生物光學(xué)成像技術(shù)在組織穿透性方面的研究進(jìn)展

張玉敏，王 富，林 俐，葉 堅(jiān)

（上海交通大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海 200030）

近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，光在生物組織中的傳播與分布，以及光與生物組織的相互作用引起了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注，引發(fā)了光學(xué)方法在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)與成像領(lǐng)域的研究熱潮。生物光學(xué)是利用光學(xué)探測(cè)手段對(duì)內(nèi)源性分子或外源性標(biāo)記物（如造影劑）、細(xì)胞或者組織甚至整個(gè)生物體進(jìn)行檢測(cè)與成像，以獲得其中生物學(xué)信息的方法。光學(xué)技術(shù)的發(fā)展幾乎貫穿整個(gè)人類的科學(xué)技術(shù)發(fā)展史，而光學(xué)技術(shù)與生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的交叉融合則可追溯至17 世紀(jì)：Robert Hooke 利用多片透鏡組合制作了復(fù)合式顯微鏡并首次觀察到了植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，Antoni van Leeuwenhoek 也通過(guò)類似于顯微鏡結(jié)構(gòu)的自制放大鏡首次觀察到了微生物。與此同時(shí)，光波動(dòng)說(shuō)的興起，推動(dòng)了基于衍射成像理論的顯微鏡的誕生。19 世紀(jì)，Carl Zeiss聯(lián)合Ernst Abbe和Otto Schott發(fā)明了首臺(tái)可達(dá)光學(xué)衍射極限的顯微鏡，大大地推動(dòng)了光學(xué)成像的發(fā)展。20 世紀(jì)，光電探測(cè)器的發(fā)展，世界上第一臺(tái)激光器的誕生，以及激光掃描共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡等相繼出現(xiàn)，都為光學(xué)成像在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用帶來(lái)了無(wú)限的可能性。

與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)成像方法相比，光學(xué)成像的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面［1］：（1）具有特異性，且在分子水平上具有很高的靈敏度和選擇性，能夠表征生物體的結(jié)構(gòu)或功能信息；（2）光學(xué)成像的對(duì)比度多樣，利用透射、反射、散射、吸收、熒光和光譜信息中的一種或幾種，可進(jìn)行多維/多模態(tài)成像；（3）具有較好的生物安全性，光學(xué)成像采用電磁波作為激發(fā)源，避免了電離輻射對(duì)人體的危害；（4）時(shí)空分辨率高，成像尺寸范圍從幾十納米到宏觀物體，成像速度快、可調(diào)；（5）成像范圍廣，體內(nèi)外的成像均可實(shí)現(xiàn)；（6）設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，成像成本低。迄今為止，光學(xué)成像已被廣泛用于臨床前和臨床診療的各個(gè)領(lǐng)域。例如在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域，熒光、生物/化學(xué)發(fā)光、拉曼等標(biāo)記技術(shù)配合各種成像技術(shù)能夠在細(xì)胞、組織以及器官甚至整個(gè)人體水平進(jìn)行腫瘤學(xué)和藥學(xué)等多方面的研究。臨床診療方面，基于外源性成像造影劑吲哚菁綠的熒光成像是淋巴結(jié)示蹤的絕佳工具［2］，內(nèi)窺鏡技術(shù)可以對(duì)人體的呼吸道、腸胃道、泌尿道和肝膽胰等進(jìn)行無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的檢查與治療［3］。牙科中用來(lái)檢測(cè)牙結(jié)石的紫外照明熒光成像，眼科常用的光學(xué)相干斷層成像和寬場(chǎng)眼底相機(jī)等都應(yīng)用了光學(xué)成像的原理。此外，光學(xué)方法在體外診斷方面的研究也已有報(bào)道，例如，利用熒光成像或拉曼成像進(jìn)行的試紙條側(cè)流免疫層析分析等［4］。

如上所述，光學(xué)成像獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有十分重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景［5-6］。然而，由于生物組織對(duì)光子存在高散射與高吸收等特性（圖1）［7］，光的組織穿透性通常非常有限，研究者們對(duì)此做了大量的努力。常見(jiàn)的光學(xué)成像方法包括激光散斑成像、光學(xué)相干斷層掃描、熒光成像、生物/化學(xué)發(fā)光成像、光聲成像以及拉曼成像等。本文將對(duì)上述常見(jiàn)的光學(xué)成像技術(shù)在組織穿透性方面的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)與討論，并展望它們?cè)诮M織穿透性方面未來(lái)研究的主要方向。激光散斑成像和光學(xué)相干斷層掃描等成像技術(shù)空間分辨率高（如微米級(jí)），通常用于數(shù)百微米到毫米深度水平的研究［8-9］，這里不再做詳細(xì)展開，下文主要對(duì)熒光成像、生物/化學(xué)發(fā)光成像、光聲成像以及拉曼成像幾種常見(jiàn)的光學(xué)探測(cè)技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)介紹。

圖1 激發(fā)光引起的光-組織相互作用［1］（A），不同生物組織和脂肪乳組織仿體的約化散射系數(shù)在400~1 700 nm區(qū)域隨波長(zhǎng)的變化［7］（B），人體血液中脫氧血紅蛋白（藍(lán)色）和氧合血紅蛋白（紅色）在1 mm長(zhǎng)路徑上的吸收光譜［7］（C），水通過(guò)1 mm長(zhǎng)路徑的吸收光譜［7］（D）Fig.1 Light-tissue interactions resulting from impinging excitation light［1］（A），reduced scattering coefficients of different biotissues and of intralipid tissue phantom as a function of wavelength in the 400-1 700 nm region［7］（B），absorption spectra of deoxyhaemoglobin（blue） and oxyhaemoglobin（red） through a 1-mm-long path in human blood［7］（C），absorption spectrum of water through a 1-mm-long path［7］（D）

1 熒光成像

熒光現(xiàn)象在19 世紀(jì)中期被發(fā)現(xiàn)，并在20 世紀(jì)初第一臺(tái)熒光顯微鏡問(wèn)世后在生命科學(xué)領(lǐng)域嶄露頭角［10］。熒光成像的醫(yī)學(xué)應(yīng)用可以追溯到1924年，當(dāng)時(shí)在紫外線照射下觀察到了腫瘤中內(nèi)源性分子卟啉的熒光信號(hào)［8，11］。熒光成像以熒光報(bào)告分子為標(biāo)志，所用到的熒光材料包括無(wú)機(jī)材料，如上轉(zhuǎn)換材料、量子點(diǎn)，熒光蛋白以及其他有機(jī)材料等［12-14］。熒光成像技術(shù)的出現(xiàn)極大推動(dòng)了微觀、介觀和宏觀成像系統(tǒng)，以及成像探針、微型化光纖方法等的發(fā)展，現(xiàn)已成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最快以及適應(yīng)能力最強(qiáng)的成像技術(shù)之一。

1.1 熒光顯微技術(shù)

熒光顯微技術(shù)是較早發(fā)展起來(lái)的熒光成像技術(shù)。激光經(jīng)過(guò)物鏡照射在樣品上并激發(fā)出熒光，被激發(fā)出的熒光經(jīng)過(guò)同一物鏡后被檢測(cè)器收集（圖2A）。常見(jiàn)的熒光顯微成像技術(shù)有激光掃描共聚焦顯微成像、多光子（包括雙光子和三光子）顯微成像等。激光掃描共聚焦顯微成像成本低、應(yīng)用廣泛，可以實(shí)現(xiàn)樣品斷層掃描成像與無(wú)損觀察，并可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三維空間結(jié)構(gòu)分析等。但可見(jiàn)光的組織穿透深度有限，且如果長(zhǎng)時(shí)間觀察，光毒性易導(dǎo)致細(xì)胞死亡。近年來(lái)，基于近紅外光的雙光子顯微技術(shù)引起了學(xué)術(shù)與工業(yè)界的廣泛關(guān)注。雙光子吸收是指同時(shí)吸收兩個(gè)光子，是一種典型的非線性吸收過(guò)程［1］。雙光子吸收的光學(xué)躍遷與吸收光強(qiáng)的平方有關(guān)。雙光子顯微技術(shù)常用飛秒激光作為激勵(lì)。飛秒激光脈沖超短，可以提供較高的峰值功率和較低的平均功率。三光子吸收則是指同時(shí)吸收三個(gè)光子。與雙光子顯微鏡相比，三光子顯微鏡可以獲得更大的成像深度，但其對(duì)激光源和探測(cè)器的要求遠(yuǎn)高于雙光子顯微鏡。目前多光子顯微成像已可獲得2 100 μm 以上深度的清晰血管二維圖像（圖2B），且其失焦光漂白小，從標(biāo)記熒光物體（通過(guò)多個(gè)通道檢測(cè)）和二次諧波信號(hào)發(fā)出的光產(chǎn)生三維信息，可以在高空間分辨率下提供數(shù)小時(shí)的成像時(shí)長(zhǎng)［15］。多光子顯微鏡有許多固有優(yōu)點(diǎn)，包括提高穿透深度（近紅外光激發(fā)減少了生物組織中的散射和吸收）和減少光損傷。然而，受超快和高功率的激光器限制，多光子顯微鏡的成本較高，此外因?yàn)槭褂昧烁L(zhǎng)波長(zhǎng)，其分辨率理論上會(huì)下降。基于光纖的成像技術(shù)已被應(yīng)用于活體顯微鏡，可實(shí)現(xiàn)原位成像，而小型化系統(tǒng)則使其在基于內(nèi)窺鏡的臨床成像中具有重大優(yōu)勢(shì)［16］。熒光顯微成像技術(shù)與激光散斑成像和光學(xué)相干斷層掃描等成像技術(shù)類似，具有較高的空間分辨率（例如微米級(jí)），它們?cè)跀?shù)百微米到毫米水平的深度領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，例如可對(duì)細(xì)胞、組織切片和表層皮膚組織等進(jìn)行超高分辨率的分析，但不適用于表面腫瘤（如異種移植）、手術(shù)暴露器官以及整個(gè)人體等的檢測(cè)。

圖2 熒光顯微技術(shù)示意圖［1］（A），成年小鼠體內(nèi)血管的深部腦結(jié)構(gòu)多光子顯微鏡成像［15］（B），在體寬場(chǎng)熒光成像示意圖（i）和吲哚菁綠（ICG）的光致發(fā)光光譜及靜脈注射ICG后的裸鼠熒光圖像（ii）［1，17］（C），F(xiàn)MT幾何結(jié)構(gòu)示意圖（左），F(xiàn)MT成像系統(tǒng)（中）和在不同組織外圍獲得的理論平均熒光光子數(shù)與組織直徑的關(guān)系曲線（右）［18-19］（D）Fig.2 Schematic diagram of fluorescence microscopy［1］（A），in vivo deep-brain structural multiphoton microscopy images of blood vessels in adult mouse［15］（B），schematic illustration of the in vivo wide-field fluorescence imaging（i） and the photoluminescence spectra of ICG and fluorescence image of nude mice after intravenous injection of ICG（ii） ［1，17］（C），schematic diagram of FMT geometry（left），F(xiàn)MT imaging system（middle） and theoretical average fluorescent photon counts expected at the peripheries of different organs as a function of diameter（right）［31-32］（D）inset B：left：3D reconstruction of multiphoton microscope images of a mouse brain in vivo；right：2D image showing a blood vessel at depth of 2 100 μm（左側(cè)：在體小鼠大腦多光子顯微鏡圖像的3D重建，右側(cè)：2D圖像顯示深度為2 100 μm的血管）

1.2 在體寬場(chǎng)熒光成像技術(shù)

為獲得更高深度的檢測(cè)與成像能力，研究者們以犧牲部分橫向分辨率為前提發(fā)展成像技術(shù)，并配合使用高靈敏度的外源性造影劑，將熒光成像技術(shù)的深層檢測(cè)能力提高至數(shù)毫米及以上水平。例如在面向在體的寬場(chǎng)熒光成像技術(shù)（圖2C）中，組織樣本（如動(dòng)物或人體）通常是被寬入射光束照射（該入射光束被調(diào)至感興趣的波段），同時(shí)利用低噪聲電荷耦合裝置在發(fā)射波長(zhǎng)處拍攝高靈敏度圖像，搭配合適的濾光片和大孔徑透鏡，可提高光子收集效率［1，17］。這是目前最常見(jiàn)的大范圍熒光成像方法，當(dāng)在同一側(cè)激發(fā)并收集熒光信號(hào)時(shí)稱為熒光反射成像（FRI），而透射式的熒光成像技術(shù)則從照明源的對(duì)側(cè)收集圖像。熒光成像使用光譜信息來(lái)區(qū)分不同的熒光顏料。例如，Yang等［18］證明，通過(guò)監(jiān)測(cè)綠色熒光蛋白的熒光信號(hào)，可以對(duì)生長(zhǎng)中的腫瘤進(jìn)行簡(jiǎn)單和無(wú)創(chuàng)的成像，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)腫瘤在活鼠體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。熒光成像的對(duì)比度常受生物組織自體熒光的影響，Xu等［19］使用光譜解混技術(shù)提高檢測(cè)對(duì)比度，該技術(shù)是一種可以根據(jù)光譜特征將多種熒光染料與非特異性背景熒光區(qū)分開的技術(shù)。寬場(chǎng)熒光成像尤其是熒光反射成像在技術(shù)上易于實(shí)現(xiàn)，操作簡(jiǎn)單，為進(jìn)行高通量與快速的生物成像提供了強(qiáng)有力的工具。目前，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)可以用于手術(shù)治療卵巢癌［20］、前列腺癌［21］、乳腺癌［22］、黑色素瘤［23-24］、外陰癌［25-26］和宮頸癌［27］等疾病。寬場(chǎng)成像擴(kuò)大了入射光斑尺寸，降低了入射激光功率密度（遠(yuǎn)低于美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)規(guī)定的最大激光照射量（MPE）閾值，低于該閾值的輻射量對(duì)被照射的表面組織產(chǎn)生的損傷可忽略不計(jì)），并可得到清晰與高對(duì)比度圖像，是在體檢測(cè)熒光報(bào)告分子最簡(jiǎn)單的成像技術(shù)，廣泛地影響了生物醫(yī)學(xué)研究［28］。由于主要集中于對(duì)淺層結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，目前基于單角度投影的寬場(chǎng)熒光成像所能獲取的深度信息通常在毫米到厘米范圍［29］。

1.3 熒光斷層掃描技術(shù)

熒光斷層掃描（FMT）基于多個(gè)光源-探測(cè)器對(duì)或多角度投影的方式進(jìn)行檢測(cè)（圖2D），這種方式大大提升了熒光探測(cè)技術(shù)的探測(cè)深度。研究者們根據(jù)理論模擬的數(shù)據(jù)，認(rèn)為FMT 可以將熒光源的信號(hào)檢測(cè)深度提升至數(shù)個(gè)厘米水平，例如在純肌肉組織中可提高至7 cm，半透明的乳房組織中則可提高至將近14 cm［30-31］。此外，F(xiàn)MT還可提供定量信息，通過(guò)對(duì)收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行重建，獲得熒光信號(hào)源的三維空間分布信息［30，32］。FMT 由擴(kuò)散光學(xué)層析成像（DOT）發(fā)展而來(lái)，兩者均以光子在介質(zhì)中的擴(kuò)散原理為基礎(chǔ)［33］。不同的是，DOT是利用吸收效應(yīng)來(lái)對(duì)組織固有的吸收物質(zhì)（通常為血紅蛋白和脫氧血紅蛋白有關(guān)的內(nèi)在結(jié)構(gòu)）進(jìn)行重建，而FMT 則是利用吸收和熒光測(cè)量對(duì)熒光染料進(jìn)行重建。FMT 通過(guò)采用光纖光源或順序掃描點(diǎn)光源代替寬場(chǎng)成像模式下的廣域照明，以延長(zhǎng)測(cè)量時(shí)間為代價(jià)來(lái)對(duì)每一個(gè)單獨(dú)的光源探測(cè)器進(jìn)行測(cè)量［34］。2001年，Ntziachristos等首次開發(fā)了用于科研實(shí)驗(yàn)的FMT系統(tǒng)，在渾濁介質(zhì)中重建了熒光團(tuán)的空間分布，整個(gè)過(guò)程可控制在10 min 左右，并將其用于小鼠腦瘤、纖維肉瘤等的檢測(cè)研究［33，35］。早期的FMT 系統(tǒng)采用將小鼠浸泡在指數(shù)匹配的液體中的方式，以簡(jiǎn)化與邊界建模相關(guān)的理論約束來(lái)計(jì)算光傳播。通過(guò)不斷改進(jìn)，在非接觸情況下，F(xiàn)MT 系統(tǒng)已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)多種形狀物體的重建，并可進(jìn)行360°旋轉(zhuǎn)檢測(cè)，提高了重建分辨率［36-37］。FMT 的靈敏度高，適用范圍廣，但空間分辨率相對(duì)較低（~1 mm）［8］。分辨率受限于光在組織中傳播的物理性質(zhì)、樣品的解剖特征和組織光學(xué)參數(shù)的不確定性等。因此，F(xiàn)MT多與計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）/磁共振成像（MRI）等結(jié)合，利用后者提供結(jié)構(gòu)先驗(yàn)信息構(gòu)建正演模型，以此改進(jìn)光子的重建和視圖的可視化［34，38］。此外，由于近紅外二區(qū)窗口的低散射特性，也有研究者將FMT的探測(cè)窗口從近紅外一區(qū)拓展到近紅外二區(qū)，以此來(lái)降低散射效應(yīng)對(duì)FMT信息獲取的影響［39］。FMT 高的組織檢測(cè)能力與優(yōu)異的信息獲取能力使其在使用人類疾病動(dòng)物模型研究新的診療方法中展現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力。

2 生物/化學(xué)發(fā)光成像

生物/化學(xué)發(fā)光成像無(wú)需外部光源照明即可直接收集物體內(nèi)部產(chǎn)生的光信號(hào)，避免了組織中固有熒光背景的影響，成像對(duì)比度高，同時(shí)具有更大的組織穿透潛力（相對(duì)于熒光成像而言）。

2.1 化學(xué)發(fā)光

化學(xué)發(fā)光是指某些物質(zhì)在參加化學(xué)反應(yīng)的過(guò)程中由于吸收了反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能而被激發(fā)，并向外輻射光能量的過(guò)程。化學(xué)發(fā)光的靈敏度高，據(jù)報(bào)道，化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能的效率幾乎可達(dá)100%。目前化學(xué)發(fā)光成像的探測(cè)深度通常可達(dá)厘米水平。2020年，唐本忠團(tuán)隊(duì)與羅亮團(tuán)隊(duì)合作開發(fā)了一種化學(xué)共軛的近紅外化學(xué)發(fā)光材料［40］。他們通過(guò)將魯米諾（Luminol）與三苯胺-苯并噻二唑結(jié)合物（Triphenylaminecombined benzothiadiazole，TB）偶聯(lián)，合成了具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光活性的近紅外化學(xué)發(fā)光發(fā)射體TBL（Triphenylamine-combined benzothiadiazole conjugates with luminol，TBL）分子，并利用表面活性劑制備了直徑約為20 nm 的TBL 納米顆粒。該TBL 納米顆粒的近紅外化學(xué)發(fā)光可以最高穿透3 cm 厚的火腿組織并被檢測(cè)器檢測(cè)到（圖3），并且能夠區(qū)分腫瘤組織和正常組織，在深部生物組織成像、原位癌癥診斷和手術(shù)治療領(lǐng)域都表現(xiàn)出良好的潛在應(yīng)用前景。

圖3 不同豬火腿肉片覆蓋下的TBL（三苯胺和苯并噻二唑的結(jié)合物偶聯(lián)魯米諾）顆粒近紅外化學(xué)發(fā)光圖像（序號(hào)代表覆蓋的肉片數(shù)量）（A），豬火腿肉片的照片（10片肉片的總厚度為3 cm，每片肉片的厚度~3 mm）［40］（B）Fig.3 Near-infrared chemiluminescence images of TBL（triphenylamine-combined benzothiadiazole conjugates with luminol）dots covered by different slices of pork ham（the serial number represents the number of slices of pork ham covered）（A），photograph of pork ham（the total thickness of 10 slices is 3 cm and the thickness of each slice is ~3 mm）［40］（B）

2.2 生物發(fā)光

生物發(fā)光是一種特殊類型的化學(xué)發(fā)光，是指生物體發(fā)出的光輻射，其發(fā)光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量呈線性相關(guān)性。生物發(fā)光成像是利用熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，然后將標(biāo)記好的細(xì)胞接種到動(dòng)物體內(nèi)，再外源性給予熒光素，在三磷酸腺苷、氧氣存在的條件下，熒光素酶和熒光素反應(yīng)，生成氧化熒光素并發(fā)光，最后利用光學(xué)檢測(cè)器直接監(jiān)測(cè)活體中細(xì)胞活動(dòng)和基因行為的成像技術(shù)。通過(guò)該技術(shù)，可以觀測(cè)活體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移、疾病的發(fā)展以及特定基因表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程。生物發(fā)光成像的探測(cè)深度通常也可達(dá)厘米水平，例如將生物發(fā)光染料的發(fā)射波長(zhǎng)擴(kuò)展至近紅外區(qū)域可以對(duì)活體小鼠的整個(gè)身體（>1 cm）進(jìn)行探測(cè)［8，41］。生物發(fā)光成像目前已被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、基因表達(dá)模式和基因功能、傳染病與干細(xì)胞免疫學(xué)以及細(xì)胞凋亡等研究［42-45］。與熒光斷層掃描類似，生物發(fā)光也可以實(shí)現(xiàn)斷層掃描獲得三維信號(hào)源分布信息，并得到量化信息［46-47］。然而，外部光源的缺乏使生物發(fā)光層析成像（BLT）復(fù)雜化，導(dǎo)致其數(shù)學(xué)上的建模和解析更加困難，而且準(zhǔn)確性可能降低。結(jié)合多視角成像和組織異質(zhì)性的先驗(yàn)信息可以提高生物發(fā)光逆問(wèn)題求解的能力。2006年，有研究建立了一個(gè)獨(dú)立的BLT/CT雙模式成像系統(tǒng)，先對(duì)小鼠進(jìn)行BLT數(shù)據(jù)采集，然后確保小鼠不動(dòng)再采集CT 數(shù)據(jù)，最后利用從CT 中獲取的解剖信息對(duì)小鼠進(jìn)行BLT 重建，提高了BLT 成像的準(zhǔn)確性［48］。生物發(fā)光層析成像在體內(nèi)的應(yīng)用正在研究階段，未來(lái)有望得到應(yīng)用。

化學(xué)/生物發(fā)光成像無(wú)需外部光源照明，避免了背景組織信號(hào)對(duì)檢測(cè)信號(hào)的影響，在深層成像領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。然而其適用范圍受到一些限制，例如有些物質(zhì)無(wú)法進(jìn)行生物發(fā)光標(biāo)記，如抗體、多肽等。

3 光聲成像

光聲成像（PAI）是一種融合了光學(xué)照明和超聲檢測(cè)的成像模式，同時(shí)具備光學(xué)與超聲檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，近幾十年在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域獲得了飛速發(fā)展［49］。如圖4A所示，光聲成像技術(shù)通常使用短脈沖光源作為入射能量，內(nèi)源性色素團(tuán)（如氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白）或外源性造影劑（如有機(jī)染料和納米顆粒）吸收入射光源并將光能轉(zhuǎn)化為熱能使溫度上升，發(fā)生熱彈性膨脹及發(fā)射出超聲波并被超聲檢測(cè)器收集。由于聲信號(hào)在組織中的散射和衰減通常比光信號(hào)少得多，因此基于光聲的成像模式具有以更大的組織穿透性確定組織中光學(xué)吸收物質(zhì)信息的潛力［50］。光聲成像可以在光學(xué)和聲學(xué)兩個(gè)維度上縮放其空間分辨率和成像深度，基于光學(xué)分辨的光聲顯微鏡（OR-PAM）具有較高的側(cè)向分辨率，但其成像深度通常限制在1 mm左右［51］。而當(dāng)空間分辨率由聲學(xué)定義時(shí)，雖然高的中心頻率換能器可以提供高的空間分辨率，但頻率相關(guān)的聲學(xué)衰減也會(huì)限制成像深度。因此，基于聲學(xué)分辨的光聲顯微鏡（AR-PAM）系統(tǒng)的成像深度通常為幾毫米［52］。低頻的傳感器通常用于光聲斷層掃描（PAT），并已被證明可深入5.2 cm的離體雞肉組織檢測(cè)目標(biāo)物的光聲信號(hào)（圖4B），而對(duì)應(yīng)的入射激光輻射量?jī)H為美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)規(guī)定的皮膚最高激光照射閾值的七分之一，遠(yuǎn)低于FMT 所需的輻射劑量［28，53-54］。且如果采用新的照明方案，例如通過(guò)從兩側(cè)照亮物體，可使成像區(qū)域翻倍，實(shí)現(xiàn)更高的成像深度［55］。將激發(fā)波長(zhǎng)拓展到近紅外二區(qū)也可以提高成像深度，例如有報(bào)道利用基于磷酞菁的有機(jī)探針在1 064 nm 下進(jìn)行光聲斷層掃描成像，在雞胸組織中達(dá)到了11.6 cm 的成像深度［56］。隨著光聲斷層掃描技術(shù)的發(fā)展，光聲成像在基礎(chǔ)科學(xué)、臨床前研究和臨床轉(zhuǎn)換等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，聲學(xué)帶來(lái)高穿透性的同時(shí)，也帶來(lái)了其固有的局限，例如骨頭和氣腔會(huì)阻礙超聲傳播，對(duì)腫瘤的探測(cè)靈敏度低等，限制了其在相關(guān)疾病診斷中的適用性。

圖4 光聲成像（PAI）的原理圖［50］（A），深入穿透生物組織的PAI［54］（B）Fig.4 Principle of photoacoustic imaging（PAI） ［50］（A），deeply penetrating PAI in biological tissues［54］（B）photographs of the cross-section of chicken breast tissue in which a transparent tube containing methylene blue is embedded（i） and the entire sample（ii），PAI of the tube containing methylene blue（iii），overlaid PAI（pseudo color） and US（gray） image（iv）；the thresholded photoacoustic signals in the yellow dotted box in（iii） were overlaid with the US image in（iv）（嵌入含有亞甲基藍(lán)的透明管的雞胸組織橫截面（i）和整個(gè)樣品的照片（ii），含有亞甲基藍(lán)管的PAI（iii），PAI（偽彩色）和US（灰色）重疊圖像（iv）；（iii）中黃色虛線框內(nèi)的閾值光聲信號(hào)與（iv）中的超聲圖像疊加）

4 拉曼成像

拉曼散射（Raman scattering），又稱拉曼效應(yīng)，是指入射光波被物質(zhì)散射后頻率發(fā)生改變的現(xiàn)象，可以用分子的振動(dòng)能級(jí)進(jìn)行解釋。若出射光與入射光頻率一致，則稱為瑞利散射，兩種散射的分子振動(dòng)能級(jí)圖如圖5A所示［57］。當(dāng)有入射光照射到樣品時(shí)，該樣品的分子產(chǎn)生的振蕩極化導(dǎo)致電子躍遷到受激虛態(tài)，處在虛擬能級(jí)上的電子會(huì)向低能級(jí)躍遷并向外輻射光子即散射光。當(dāng)入射光能大于散射光能時(shí)，稱為斯托克斯（Stokes）散射；入射光能小于散射光能時(shí)，則稱為反斯托克斯（anti-Stokes）散射，Stokes和anti-Stokes散射統(tǒng)稱為拉曼散射［58-62］。Stokes散射通常比anti-Stokes散射強(qiáng)很多，因此，拉曼光譜儀檢測(cè)的通常為Stokes 線。入射和散射光子的能量差與入射光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，只與材料不同振動(dòng)能級(jí)的能級(jí)差有關(guān)。

圖5 拉曼散射與瑞利散射分子振動(dòng)能級(jí)圖［57］（A），表面增強(qiáng)拉曼散射現(xiàn)象［65］（B），局域表面等離激元共振效應(yīng)示意圖［67］（C），傳統(tǒng)的背散射拉曼檢測(cè)示意圖：激光激發(fā)和拉曼光子收集發(fā)生在同一點(diǎn)［74］（D）Fig.5 Diagram of Raman scattering and Rayleigh scattering molecular vibrational energy levels［57］（A），surface-enhanced Raman scattering phenomenon［65］（B），schematic diagram of localized surface plasmon resonance effect［67］（C），schematic of conventional backscattering Raman geometry：laser excitation and Raman photon collection take place at the same point［74］（D）

拉曼成像是指利用拉曼散射現(xiàn)象進(jìn)行成像的手段，一般包括逐點(diǎn)掃描拉曼成像和寬場(chǎng)拉曼成像［63］。逐點(diǎn)掃描拉曼成像是最常見(jiàn)的一種拉曼成像方式，指在樣品的感興趣區(qū)域逐點(diǎn)激發(fā)并采集拉曼信號(hào)生成的圖像［64］。寬場(chǎng)拉曼成像則是將寬光束激光照射到樣品上感興趣的區(qū)域，散射光從整個(gè)區(qū)域被同時(shí)采集并被過(guò)濾，只有選定的較窄波段范圍內(nèi)的拉曼散射光子被收集［63］。

4.1 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜具有分子指紋特征，可以與背景很好地區(qū)分開；拉曼峰寬極窄，非常適合進(jìn)行多重檢測(cè)或成像；且拉曼信號(hào)穩(wěn)定性較高，不易發(fā)生猝滅或漂白。特別地，當(dāng)分子靠近或吸附在金屬納米結(jié)構(gòu)表面時(shí)，在入射光的激發(fā)下，分子的拉曼信號(hào)可被極大地增強(qiáng)，增強(qiáng)因子高達(dá)1014~1015，該現(xiàn)象稱為表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）效應(yīng)（圖5B）［65-66］。SERS 效應(yīng)自1974 年被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已被廣泛研究，其增強(qiáng)機(jī)制主要有兩種：電磁場(chǎng)（EM）增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)效應(yīng)。EM 增強(qiáng)由金屬納米結(jié)構(gòu)的局域表面等離激元共振（LSPR）效應(yīng)引起，占主導(dǎo)地位。當(dāng)照射到納米金屬結(jié)構(gòu)與介質(zhì)界面的入射光頻率與金屬中的自由電子振蕩頻率一致時(shí)，金屬表面的自由電子會(huì)產(chǎn)生集體振蕩，這一現(xiàn)象被稱為L(zhǎng)SPR 效應(yīng)（圖5C）［67］。LSPR 會(huì)導(dǎo)致金屬納米結(jié)構(gòu)上局域電場(chǎng)的再分配，使在金屬納米結(jié)構(gòu)表面附近形成一個(gè)電磁場(chǎng)增強(qiáng)區(qū)域，該區(qū)域通常被稱為“熱點(diǎn)”。吸附在“熱點(diǎn)”附近的分子除可以獲得極強(qiáng)的入射激光激發(fā)外，其拉曼散射過(guò)程也可以以同樣的方式被增強(qiáng)。

基于SERS 效應(yīng)制備的納米探針?lè)Q為SERS 探針，主要由金屬納米基底和拉曼報(bào)告分子兩部分組成，有些SERS 探針還包括保護(hù)層和靶向分子［68］。與熒光染料和量子點(diǎn)等類似，SERS 探針也具有光學(xué)標(biāo)記功能，是一種新型的成像造影劑［69-70］。近年來(lái)，SERS探針由于特異性強(qiáng)、靈敏度高、不易受光漂白、不受組織背景熒光干擾等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多重檢測(cè)或成像，已成為最具發(fā)展前景的光學(xué)探針之一。目前SERS探針在小鼠腦膠質(zhì)瘤、前哨淋巴結(jié)和前列腺癌等模型中均成功實(shí)現(xiàn)了腫瘤邊緣浸潤(rùn)和多灶性局部腫瘤擴(kuò)散的精確成像［71-73］。常規(guī)的拉曼檢測(cè)方式是背散射式檢測(cè)（圖5D）［74］，然而由于生物組織對(duì)光子的散射和吸收較強(qiáng)，背散射拉曼檢測(cè)受到組織穿透深度的限制，一般約為幾個(gè)毫米［75］。

4.2 深穿透拉曼光譜技術(shù)

深穿透拉曼光譜（DRS）技術(shù)的出現(xiàn)極大地提高了拉曼光譜的深層檢測(cè)與成像能力［74，76-77］。DRS 檢測(cè)基于生物組織的高散射特性，即來(lái)自深層的光子到達(dá)組織表面時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大的空間偏移。因此DRS技術(shù)在空間上對(duì)激光入射區(qū)域與信號(hào)收集區(qū)域進(jìn)行分離，有效抑制了淺層的背景信號(hào)，并可獲取更多來(lái)自深層的拉曼光子，從而提高來(lái)自深層目標(biāo)物（即信號(hào)源）的信背比，實(shí)現(xiàn)更大的檢測(cè)深度。深穿透拉曼光譜技術(shù)通常包括兩種形式：空間偏移拉曼光譜（SORS）和透射拉曼光譜（TRS）。

SORS 由Matousek 等在2005 年提出［78］，他們通過(guò)在激發(fā)區(qū)域和收集區(qū)域之間實(shí)現(xiàn)一定的背向散射物理偏移，獲取了更高信背比的深層信號(hào)源的信號(hào)，并將利用該檢測(cè)方式獲得的光譜稱為空間偏移拉曼光譜（圖6A）［78-79］。SORS與SERS的結(jié)合，稱為表面增強(qiáng)空間偏移拉曼光譜（SESORS），該技術(shù)兼具了SERS 的信號(hào)增強(qiáng)能力與SORS 的深穿透優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)更深層的樣品檢測(cè)。空間偏移量?jī)H為微米到毫米水平時(shí)，即可在深達(dá)0.5~0.675 cm 的離體豬肌肉組織和0.8 cm 的骨中檢測(cè)到SERS探針的信號(hào)［80-82］。此外，Nicolson 等［83］將靈敏度更高的表面增強(qiáng)共振拉曼散射（SERRS）探針與空間偏移拉曼光譜相結(jié)合，成功通過(guò)2.5 cm 厚的離體豬肌肉組織檢測(cè)到該納米探針的信號(hào)，并實(shí)現(xiàn)了離體豬肌肉組織1.5 cm深處三維乳腺癌腫瘤模型的檢測(cè)。Berry 等［84］則利用SORS 技術(shù)成功檢測(cè)到埋在4.8 cm 豬肌肉深處的SERS探針的信號(hào)，是目前報(bào)道的利用SORS技術(shù)實(shí)現(xiàn)的最大離體組織檢測(cè)深度（圖6B）。最近，Nicolson等［85］繼續(xù)成功在活體小鼠中通過(guò)顱骨檢測(cè)出膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多形性腫瘤（圖6C）。雖然此項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)了在體小鼠腫瘤的共振SESORS成像，但探測(cè)深度僅限于穿過(guò)小鼠顱骨的厚度（~0.2 cm）。

圖6 SORS原理圖和利用514 nm波長(zhǎng)測(cè)量由1 mm 聚甲基丙烯酸甲酯球?qū)雍? mm反式二苯乙烯粉末層組成的雙層系統(tǒng)收集的拉曼光譜［78-79］（A），使用手持式SORS光譜儀通過(guò)60 mm豬組織追蹤1，2-二（4-吡啶基）乙烯（BPE）納米探針［84］（B），整合素靶向SERRS納米探針的示意圖、用于多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的體內(nèi)成像以及使用SORS成像方法通過(guò)顱骨檢測(cè)到的SERRS探針/骨的約束最小二乘貢獻(xiàn)結(jié)果［85］（C）Fig.6 Principle of SORS and Raman spectra collected from a two-layer system consisting of a 1 mm layer of poly（methyl methacrylate）（PMMA）spheres followed by a 2 mm layer of trans-stilbene powder measured using the 514 nm probe wavelength［78-79］（A）（ΔS：spatial offset），the tracking of BPE nanotags through porcine tissue up to 60 mm using a handheld SORS spectrometer［84］（B），concept of integrin-targeted SERRS-nanotags for in vivo imaging of glioblastoma multiforme using SORS and the detection and constraint least squares contribution of SERRS NPs/bone through the skull using a SORS imaging approach［85］（C）

TRS 是DRS 的另一種形式［86］。TRS 通過(guò)將激光入射區(qū)域和拉曼探測(cè)區(qū)域分離在樣品的對(duì)側(cè)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)（圖7A）［87］，可被認(rèn)為是SORS 的一種特殊形式，即其激光照明區(qū)域和信號(hào)收集區(qū)域的空間偏移量達(dá)到了無(wú)限大，因此TRS 與SORS 一樣，均具有深層檢測(cè)能力［88-89］。但與SORS 不同的是，TRS 模型反映的是檢測(cè)體積內(nèi)整體信息的組成，因此不受檢測(cè)系統(tǒng)的影響或不同空間偏移量采樣問(wèn)題的限制，這使其在非侵入性檢測(cè)樣品內(nèi)部信息領(lǐng)域（如藥物樣品的主成分含量等）具有廣闊的應(yīng)用前景。例如Aina等［90］使用TRS 對(duì)待測(cè)藥物模型配方中的多晶成分含量進(jìn)行定量研究，結(jié)果表明，使用TRS 對(duì)多晶型進(jìn)行量化的準(zhǔn)確性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)基于SORS 的準(zhǔn)確性。此外，該技術(shù)還有效抑制了從涂層或膠囊層發(fā)出的熒光和拉曼信號(hào)。

圖7 透射拉曼光譜示意圖［87］（A），透射拉曼測(cè)量示意圖（左）及不同厚度豬肉組織覆蓋下測(cè)得的透射拉曼光譜（右）［93］（B），將SERS管（填充有SERS納米探針）埋在豬肉組織中的TRS裝置照片和將SERS管放置在信號(hào)收集面（d=0）時(shí)透過(guò)不同厚度的豬組織收集到的拉曼光譜［94］（C），對(duì)深部腫瘤進(jìn)行無(wú)創(chuàng)體內(nèi)成像的示意圖和SERS凝膠（含有SERS納米探針的瓊脂糖凝膠充當(dāng)腫瘤類似物）的植入過(guò)程照片（左）以及透射成像結(jié)果（右）［94］（D）Fig.7 Schematic diagram of TRS ［87］（A），schematic diagram of transmission Raman measurement（left），transmission Raman spectra measured with different thicknesses of pork tissue covering（right）［93］（B），the photograph of TRS setup with a SERS tube（filled with SERS nanoparticles） buried in pork tissue and the collected Raman spectra through pork tissue with different thicknesses when the SERS tube was placed on the collection surface（d=0）［94］（C），schematic of noninvasive in vivo imaging of deepseated tumor and photographs of the implantation process of SERS gel（agarose gel containing SERS nanoparticles that act as tumor analogues）（left），and the transmission imaging results（right）［94］（D）the inset in D shows the photograph of the two SERS gel cubes and the green box indicate the plane positions of the two SERS gels（D圖插圖展示了兩個(gè)SERS凝膠立方體的照片，綠色框表示兩個(gè)SERS凝膠的平面位置）

除上述優(yōu)勢(shì)外，基于檢測(cè)形式的差異，TRS的可穿透組織厚度理論上可達(dá)SORS可檢測(cè)深度的兩倍或以上，這是因?yàn)镾ORS 收集的是背向散射拉曼光子，入射光進(jìn)入到組織并激發(fā)拉曼光子后，該拉曼光子必須再按原方向返回到組織表面才能被檢測(cè)到。近年來(lái)，將TRS與SERS相結(jié)合的表面增強(qiáng)透射拉曼光譜（SETRS）技術(shù)為醫(yī)療應(yīng)用開辟了新的途徑，如進(jìn)行骨成分分析和癌組織分析等［86，91］。Xie等［91］將納米探針?lè)胖迷? cm 厚的豬肌肉組織樣本中，通過(guò)SETRS從骨骼表面的納米探針精細(xì)分布中獲得可識(shí)別的納米探針信號(hào)，證明了SETRS 具有非侵入性跟蹤體內(nèi)雙膦酸鹽的潛力。Stone 等［92］將4 種獨(dú)特的SERS納米顆粒注射到一個(gè)厚2 cm 的豬組織塊中，首次從2 cm 厚的組織中檢測(cè)到多重SERS信號(hào)，并重建出偽彩色圖像證明了SETRS進(jìn)行多重成像的能力。而通過(guò)增加納米顆粒的數(shù)量/濃度，他們還成功透過(guò)5 cm 厚的豬肌肉組織檢測(cè)到了埋在其中的SERS納米探針信號(hào)。此外，2022年Stone等通過(guò)進(jìn)一步研究并使用更大的顆粒注射劑量，利用SETRS 成功通過(guò)厚度約7.1 cm 的生物組織檢測(cè)到了小鼠腫瘤（圖7B）［93］。

為了進(jìn)一步提高可探測(cè)的組織厚度，最近本研究小組從光子在透射拉曼檢測(cè)中的傳播過(guò)程以及測(cè)量因素入手，系統(tǒng)研究了實(shí)驗(yàn)參數(shù)（組織厚度、SERS 探針的深度位置、探針亮度、激光功率和光斑尺寸）對(duì)SETRS 探測(cè)厚度的影響［94］，發(fā)現(xiàn)：（1）透射拉曼信號(hào)與信號(hào)源的深度位置之間呈不對(duì)稱的U 型關(guān)系，說(shuō)明病變位于組織中部時(shí)信號(hào)最弱，對(duì)SETRS 的檢測(cè)最具挑戰(zhàn)性；（2）提高SERS 探針的亮度是增加檢測(cè)深度/透射組織厚度最直接有效的途徑；（3）激光光斑尺寸的增大對(duì)深部病灶的透射拉曼信號(hào)強(qiáng)度幾乎沒(méi)有影響。因此，可以采用較大的激光束尺寸來(lái)降低功率密度，這對(duì)SETRS 的臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要，因?yàn)檫^(guò)高的激光輻射量會(huì)對(duì)被照射的組織表面造成潛在的光輻射危害。基于上述發(fā)現(xiàn)，筆者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)制備了超亮的近紅外SERS 探針，開發(fā)了一個(gè)具有深層檢測(cè)能力和光安全性（即入射激光劑量低于MPE閾值）的拉曼檢測(cè)/成像系統(tǒng)。基于該系統(tǒng)，首次利用符合MPE標(biāo)準(zhǔn)的入射實(shí)現(xiàn)了包埋在體外14 cm厚的豬組織中SERS探針的檢測(cè)（圖7C），比目前已報(bào)道的TRS最高檢測(cè)厚度提高了約1倍。該數(shù)值接近成人身體的厚度（腹部-背部距離15~30 cm），揭示了將TRS技術(shù)推向人體無(wú)創(chuàng)全身檢查的可能性。此外，還在MPE標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了未剃毛小鼠（1.5 cm厚）體內(nèi)深層SERS探針的活體無(wú)創(chuàng)成像（圖7D）。相比之下，傳統(tǒng)的背散射檢測(cè)方式無(wú)法實(shí)現(xiàn)拉曼成像。該工作為透射拉曼光譜技術(shù)在體內(nèi)非侵入性生物醫(yī)學(xué)檢查方面的發(fā)展提供了新的思路，證明透射拉曼光譜有望成為未來(lái)臨床癌癥診斷的可行工具。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，隨著光學(xué)探測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，已產(chǎn)生出了針對(duì)不同檢測(cè)深度進(jìn)行研究的成像技術(shù)，組織深度覆蓋微米到數(shù)厘米甚至10 cm以上的范圍（表1），并且所使用的入射激光劑量能夠在臨床安全范圍內(nèi)，極大地提升了光學(xué)檢測(cè)與成像技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化能力。例如基于深穿透拉曼光譜的拉曼檢測(cè)與成像技術(shù)特異性強(qiáng)，目前已能透過(guò)14 cm 的生物組織探測(cè)信號(hào)，在生物檢測(cè)、成像、診斷、術(shù)中導(dǎo)航等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。深度限制的進(jìn)一步改進(jìn)將極大地促進(jìn)治療策略設(shè)計(jì)、手術(shù)規(guī)劃和手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)的完善以及臨床應(yīng)用的發(fā)展。預(yù)計(jì)未來(lái)可從以下幾個(gè)方面繼續(xù)深入研究，進(jìn)一步提高光學(xué)檢測(cè)與成像技術(shù)的深層探測(cè)能力：

表1 各個(gè)成像模態(tài)的組織檢測(cè)深度與特點(diǎn)Table 1 Tissue detection depths and characteristics of each imaging modality

（1）將光學(xué)窗口拓展至更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，如近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ），以降低生物組織對(duì)光子的散射及吸收作用，包括NIR-Ⅱ成像探針的設(shè)計(jì)與合成以及具有高靈敏度的NIR-Ⅱ檢測(cè)裝置的設(shè)計(jì)與搭建［7，75，95］；

（2）結(jié)合組織光學(xué)透明化技術(shù)，降低生物組織對(duì)光的散射與吸收，提高光子在組織中的穿透能力［96］；

（3）對(duì)于需要激發(fā)光源的熒光、光聲和拉曼成像技術(shù)，可以結(jié)合波前整形技術(shù)，實(shí)現(xiàn)散射介質(zhì)深處的光學(xué)聚焦，提高病變處產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而提高生物組織的檢測(cè)深度/厚度極限［97］；

（4）利用多角度投影和檢測(cè)的方式提高穿透性能。目前部分光學(xué)探測(cè)技術(shù)例如熒光成像（熒光分子斷層掃描）和光聲成像（光聲斷層掃描）已利用多角度投影與檢測(cè)的方式實(shí)現(xiàn)了更高的探測(cè)深度，未來(lái)深穿透拉曼光譜技術(shù)可從該方向入手，進(jìn)一步提高檢測(cè)深度至超過(guò)成人軀干厚度水平（腹部-背部距離15~30 cm）［30-31，53］。

此外，納米探針在體內(nèi)的生物相容性和靶向腫瘤的效果也值得關(guān)注，可以通過(guò)選擇合適的表面修飾或配體來(lái)改善顆粒的體內(nèi)適用性。開發(fā)局部注射和使用納米探針的體內(nèi)應(yīng)用場(chǎng)景（如前哨淋巴結(jié)成像）也是非常有前景的研究方向。在這些場(chǎng)景下，需要在前哨淋巴結(jié)/病灶周圍注射納米探針，探針在前哨淋巴結(jié)/病灶中富集，而去除前哨淋巴結(jié)/病灶以及包含在其中的納米探針將會(huì)顯著降低生物安全的風(fēng)險(xiǎn)。另外，隨著生物光學(xué)成像技術(shù)深層檢測(cè)能力的不斷提高，一些病灶定位方法的發(fā)展，包括病灶深度快速預(yù)測(cè)原理、深度預(yù)測(cè)算法、光學(xué)重建算法以及多個(gè)探測(cè)角度等軟件和硬件的配合，將使光學(xué)檢測(cè)與成像技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛［84，98-100］。