智能型藥物控釋可視化系統(tǒng)的構建與表征
——高分子實驗的新設計與教學實踐

張來英，茍洪瑀，莊海妮，秦宇航，邱惠娟，吳偉泰

廈門大學化學化工學院，福建 廈門 361005

實驗教學是化學類和近化學類專業(yè)本科教學中不可或缺的部分。為了能更好地培養(yǎng)學生分析問題、解決問題、理論和實踐相結合和創(chuàng)新的能力，以幫助學生在畢業(yè)后更快更好地適應科研或實際工作需求，設計與科研前沿及與生產、生活實際聯(lián)系更為緊密的實驗教學內容和實驗方法勢在必行。創(chuàng)新設計的綜合性強化實驗作為實驗課程體系中的重要一環(huán)，以實際需求為導向，以科研帶動教學內容的更新，交叉融合多學科知識，更注重實際應用，有望改變傳統(tǒng)灌輸式的教學方法和動手能力不強的培養(yǎng)現(xiàn)狀，有效提高學生的實驗主動性，提升學生綜合運用知識的能力，并培養(yǎng)創(chuàng)新思維的習慣，以期為推動高等教育實驗教學改革、提高本科實驗教學質量提供參考。

高分子化學是化學和材料學科最重要的專業(yè)基礎課程之一。近年來，隨著高分子科學和材料科學的迅猛發(fā)展，合成性能優(yōu)異的高分子新材料已成為研究熱點，可為生物醫(yī)藥等領域發(fā)展提供基礎。眾所周知，血液中藥物濃度(即血藥濃度)存在安全范圍，而傳統(tǒng)片劑、注射劑等藥物制劑在進入人體后的釋藥速率具有不可控特征，使得血藥濃度在短時間內到達峰值后快速降低，因此往往需要適量多次給藥，以維持相對穩(wěn)定的血藥濃度，使之處于既不高于安全上限閾值、也不低于可產生藥效下限閾值的較窄范圍內。如果將載體材料與藥物分子相結合，設計構建出智能型藥物控釋系統(tǒng)，使之可以通過某種方式調控釋放藥物，將有望在減少不良反應的同時提高藥物利用率，從而緩解上述問題[1–3]。在眾多載體材料之中，刺激響應性高分子微凝膠具有合成方法簡單、響應快、生物相容性良好等優(yōu)點，受到廣泛關注[4,5]。基于以上背景，本實驗圍繞著高分子微凝膠的合成及其用作藥物載體材料，設計了一個集高分子化學、物理化學、儀器分析等學科交叉融合為一體的綜合性強化實驗。通過溫敏性微凝膠的合成，促進學生加深對自由基沉淀聚合的理解；同時，通過溫度響應特性的紫外-可見分光光度計和動態(tài)激光光散射儀等表征，結合高分子微凝膠用作藥物載體材料以設計構建智能型藥物控釋系統(tǒng)的需求，促進學生深入體會高分子材料設計理念。

值得一提的是，實現(xiàn)化學實驗的綠色化是非常緊迫而重要的任務。藥物釋放涉及分子擴散等物理化學基本知識，但傳統(tǒng)藥物分析中常用的化學檢驗方法存在著試劑消耗量大等諸多缺點，對教學成本和環(huán)境都非常不友好，并不符合綠色化學的概念。為此，本實驗從綠色化學理念出發(fā)，提出結合色彩理論與化學知識來理解藥物釋放過程，以在可見光區(qū)存在明顯吸收的藥物作為模型藥物，將“沒有明顯實驗現(xiàn)象”的藥物釋放過程“可視化”，增強實驗教學效果，以達到節(jié)省實驗教學試劑、提高學生對實驗的興趣等目的。該方法結合了分子擴散、物質吸光定律等知識，通過色度分析等即可獲得藥物分子濃度隨時間變化的曲線，甚至可拓展到利用智能手機和取色軟件，就可開展藥物釋放動力學實驗。

1 實驗目的

(1)鞏固高分子材料設計與合成方法，掌握自由基沉淀聚合的基本理論及實驗操作；

(2)了解藥物釋放動力學，加深理解分子擴散的物理化學基本知識；

(3)提升學生對紫外-可見分光光度計、動態(tài)激光光散射儀等儀器的使用及分析能力。

2 實驗原理

水凝膠是一類具有三維交聯(lián)高分子網(wǎng)絡、網(wǎng)絡內含有水等溶劑的高分子材料，展現(xiàn)出類似于生物組織的柔韌性等特性，因而可用作載體材料以設計構建藥物控釋系統(tǒng)[6]。尤其受到重視的是可感知外界環(huán)境(溫度、pH、葡萄糖等)而自身產生物理化學性質變化的刺激響應性高分子凝膠。對于由具有最低臨界溶解溫度(lower critical solution temperature，LCST)的高分子鏈構成的溫敏性微凝膠，在高分子鏈LCST的相應溫度附近，會發(fā)生溫度響應體積相轉變，該溫度稱為體積相轉變溫度(volume phase transition temperature，VPTT)。相比于宏觀塊狀凝膠，顆粒尺寸為微納米級的刺激響應性高分子微凝膠[7]具有“響應快”等優(yōu)勢[8]。本實驗將聚焦高分子微凝膠合成，使用2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(diethylene glycol monomethyl ether methacrylate，EO2)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(poly(ethylene glycol)dimethacrylate，PEGDMA)作為原料，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)作為表面活性劑，過硫酸銨(ammonium persulfate，APS)作為引發(fā)劑，通過水相自由基沉淀聚合法合成溫敏性微凝膠(為討論方便，寫為PEO2；如圖1所示)，并將其用作載體材料以設計構建智能型藥物控釋系統(tǒng)，利用微凝膠低溫溶脹、高溫收縮的特性，實現(xiàn)藥的裝載、釋放。為使藥物釋放過程“可視化”，本實驗選用在可見光區(qū)存在明顯吸收的抗癌藥物鹽酸阿霉素(doxorubicin，DOX·HCl)作為模型藥物。

2.1 溫敏性微凝膠的自由基沉淀聚合法合成原理

從高分子化學知識角度來說，微凝膠可由單體在均相或微納米多相環(huán)境中通過自由基聚合機理制備獲得，如沉淀聚合、乳液聚合、微乳液聚合、無皂乳液聚合等，其合成關鍵在于如何抑制高分子鏈的過度聚合交聯(lián)，以控制凝膠顆粒尺寸處于微納米級[9]。從膠體化學知識角度來說，微凝膠的聚合制備一般主要經(jīng)歷成核、生長過程。在本實驗中，我們將采用自由基沉淀聚合法(radical precipitation polymerization)來合成高分子微凝膠。自由基沉淀聚合法是非均相聚合法，是指生成的聚合物不溶于其單體，或者單體和引發(fā)劑能溶于反應介質但生成的聚合物不能溶于反應介質，使得聚合物生成后從反應體系中沉淀出來的一種聚合方法。對于本實驗的溫敏性高分子微凝膠合成，我們將選用具有LCST的高分子的相應單體作為原料，在反應過程早期，該單體可聚合形成高分子鏈；當這些高分子鏈增長到達一定長度時，由于反應溫度高于高分子的LCST，高分子鏈將蜷曲形成前驅體顆粒；由于范德華引力等作用，這些前驅體顆粒在積累到一定濃度后發(fā)生聚集。前驅體顆粒及其聚集體的形成，疊加聚合反應，使得凝膠顆粒不斷長大，直到達到平衡狀態(tài)，形成穩(wěn)定的、具有一定顆粒尺寸分布的微凝膠[10]。如果有需要，通過適當調節(jié)單體、表面活性劑的種類和投料量等，可以調節(jié)微凝膠的尺寸[11]。

2.2 藥物分子裝載及其釋放的原理

本實驗將以上合成的溫敏性微凝膠用作載體材料以設計構建智能型藥物控釋系統(tǒng)，利用微凝膠低溫溶脹、高溫收縮的特性，實現(xiàn)藥的裝載、釋放。在溫度低于VPTT時，微凝膠溶脹；當將溶脹的微凝膠置于一定濃度的藥物分子溶液中，由于藥物分子在微凝膠內、外存在濃度差，藥物分子可擴散進入微凝膠內部直至達到濃度平衡，實現(xiàn)藥物分子的裝載。在溫度高于VPTT時，微凝膠收縮，收縮過程伴隨高分子網(wǎng)絡產生的“收縮力”，藥物分子將隨同水一起被“擠出”，從微凝膠內部擴散到外部溶液中，實現(xiàn)藥物分子的釋放。由于選取的模型藥物分子DOX在可見光區(qū)存在吸收，因此在釋放過程中可觀察到溶液顏色的變化。

在“可視化”感性認識藥物分子釋放過程的基礎上，本實驗將進一步結合物理化學知識，理性分析藥物分子釋放過程的分子擴散機理。對于微凝膠等多孔聚合物中藥物分子等生物活性物質的釋放，在多數(shù)情況下，該釋放符合Fick定律，其動力學過程可用Higuchi及其改進模型來描述[12]。但當初始含藥量大于藥物的溶解度時，實驗結果經(jīng)常與Higuchi模型不一致，此時藥物恒速釋放，具有溶出控制的特征。Paul等提出了一個簡單的半經(jīng)驗指數(shù)方程[13]：

Mt/M∞=ktn

式中，Mt和M∞分別為時間t時和無窮時間時的藥物累積釋放量；k為結構常數(shù)；n定義為擴散指數(shù)，其數(shù)值與釋放機理有密切關系。一般情況下，0

3 實驗材料、試劑和儀器

3.1 實驗材料和試劑

1只1 mL針筒，2只2 mL針筒，電子天平，帶有加熱控溫功能的磁力攪拌器，磁子，橡膠塞，封口膜，250 mL三頸燒瓶，球形冷凝管，100 mL量筒，油浴鍋，燒瓶夾，冷凝管夾，2只氣球，1個長針，2個針頭，稱量紙，1個4 mL離心管，50 mL離心管若干，滴管若干，10 mL量筒，錫紙，透析袋(M.W.=14000)，細繩，100 mL燒杯，移液槍，1.5 mL離心管若干。

2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(EO2，Aldrich)，聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA，Aladdin)，過硫酸銨(APS，Aldrich)，鹽酸阿霉素(DOX·HCl，迪柏生物)，5 mmol?L-1pH=7.4、pH=8.0的磷酸緩沖鹽溶液(PBS，所用的十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉均為國藥試劑)，均為分析純。

3.2 儀器

紫外-可見分光光度計(Thermo Scientific公司，Multiskan GO全波長酶標儀)，動態(tài)激光光散射儀器(BI-200SM,Brookhaven公司)。

4 實驗步驟

4.1 溫敏性微凝膠PEO2的合成

(1)將EO2、PEGDMA分別放置于電子天平上，用針筒分別從中抽取1.882 g EO2、0.11 g PEGDMA，加入至已裝有磁子、兩端口用橡膠塞塞緊的250 mL三頸燒瓶中，再加入100 mL去離子水；

(2)將三頸燒瓶浸入置于磁力攪拌器上的油浴鍋中，裝上球形冷凝管，固定反應裝置，確保燒瓶內液面高度低于油浴液面，并對反應體系進行通Ar氣、排空氣處理，反應裝置圖如圖2所示；

圖2 溫敏性微凝膠PEO2的合成裝置圖

(3)將攪拌器溫度設定為70 °C，保持加熱10 min，稱取0.046 g APS于4 mL離心管中，加入1 mL去離子水溶解，搖勻。取一只2 mL針管吸取離心管中配好的溶液，向反應體系緩慢、逐滴滴加；

(4)反應持續(xù)進行約3 h。反應完畢后將溶液轉移至離心管，離心、洗滌2–3次后撇去上清液，得乳白色PEO2微凝膠。

4.2 智能型藥物控釋系統(tǒng)DOX@PEO2的構建

(1)避光條件下稱取5 mg DOX·HCl于50 mL離心管中，加入10 mL pH=8.0 PBS緩沖液，振蕩，使藥物完全溶解；將離心濃縮的微凝膠加入到裝有藥物溶液的離心管中，將離心管蓋好并包上一層錫紙，放入冰箱冷藏保存10 h；

(2)冷藏10 h后，將裝有藥物凝膠的離心管取出后進行離心，并用pH=8.0 PBS緩沖液洗滌2–3次，以去除凝膠表面的藥物。撇去上清液后得橘紅色裝載藥物的DOX@PEO2。

4.3 智能型藥物控釋系統(tǒng)DOX@PEO2的藥物釋放過程

(1)將50–60 mL pH 7.4 PBS緩沖液加至100 mL燒杯，放置于磁力攪拌器上進行攪拌，設置溫度為39 °C、轉速為600–650 r?min-1；

(2)將DOX@PEO2裝入透析袋后，置于上述燒杯中，每隔30 min或者1 h用移液槍量取1 mL樣品溶液于1.5 mL離心管中，同時向釋放體系中補充1 mL pH 7.4 PBS緩沖液；

(3)采用紫外-可見分光光度法，獲得樣品溶液在300–700 nm處的吸收光譜。

4.4 表征和測試

(1)取200 μL微凝膠溶液后用去離子水稀釋至10 mL左右，利用渦旋振蕩器對稀釋液進行混勻，配制微凝膠稀釋液，用動態(tài)激光光散射儀測量不同溫度下微凝膠稀釋液中微凝膠的流體力學直徑，作圖并計算微凝膠的臨界相轉變溫度，并用紫外-可見分光光度計測量不同溫度下微凝膠稀溶液在350 nm波長處的吸光度，作圖并計算微凝膠的臨界相轉變溫度；

(2)用紫外-可見分光光度計測量藥物釋放不同時間下溶液的吸光度并繪制釋放曲線。

5 結果與討論

5.1 溫敏性微凝膠PEO2的紫外-可見分光光度法表征

紫外-可見分光光度法測試不同溫度(36–44 °C)下PEO2微凝膠溶液在350 nm波長處的吸光度，結果如圖3所示。從圖3中可得，微凝膠溶液在350 nm處的吸光度隨著溫度的升高，呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。這代表微凝膠在溫度改變前后產生了刺激響應，溫度響應區(qū)域為37–40 °C。通過對350 nm吸光度–溫度曲線進行一階導并利用Lorentz函數(shù)進行擬合，可獲得該微凝膠的VPTT為38.0 °C。

圖3 微凝膠溶液在不同溫度下對350 nm波長吸光度-溫度圖(左)及其一階導數(shù)圖(右)

5.2 溫敏性微凝膠PEO2的動態(tài)激光光散射儀表征

通過動態(tài)光散射測試不同溫度(30–44 °C)下PEO2微凝膠的水合粒徑并作圖。如圖4所示，在30–44 °C溫度范圍內，隨著溫度的升高，PEO2微凝膠的流體力學直徑先保持不變，后在36–40 °C范圍內發(fā)生突降，最后趨于平穩(wěn)。這代表微凝膠在溫度改變前后產生了體積相轉變，轉變區(qū)域為37–40 °C。對流體力學直徑–溫度圖進行一階求導，再使用Lorentz函數(shù)進行擬合，可得到PEO2微凝膠的臨界相轉變溫度為38.0 °C。這一結果與前述通過紫外-可見分光光度法測得的結果一致。

圖4 不同溫度下微凝膠的水合粒徑變化圖(左)及其一階導數(shù)圖(右)

上述分析結果可以解釋為：低溫時，聚合物鏈可與水形成氫鍵作用，處于舒展狀態(tài)，微凝膠溶脹，微凝膠溶液呈現(xiàn)透明狀態(tài)，溶液具有良好的透光率；高溫時，聚合物鏈與水之間的氫鍵被破壞，聚合物鏈間形成氫鍵作用，微凝膠收縮，粒徑減小，微凝膠呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，溶液透光率降低。

5.3 智能型藥物控釋系統(tǒng)DOX@PEO2的藥物釋放過程可視化

如圖5所示，通過觀察藥物釋放中溶液的顏色變化，發(fā)現(xiàn)可以將“沒有明顯實驗現(xiàn)象”的藥物釋放過程“可視化”。隨釋放時間的延長，溶液顏色逐漸加深，這是由于藥物控釋系統(tǒng)中的藥物分子被不斷釋放，在溶液中逐漸累積所導致的。

圖5 DOX@PEO2藥物釋放過程可視化的圖片展示

5.4 智能型藥物控釋系統(tǒng)DOX@PEO2的藥物釋放動力學

為對藥物釋放過程進行定時、定量監(jiān)測，我們對藥物釋放過程的溶液進行定時取樣并測試相應的紫外-可見吸收曲線。我們通過紫外-可見分光光度儀測試了透析液在300–700 nm波段處的吸收曲線，結果表明藥物分子DOX在480 nm處存在吸收，且隨藥物釋放時間的延長，透析液在480 nm處的吸收峰逐漸升高后趨于平穩(wěn)，如圖6所示。由此也可看出，當釋放時間超過12 h時，藥物基本釋放完全。

圖6 不同釋放時間透析液在300–700 nm波段處的吸收曲線

通過截取不同釋放時間的樣品溶液在480 nm處的吸光度可繪制藥物釋放過程的動力學曲線，如圖7所示。根據(jù)物質吸光定律，可直接使用吸光度等代替Mt和M∞來進行擬合獲得擴散指數(shù)n，以從微觀上了解藥物分子的釋放機理。采用Peppas模型(Mt/M∞=ktn)進行擬合，實際方程為Mt/M∞=0.48t0.31(R2=0.988)，獲得擬合擴散指數(shù)n值為0.31。可見，本實驗中智能型藥物控釋系統(tǒng)DOX@PEO2的藥物分子釋放是Fick擴散控制為主的過程。

圖7 DOX@PEO2在39 °C下的藥物釋放曲線：480 nm處吸光度變化圖(左)及對應的Peppas模型擬合圖(右)

6 思考題

(1)化學合成實驗中，溫度設為70 °C的主要目的有哪些？

(2)在使用紫外-可見分光光度法表征VPTT時，如果存在特征吸收峰并采用該吸收值進行表征實驗，是否會影響實驗結果？

(3)結合高分子凝膠等知識，簡述分子擴散與藥物釋放的聯(lián)系。

(4)這種基于高分子微凝膠的藥物控釋系統(tǒng)有哪些潛在的應用？

(5)結合之前學習的化學知識，本實驗可以拓展到其他哪些可控系統(tǒng)的構建?

7 教學反饋與教學建議

本實驗是廈門大學化學化工學院綜合化學實驗“溫度響應高分子微凝膠的水相制備與表征”[14]的并行實驗之一，廣受學生歡迎。該實驗極大地激發(fā)了學生學習的興趣和好奇心；在鍛煉實驗能力的同時，啟迪了學生的創(chuàng)新意識和創(chuàng)新思維；有助于培養(yǎng)學生的學科融合思維和環(huán)保意識，培養(yǎng)學生將理論、實驗和實踐有機融合起來發(fā)現(xiàn)并解決問題的能力，提升了學生的創(chuàng)新科研素養(yǎng)，為將來科研或工作奠定了基礎。

本實驗可分為兩大部分，一部分實驗內容為微凝膠的合成、表征及其藥物裝載，另一部分實驗內容為藥物釋放過程，分別在同一周內的兩天(或者連續(xù)兩周，每周各一天)進行；每次實驗時間建議為6–12小時，學生可以單人單套操作也可以2–3人一組，可以作為綜合性強化實驗引入。除本文所列實驗內容外，還可根據(jù)實際教學需要，拓展至其他響應性高分子及藥物，開設為探索性實驗。

8 結語

本文介紹高分子實驗的一個新設計與教學實踐。通過水相自由基沉淀聚合法合成了溫敏性微凝膠，并使用紫外-可見分光光度計和動態(tài)激光光散射儀對其溫度響應特性進行表征，進而將其用作載體材料以設計構建智能型藥物控釋系統(tǒng)，利用微凝膠低溫溶脹、高溫收縮的特性，實現(xiàn)藥物的裝載、釋放。提出結合色彩理論與化學知識來進行藥物釋放的測定，以在可見光區(qū)存在明顯吸收的藥物作為模型藥物，將“沒有明顯實驗現(xiàn)象”的藥物釋放過程“可視化”，以更加直觀的方式觀測藥物釋放的過程；在此“可視化”感性認識的基礎上，進一步結合物理化學知識，通過紫外-可見分光光度法對藥物釋放過程進行定時、定量監(jiān)測，以理性分析藥物分子釋放過程的分子擴散機理。

本實驗在水相中進行小量合成，簡便易行、綠色環(huán)保、安全可靠且成本較低，集高分子化學、物理化學、儀器分析等學科交叉融合為一體，可面向化學、材料、藥學等專業(yè)開設，有較好的普適性和較強的可設計性，適合作為本科生實驗課程開展。本實驗可拓展利用智能手機和取色軟件，代替紫外-可見分光光度計來開展相關實驗內容，因此在智能手機普及的當下，甚至有望在實驗條件欠缺的學校中推廣這個實驗。