發(fā)生發(fā)展的最佳距離在7~8 nm左右［71］，其它距離下，熒光增強效應(yīng)會減弱或被其它效應(yīng)掩蓋。此外，如要實現(xiàn)實質(zhì)性的熒光增強效應(yīng)，除了精確的距離控制，通常還需要金、銀和銅等金屬作為有效襯底［68］，這些因素大大限制了基于MEF/SEF 和PEF 能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)生物傳感和生物成像技術(shù)在現(xiàn)代分子醫(yī)學(xué)早期診斷和治療等方面的應(yīng)用。

5 總結(jié)與展望

基于各種能量轉(zhuǎn)移的光響應(yīng)型生物傳感和光學(xué)成像技術(shù)已在疾病研究和臨床實踐中廣泛應(yīng)用并不斷發(fā)展。但是，考慮到生物相容性、細(xì)胞毒性以及潛在遺傳毒性等因素，目前大多數(shù)對疾病診斷與治療方面的研究仍處于實驗室層面，需要克服這些問題使研究落實在真實臨床診斷和治療中。因此，基于能量轉(zhuǎn)移的光響應(yīng)型生物傳感和光學(xué)成像技術(shù)在助力分子醫(yī)學(xué)的成像、示蹤和手術(shù)導(dǎo)航等方面任重道遠(yuǎn)，仍需要繼續(xù)推進、提升和發(fā)展。由于能量轉(zhuǎn)移的光響應(yīng)型生物探針的多優(yōu)點性和多功能性，這項技術(shù)將繼續(xù)推進臨床診斷和治療的簡單性、敏感性、特異性和多路復(fù)用性。我們相信基于能量轉(zhuǎn)移的光響應(yīng)型生物探針具有巨大潛力，將繼續(xù)為醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用提供源源不斷的動力。