格隆溴銨立體異構體雜質的毛細管電泳測定
——推薦一個藥物分析實驗

李鳳，孟然然，張含智，屈穎娟，康經武,＊

1 西安文理學院化學工程學院，西安市食品安全檢測與風險評估重點實驗室，西安 710065

2 中國科學院上海有機化學研究所，生命過程小分子調控重點實驗室，上海 200032

3 弈柯萊生物科技(上海)股份有限公司，上海 200241

手性是自然界的基本屬性之一。目前上市的藥物中，56%的藥物含有手性中心，其中88%的手性藥物是以外消旋物(racemate)的形式存在的。盡管手性藥物對映體具有相同的物理化學性質，但它們在藥理、毒理學、藥效學、藥代動力學方面卻有著明顯的差異。因此與外消旋體的藥物相比，單一構型的手性藥物在療效和安全性方面更有優勢[1]。如20世紀50年代著名的反應停事件，(R)-構型沙利度胺具有鎮靜及止吐作用能夠有效減緩妊娠反應；而(S)-構型對映體卻有較強的致畸作用。21世紀初的“手性轉換”政策極大地鼓勵了制藥公司發展單一手性藥物。這一政策規定，原來按消旋體形式銷售的手性藥物如果發展成單一手性化合物，就可以按新藥申報而重新獲得專利保護期限[2]。隨著單一構型的手性藥物數量的不斷攀升，為了提高手性藥物的質量控制水平，發展用于手性藥物的分析方法和技術具有十分重要的意義。

色譜技術是最主要的也是最重要的一類手性化合物的分析技術。在色譜技術中，高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、超臨界流體色譜(SFC)以及毛細管電泳(CE)是應用最多的幾種技術[3–5]。HPLC技術應用比較普遍，方法通用性強、精確、靈敏、快速并且可重復性好，其主要缺點是色譜柱昂貴并且需要消耗大量的有機溶劑。毛細管電泳是一種與HPLC互補的手性分離技術，特別適合可電離的高極性手性化合物的分離分析。CE具有多種分離模式，包括毛細管區帶電泳(CZE)、膠束電動色譜(MEKC)、非水相毛細管電泳(NACE)、毛細管等速電泳(ITP)、毛細管等點聚焦(IEF)等，大大擴大了毛細管電泳手性分離方法的適用范圍[6–8]。相對于其他色譜技術，毛細管電泳突出的優點是樣品需要量少(可以分析單細胞)、分離時間短及分離效率高。毛細管電泳在生物大分子、藥物及其代謝物、陰/陽離子及手性化合物的分離等方面表現出獨特的分離性能。20世紀備受關注的人類基因組計劃能夠提前完成，毛細管電泳技術做出了巨大的貢獻。近年來，芯片毛細管電泳、毛細管電泳-質譜聯用(CE-MS)等新技術的不斷發展，使CE在生命科學、醫藥研究、天然產物及食品分析等領域仍有廣泛的應用前景[9,10]。

本論文從藥物分析實驗的角度，介紹了毛細管電泳方法測定抗膽堿類藥物格隆溴銨對映體的含量分析方法，側重點在于介紹毛細管電泳分析方法及手性分離機理，以及將毛細管電泳技術應用于手性藥物對映體分離分析的特點。

1 實驗目的

熟悉毛細管電泳儀的工作原理及基本操作；了解不同類型環糊精的理化性質，及其作為手性選擇劑實現手性分離的機理；掌握毛細管電泳用于藥物格隆溴銨對映體分離的方法。

2 實驗原理

手性化合物立體異構體的色譜分離需要采用手性選擇劑作為手性固定相。與HPLC的手性固定相不同，毛細管電泳的手性分離是將手性選擇劑加入到緩沖溶液中，使對映體與手性選擇劑之間形成可逆的非對映的復合物，具有不同的電泳淌度從而實現分離。Stephen等曾提出一個理論模型來解釋毛細管電泳中實現手性分離的原理[11]。一對對映異構體A、B與手性選擇劑C之間可以存在以下兩個動態的平衡：

其中，μ1、μ2、μA、μB分別為游離的異構體A、B以及異構體與手性選擇劑C形成的復合物的電泳淌度。K1、K2分別為對映異構體A、B與手性選擇劑C之間的結合常數。如果A、B與手性選擇劑C形成的瞬時非對映異構體復合物穩定常數K1、K2不同，對映體自身的電泳淌度與形成復合物的淌度也不同，將會導致兩個異構體的表觀電泳淌度不同(如公式1、2)。其中非對映異構體之間的電泳淌度差越大，越易實現手性分離。

環糊精(cyclodextrin，CD)是一類超分子主客體化合物，也是毛細管電泳中常用的手性選擇劑。它是由直鏈淀粉在芽孢桿菌產生的環糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的一系列寡糖大環化合物[12,13]。通常CD含有6–12個D-吡喃葡萄糖單元，其中研究的較多的是含有6、7、8個葡萄糖單元的分子，分別稱為α、β、γ-環糊精(圖1)。環糊精的立體結構近似于去頂圓錐，具有疏水的空腔及親水的外表面。其疏水的空腔可以與手性小分子或基團發生包結作用，從而實現手性分離。環糊精表面存在大量羥基，通過對這些羥基進行修飾可以得到不同類型的中性環糊精、負電環糊精以及正電環糊精。目前在手性分離中應用較多的環糊精衍生物，包括羥丙基修飾的β-CD(HP-β-CD)、硫酸化的環糊精、磺丁基修飾的環糊精等。

圖1 α、β、γ-三種環糊精的結構圖

格隆溴銨是一種季銨類抗膽堿藥物，作為蕈毒堿受體M3拮抗劑，可以抑制乙酰膽堿與受體的相互作用[14,15]。它具有抑制胃液分泌及調節胃腸蠕動的作用，適用于胃及十二指腸潰瘍、慢性胃炎、胃酸分泌過多等[16]。格隆溴銨的四級季銨鹽結構可以限制其穿過血腦屏障，因此引起的副作用比非極性抗膽堿藥如山莨菪堿、硫酸阿托品要小的多。格隆溴銨結構中具有兩個手性中心，因此共存在4個立體異構體(圖2)。目前在售的格隆溴銨藥物為R,S-構型以及S,R-構型的混合物(優映體，有活性的異構體)，因此其異構體雜質主要包括S,S-構型以及R,R-構型的異構體。

圖2 格隆溴銨及其立體異構體的絕對構型

本實驗中采用以硫酸化-β-環糊精(HS-β-CD)作為手性選擇劑的毛細管電泳手性分析方法，實現了格隆溴銨四種立體異構體的高效分離。研究表明，手性毛細管電泳法是測定藥物手性異構體雜質的有效方法。

3 實驗部分

3.1 實驗試劑

羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)、羥丙基-γ-環糊精(HP-γ-CD)、硫酸化-β-環糊精(HS-β-CD)以及硫酸化-γ-環糊精(HS-γ-CD)購于Fluka公司；γ-環糊精(γ-CD)、β-環糊精(β-CD)以及α-環糊精(α-CD)購于美國Sigma-Aldrich公司。格隆溴銨光學異構體由中國藥品檢驗所提供，磷酸購于上海凌風化學試劑有限公司；氫氧化鈉購于上海大合化學品試劑有限公司；磷酸氫二鈉購于上海阿拉丁試劑有限公司。所用試劑除注明外均為分析純。實驗用水為超純水。

3.2 實驗儀器

P/ACE MDQ毛細管電泳儀(Beckman Coulter,CA,USA)配有PDA檢測器，數據通過裝有32 Karat Software的惠普計算機采集；熔融石英毛細管柱(50 μm×60 cm，有效長度49.5 cm，河北鑫諾科技有限公司)。

3.3 實驗步驟

3.3.1 溶液的配制

電泳運行背景電解質溶液用時現配。背景電解質溶液為50 mmol?L-1的磷酸氫二鈉含40 mg?mL-1的HS-β-CD，最終的pH由稀釋的磷酸調至2.5。格隆溴銨用超純水配制成1 mg?mL-1的樣品溶液。

3.3.2 毛細管電泳儀的操作

優化后的毛細管電泳儀的參數如下：進樣方式采用壓力進樣，進樣壓力1.4 kPa×5 s；分離電壓-12 kV(其中C、D、E以及F分離電壓為12 kV)；檢測波長210 nm。新毛細管柱在30 psi壓力條件下用0.1 mol?L-1NaOH溶液處理30 min，再分別用超純水、背景電解質沖洗5 min。每次運行間隔用0.1 mol?L-1NaOH、超純水、背景電解質各沖洗5 min。

4 結果與討論

4.1 手性選擇劑的比較

實驗嘗試了多種環糊精及其衍生物，包括5種中性的環糊精、2種帶負電的環糊精HS-β-CD和HSγ-CD作為手性選擇劑用于分離4個格隆溴銨立體異構體。發現只有HS-β-CD和HS-γ-CD可以使4個立體異構體實現完全的基線分離(圖3)。雖然這兩種環糊精具有相近的分離選擇性，但是各異構體的出峰順序不同。考慮到HS-γ-CD的價格遠遠高于HS-β-CD，在接下來的實驗中我們選擇了HS-β-CD作為手性選擇劑，對毛細管電泳的分離條件進行了優化。

圖3 不同類型環糊精作為手性選擇劑時的分離選擇性比較

4.2 毛細管電泳分離條件的優化

我們首先考察了手性選擇劑HS-β-CD濃度對格隆溴銨異構體分離的影響。從圖4中可以看出隨著HS-β-CD濃度的增加，分離度逐漸提高，同時各異構體的遷移時間也相應縮短。由于HS-β-CD帶有較多的負電荷，當它的濃度過大時會導致電流大大增加，使基線波動較大。因此，綜合考慮分離度和分析時間的影響，我們選擇最終環糊精的濃度為40 mg?mL-1。接下來，我們對背景電解質緩沖鹽磷酸氫二鈉的濃度進行了優化。我們發現隨磷酸氫二鈉濃度的增加，分離度略有提高(圖5)。但是當濃度增加時溶液的粘度也會增加，導致化合物的電泳淌度減小，遷移時間延長。因此，磷酸氫二鈉的濃度也不宜過高。綜合分析，選擇最終磷酸氫二鈉的濃度為50 mmol?L-1。

圖4 環糊精濃度對分離度(A)和遷移時間(B)的影響

圖5 磷酸氫二鈉濃度對分離度(A)和遷移時間(B)的影響

背景電解質溶液的pH也是毛細管電泳分離中一個非常重要的參數，它不僅會影響溶液的電滲流，同時也會影響帶電化合物的解離狀態。如圖6所示，當pH小于3.0時，無論各異構體的分離度還是遷移時間變化均不大；當pH超過3.0時，分離度就會顯著降低同時遷移時間開始延長，因此最終我們選擇pH為2.5。分離電壓和柱溫對分離的影響我們同樣進行了考察。分離電壓的增大會縮短遷移時間，然而電壓增大而產生的焦耳熱又會導致分離度的降低。同樣，柱溫的升高也會導致遷移時間的縮短以及焦耳熱的產生進而影響基線噪聲。并且當柱溫過高時，手性化合物與環糊精的手性識別可能會受到影響，因而我們并不建議在過高的柱溫下進行分離。

圖6 緩沖溶液pH對分離度(A)和遷移時間(B)的影響

綜合考慮分離度和遷移時間，我們選擇-12 kV的分離電壓和20 °C的柱溫。經過優化后的毛細管電泳分離圖如圖7所示，可以看出各異構體完全實現了基線分離。實驗條件：背景電解質為50 mmol?L-1的磷酸氫二鈉(調至pH 2.5)含40 mg?mL-1的HS-β-CD；柱溫20 °C，-12 kV的分離電壓；檢測波長210 nm；峰1：Glycopyrrolate(R,S)，峰2：雜質A(S,S)，峰3：Enantiomer(S,R)，峰4：雜質B(R,R)

圖7 格隆溴銨及其立體異構體的電泳分離圖

4.3 毛細管電泳分離條件的驗證

在優化的條件下，考察了該方法的線性范圍、精密度、定量限以及檢測限，實驗結果見表1。方法的檢測限為0.005 mg?mL-1，定量限為0.015 mg?mL-1，線性范圍為0.015–2.0 mg?mL-1。方法的精密度主要從峰面積以及遷移時間的重復性來考察。峰面積日內重復性6.92%–10.77%，日間重復性0.63%–11.69%。遷移時間日內重復性0.03%–0.16%，日間重復性1.60%–1.84%。該方法具有較好的重復性，能夠滿足日常藥物分析的需要。

表1 方法確證數據

5 數據處理

5.1 記錄毛細管電泳分離條件

包括：儀器型號、柱長、柱內徑、進樣方式、進樣量、溫度、分離電壓、檢測波長等。

5.2 定性分析

分別進樣，記錄色譜圖，讀取保留時間。

5.3 定量分析

采用歸一化或標準曲線的方法。

6 注意事項

電極和毛細管柱不能接觸，樣品溶液的樣品瓶與緩沖溶液的液面要保持平衡。每次分析前毛細管柱需要進行沖洗和平衡，溫度的變化也會影響分離結果，這對于實驗的可靠性和重現性特別重要。

7 實驗組織

本實驗共用時4–6 h，在平衡毛細管柱期間，可以穿插講授和討論藥典四部通則中0542毛細管電泳法、學習毛細管電泳儀的使用方法以及配制標準溶液等。同時進行系統性試驗的考察，學生分組計算和討論重復性(相對標準偏差，RSD)、毛細管理論板數(n)、分離度(R)、拖尾因子(T)、線性范圍、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)等。

實驗開展過程中涉及到毛細管電泳儀的使用及手性分離技術，建議本實驗向大學二年級下學期或三年級上學期的學生開設。該實驗的考核內容由預習報告、課堂表現、實驗操作和實驗報告組成，各部分占比分別為20%、20%、30%和30%。

8 結語

藥物分析是一門發展藥物分析方法、研究藥物質量規律的科學。而藥品質量直接影響藥品的安全性和有效性，與人類健康與生命安全密切相關。而以“反應停”事件為代表的手性藥物安全越來受到重視，將本實驗引入教學中，激發了學生的學習熱情，啟發學生思考，增強學生的專業責任感和認同感。同時，也提升了教學的學術深度，有助于培養學生的創新意識和綜合實踐能力。