氨氮和重金屬Cu2+對放逸短溝蜷的急性毒性及氧化脅迫效應

秦媛，林業宏，侯穎怡，王偉瑜，張凱，鄭善堅*

（1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2.浙江省野生動物生物技術與保護利用重點實驗室，浙江 金華 321004）

放逸短溝蜷（Semisulcospira libertine），又稱青螄，為軟體動物門、腹足綱、前鰓亞綱、新進腹足超目、短溝蜷科、短溝蜷屬[1]的淡水螺類。放逸短溝蜷肉質鮮嫩可口、風味獨特、營養豐富，生活于水體清澈、水溫較低的山區溪流中，喜附著于水中石塊上，以刮食藻類為生。其對水質要求較高，是良好的環境監測指示物種。

銅離子（Cu2+）是生物必需微量元素之一，適量的Cu2+可與蛋白質中的巰基結合，從而干擾巰基酶活性[2]，殺滅病原體，可以保持水生動物體內環境穩定；而過量的Cu2+會導致水生動物的機體結構和生理功能發生異常，導致其產生各種病變和疾病[3]。分子態氨具有脂溶性和不帶電的性質，可以很容易地通過細胞膜，擴散到生物血液和組織中，從而會形成血氨中毒[4]。氨對水生螺的毒性大于亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，且相對于部分蝦類、水蚤類、甲殼類等水生無脊椎動物而言，螺類對氨更具有耐受性[5]。

為了解水體中氨氮和Cu2+脅迫對放逸短溝蜷的影響，現開展2 種環境因子對放逸短溝蜷的急性毒性試驗以及在氨氮和Cu2+脅迫下生理指標測定，評估放逸短溝蜷的毒性響應，以期為今后放逸短溝蜷的人工養殖提供技術支撐，為水環境氨氮和重金屬Cu2+污染的生態風險評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 時間與地點

2021 年7 月。試驗地位于浙江師范大學浙江省野生動物生物技術與保護利用重點實驗室。

1.2 樣本

放逸短溝蜷采集自浙江開化，平均殼長為（18.20±2.03）cm，平均殼寬為（9.53±1.71）cm，于水槽（38 cm×28 cm×15 cm）內暫養，水溫（25±1）℃，pH 值為（7.5±0.1）。

1.3 急性毒性試驗

根據預試驗結果確定藥物質量濃度范圍，按照等比數列間距，設置藥物的質量濃度梯度。每種藥物設置5 個濃度梯度，ρ（Cu2+）為0，0.25，0.50，1.00和2.00 mg/L；ρ（氨氮）為0，16，32，64 和128 mg/L，0 為對照組，其他濃度為處理組。每個濃度梯度的養殖槽，放入20 只經暫養健康的放逸短溝蜷。每個濃度設置3 個平行組。

試驗藥物分別為硫酸銅（國藥集團化學試劑有限公司，AR）和氯化銨（國藥集團化學試劑有限公司，AR）配成的1，10 g/L 母液溶液。

將放逸短溝蜷暫養48 h 后，在38 cm×28 cm×15 cm 的養殖槽中進行試驗。試驗用水為經沉淀、砂濾、曝氣后的自來水，水溫（25±1）℃，pH 值為（7.5±0.1），維持自然光照。試驗周期為48 h，每12 h 更換試驗藥物溶液1 次。試驗期間不投喂。試驗開始后分別于6，12，24，30，36 和48 h 記錄死亡數量，清除死亡個體并計算死亡率。

1.4 超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和丙二醛活性的測定

根據急性毒性試驗結果，分別設置Cu2+濃度依次為0（對照組），0.25（低濃度組）和1.00 mg/L（高濃度組）。氨氮濃度依次為0（對照組），32（低濃度組）和128 mg/L（高濃度組）；每個濃度梯度設置3 個平行，每個濃度的養殖槽中放置20 只放逸短溝蜷。試驗期間，水溫（25±1）℃，pH 值為（7.5±0.1）。每12 h更換對應藥物濃度的溶液。

在試驗開始后的12，24，36 和48 h，分別從每組中隨機取3 只放逸短溝蜷，敲破螺殼，取出放逸短溝蜷的肝臟，按1∶9 的比例，加入勻漿介質0.9%的生理鹽水，于4 000 r/min 離心10 min，取上清液用于各項酶活性及含量的測定。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（CAT）的活性，以及丙二醛（MDA）含量的測定，均使用南京建成生物工程研究所生產的相應試劑盒進行。

1.5 數據分析

試驗數據用Microsoft Excel 2021 分析處理后，使用SPSS 26.0 計算半致死濃度（LC50）、絕對致死濃度（LC100）和95%置信區間。安全濃度（SC）的計算公式采用96 h LC50計算[6]：

水體中分子氨對放逸短溝蜷的脅迫有著重要的作用，其含量用下式表示[7]：

式中：pKa——離解常數；

pH——pH 值。

式中：T——熱力學溫度，K；T=273+t；

t——試驗水溫，℃。

試驗數據的統計分析使用SPSS 26.0。先對數據進行單因素方差分析（ANOVA），處理間若有顯著差異，再用Duncan 法比較均值間的差異顯著性（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 氨氮對放逸短溝蜷的急性毒性效應

本試驗發現，在氨氮脅迫下，隨著藥物濃度的增加或脅迫時間的延長，放逸短溝蜷的攝食量減少，爬壁行為減少，逐漸翻背，最后死亡。氨氮對放逸短溝蜷的致死效應見表1。由表1 可見，ρ（氨氮）較低且在短時間內脅迫時，各組放逸短溝蜷并未出現死亡。但隨著ρ（氨氮）增加和脅迫時間的延長，放逸短溝蜷的死亡率也逐漸增加。說明當水體中含有一定濃度的氨氮時，會對放逸短溝蜷產生一定的致死作用。經統計分析可得，氨氮脅迫對短溝蜷48 h LC50為35.51 mg/L，SC 為3.51 mg/L。

表1 氨氮對放逸短溝蜷的致死效應

2.2 Cu2+對放逸短溝蜷的急性毒性效應

本試驗中，與一些軟體動物類似，在Cu2+脅迫下，放逸短溝蜷先是“假死”狀態，然后緩慢移動，隨著藥物濃度增加或時間的延長，對外界刺激反應遲鈍，沉于水底，身體僵硬，最后死亡。Cu2+對放逸短溝蜷的致死效應見表2。由表2 可見，低濃度的Cu2+脅迫的時間較短時，各組放逸短溝蜷未出現死亡。但隨著ρ（Cu2+）的增加，且高濃度的Cu2+作用的時間延長時，放逸短溝蜷的死亡率也逐漸上升。說明Cu2+對放逸短溝蜷的致死作用與藥物的濃度和藥物脅迫時間長短有關。

表2 Cu2+對放逸短溝蜷的致死效應

經統計分析可得，Cu2+對放逸短溝蜷48 h LC50為0.835 mg/L，SC 為0.083 5 mg/L。

2.3 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟CAT 活性

Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟CAT 活性見圖1（a）（b），由圖1 可見，在Cu2+脅迫下，各Cu2+處理組放逸短溝蜷肝臟的CAT 活性均比對照組低，且隨著脅迫時間的延長，CAT 活性呈現先降低后升高又降低的波浪式變化。各時間低、高濃度組的CAT 活性均顯著低于對照組（P<0.05）。當0.25 mg/L Cu2+處理組和1 mg/L Cu2+處理組脅迫到36 h 時，CAT 活性略有回升，但仍低于對照組。在氨氮脅迫下，氨氮處理組放逸短溝蜷肝臟的CAT 活性均顯著低于對照組（P<0.05），在氨氮的處理濃度分別為32 和128 mg/L 時，隨時間的增加，放逸短溝蜷肝臟的CAT 活性均呈現了先降低后升高的趨勢。當放逸短溝蜷分別在Cu2+和氨氮處理后，其肝臟的CAT 活性均低于對照組，說明在一定程度上2 種藥物對放逸短溝蜷肝臟的CAT 活性產生了抑制作用。

圖1 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟CAT 活性

2.4 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟SOD 活性

Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟SOD 活性的影響見圖2（a）（b）。由圖2 可見，各Cu2+處理組放逸短溝蜷肝臟的SOD 活性，均顯著低于對照組（P＜0.05）。ρ（Cu2+）為0.25 mg/L、12～24 h 時，放逸短溝蜷肝臟的SOD 活性升高，隨著時間的延長，SOD 活性呈先降低后升高的趨勢，說明一定濃度的Cu2+對SOD的活性存在促進作用。ρ（Cu2+）為1.00 mg/L 的處理組中，放逸短溝蜷肝臟的SOD 活性整體呈先降低后升高的趨勢。ρ（氨氮）為32 和128 mg/L 時，放逸短溝蜷肝臟的SOD 活性均呈現先降低后升高的趨勢，且各處理組SOD 活性顯著低于對照組（P＜0.05）。在處理后48 h 時，ρ（氨氮）為128 mg/L 的處理組放逸短溝蜷肝臟的SOD 活性低于對照組，對SOD 活性具有抑制作用。

圖2 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟SOD 活性的影響

2.5 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟MDA 含量

Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟MDA 含量的影響見圖3（a）（b）。由圖3 可見，在Cu2+脅迫下，ρ（Cu2+）為0.25 和1.00 mg/L 處理組中，放逸短溝蜷肝臟的MDA 含量均顯著高于對照組（P＜0.05）；隨著處理時間的增加，處理組放逸短溝蜷肝臟的MDA 含量均增加。在氨氮脅迫下，處理組放逸短溝蜷肝臟MDA的活性均顯著高于對照組（P＜0.05），氨氮質量濃度為32 和128 mg/L 的處理組中，隨著時間的增加，放逸短溝蜷肝臟的MDA 含量逐漸上升。當放逸短溝蜷在Cu2+和氨氮的脅迫下，其肝臟的MDA 含量會隨時間的增加而累積。

圖3 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟MDA 含量的影響

3 討論

3.1 氨氮和Cu2+對放逸短溝蜷的急性致毒效應特征

在氨氮和Cu2+脅迫下，生物體內產生的活性氧自由基會導致脂質過氧化[8]，MDA 是其主要代謝產物。MDA 是一種細胞膜被氧化破壞的指示物，很大程度上可反映出生物受脅迫的程度[9]。MDA 與抗氧化酶可反映出放逸短溝蜷的機體受損程度。放逸短溝蜷肝臟產生的MDA 使脫氧核糖核酸、膜蛋白和酶產生交聯反應，增加了膜的通透性，從而改變細胞膜結構，影響膜的功能和代謝，損傷細胞[10]。本試驗中，由于過剩的活性氧自由基會攻擊不飽和脂肪酸雙鍵，使肝臟膜磷脂中的脂質發生過氧化反應，從而MDA 的含量上升[11]。

在抵御氧化性損傷中，SOD 是一種金屬酶[8]，具有抗氧化防御的功能，能夠催化超氧陰離子自由基歧化，使其生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中有著重要的作用。SOD 可以增強吞噬細胞的防御功能以及機體的免疫功能[12]。CAT 是生物體內重要的保護酶之一，可以催化H2O2分解為水和氧，保護生物體組織免受毒害[13]。因此SOD 和CAT的活性變化會作為指示污染脅迫的重要標志物[14]。

3.2 Cu2+對放逸短溝蜷急性毒性的效應

在本試驗中，隨著Cu2+濃度的逐漸提高，放逸短溝蜷的死亡率隨之上升。在高濃度Cu2+的脅迫下，放逸短溝蜷肝臟的CAT 和SOD 活性要顯著低于對照組，抑制了CAT 和SOD 的活性，且其肝臟的MDA 含量也較對照組高。重金屬Cu2+是屬于劇毒型的金屬，容易被生物體吸收，并且對環境有持久性影響，從而影響水生動物的生理和行為。硫酸銅常被用在水產養殖中[15]，當硫酸銅在動物體內富集到一定程度時，就會對生物體有毒害作用，導致水生動物Cu2+中毒，已經成為重金屬污染物[16]。2014年，有研究發現，在Cu2+脅迫下，方形環棱螺移動緩慢，隨著時間的延長，大多數螺會厴緊縮且不再移動，繼而死亡[17]。

3.3 氨氮對放逸短溝蜷急性毒性的效應

本試驗中，放逸短溝蜷肝臟的CAT 和SOD 活性受到抑制，其肝臟MDA 含量大量增加。氨氮濃度越高，其毒性越強，放逸短溝蜷死亡率越高。因此，在養殖過程中要盡量降低養殖水體中氨氮的濃度。當魚受到輕度的環境脅迫時，會誘導SOD 活性，當受到重度環境脅迫時，SOD 活性會被抑制[18]。氨氮由2 種不同的化學物質組成，即離子態銨和游離的分子態氨[19]，其中離子態銨是水體中的主要營養鹽類，對放逸短溝蜷的影響小，游離的分子態氨則是水產養殖水體中的有毒有害物質，其平衡受pH 值、水溫、鹽度、CO2等因子的影響[20]。由于分子態氨為親脂性分子，半徑較小，容易穿透生物膜的疏水性微孔進入生物肝臟，對魚貝類的生長繁殖帶來危害[4，21-22]，同時也使其抵抗力和免疫力降低[23-24]。分子態氨可以降低魚類的能量代謝，對其鰓、肝等組織造成損傷[25]，使其呼吸困難，最后出現器官衰竭等生理毒性反應[26]。

4 結語

本試驗表明，放逸短溝蜷對高濃度的重金屬Cu2+和氨氮較為敏感。因此，在進行放逸短溝蜷人工育苗時，應要注意對水質的監測，將水體重金屬Cu2+和氨氮的含量控制在安全濃度范圍內，防止水體中有高濃度的重金屬Cu2+和較高含量的氨氮，對放逸短溝蜷造成脅迫，甚至產生中毒現象，從而降低其成活率，導致育苗失敗。