高效液相色譜法測定乳香藥材中乳香酸多組分含量的方法研究

豆小衛 田彩虹 耿娜 梁曉莉 李惠

(1.陜西馮武臣大藥堂有限公司,陜西 咸陽 712000;2.陜西步長制藥有限公司,陜西 咸陽 712000)

乳香為橄欖科植物乳香樹及同屬植物的樹干切口中滲出的堅硬膠狀樹脂。分為索馬里乳香和埃塞俄比亞乳香[1]。辛、苦、溫,歸心、肝、脾經,具有活血行氣止痛,消腫生肌之功效。主要用于痛經、經閉、胃痛、心腹諸痛、風濕痹痛;跌打傷痛、癰疽腫痛、腸癰;瘡瘍腫痛或潰久不收口等[2-7]。在院方和成方制劑中應用廣泛[8-10],而且為進口名貴藥材。近年來,特別是進口名貴藥材的摻假比較普遍[11-15],質量控制尤為重要。在2020年版《中國藥典》一部中乳香藥材的含量測定為揮發油測定。此方法專屬性不強,可能給企業帶來經濟損失和失信風險。而且現有含量測定文獻不多,大多基于揮發油研究,個別僅針對一種成分,不夠科學[16-20]。因此,為了解決這一問題,對乳香藥材的代表性成分[21-27]進行分析研究,建立代表性成分乳香酸多組分含量測定的高效液相色譜法,為乳香藥材質量控制和用藥安全提供依據。

1 材料與儀器

1.1儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀(UV檢測器),UV 2600紫外-可見分光光度計(日本島津公司),MSA6.6S-OCE百萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司),KQ-500VDE超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司),數顯電子恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2試劑與試藥 對照品α-乳香酸(批號M14GB14667,純度99.3%)、β-乳香酸(批號M14GB14668,純度98.4746%)、11-羰基-β-乙酰乳香酸(批號111760-201502,純度99.3%)均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純(賽默飛世爾科技公司),其余試劑為分析純(國藥集團化學試劑有限公司),3批乳香藥材(批號0216321002、0216321003、0216321004)均購自陜西地道藥材有限公司。

2 方法

2.1系統色譜條件 采用Agilent1260-C8(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,柱溫35 ℃,乙腈-0.1%磷酸為流動相,80∶20(測定α-乳香酸,β-乳香酸;檢測波長210 nm),70∶30(測定11-羰基-β-乙酰乳香酸;檢測波長250 nm),流速1.0 mL·min-1,進樣量10 μL。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液制備 分別取α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸對照品適量,精密稱定,分別加甲醇溶液制成42.34 μg·mL-1、50.81 μg·mL-1、41.15 μg·mL-1的對照溶液。

2.2.2供試品溶液制備 取各批乳香藥材適量,分別研細混勻的粉末過4號篩,取0.2 g精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,超聲處理30 min,過濾,即得。

2.2.3陰性樣品溶液制備 取桃膠適量,按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

3 結果

3.1方法學考察

3.1.1專屬性試驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液,按系統色譜條件分別進樣10 μL,結果見圖1。α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸對照品與樣品相同保留時間峰重合,陰性樣品在對照品峰和樣品峰相同保留時間無干擾峰。檢測峰與相鄰色譜峰的分離度大于1.5,理論塔板數大于10000。說明該方法專屬性強,系統適用性好。

A.對照品1;B.對照品2;C.樣品1;D.樣品2;E.陰性樣品;Ⅰ.α-乳香酸;Ⅱ.β-乳香酸;Ⅲ.11-羰基-β-乙酰乳香酸

3.1.2線性關系考察 分別精密吸取α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸對照品溶液各2、5、10、15、20、25 μL,分別注入高效液相色譜儀中,按確定的色譜條件測定各對照品的峰面積。以對照品進樣量為橫坐標X,色譜峰面積為縱坐標Y,繪制標準曲線,計算回歸方程。結果見表1,可知各成分在各自質量濃度范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

3.1.3精密度試驗 取對照品溶液分別按對應的色譜條件連續進樣6次,結果α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸的峰面積RSD(n=6)分別為0.31%、0.29%、0.35%,表明儀器具有良好的精密度。

3.1.4重復性試驗 精密稱取供試品0.2 g,平行制備6份,按供試品溶液制備方法制備,分別測定含量。結果α-乳香酸平均含量為2.15%,RSD為1.81%;β-乳香酸平均含量為3.94%,RSD為2.47%;11-羰基-β-乙酰乳香酸平均含量為3.33%,RSD為2.26%。表明該方法重復性良好。

3.1.5穩定性試驗 取同一供試品溶液(批號:20210102)分別于室溫下放置0、2、8、16、24 h按系統色譜條件進樣測定、記錄峰面積,結果α-乳香酸含量為2.21%,RSD為1.32%,β-乳香酸含量為3.94%,RSD為0.73%,11-羰基-β-乙酰乳香酸含量為3.36%,RSD為1.83%,表明該方法重復性良好。

3.1.6加樣回收率試驗 取重復性試驗項下已知平均含量(α-乳香酸:10.24 mg·g-1、β-乳香酸:35.24 mg·g-1、11-羰基-β-乙酰乳香酸31.32 mg·g-1)的樣品0.1 g精密稱定,按對照品含量1∶1,精密加入稱定的對照品,按供試品溶液方法制備6份,測定含量。計算各成分的平均回收率和RSD。結果α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸的平均回收率(n=6)分別為94.76%,RSD為1.61%;99.40%,RSD為0.84%;100.55%,RSD為1.30%。見表2。

表2 加樣回收率測定結果(n=6)

3.2樣品測定 取3批乳香藥材樣品,按供試品溶液方法制品,在系統色譜條件下測定,依據線性方程計算樣品中α-乳香酸、β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸的含量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(mg·g-1)

4 討論

4.1檢測波長的選擇 將對照品溶液及供試品溶液分別置于紫外-可見分光光度計中,從200～450 nm波段進行全波段掃描,考慮到末端吸收和排除其他干擾,為獲得理想的色譜效果,最終確定α-乳香酸和β-乳香酸的檢測波長210 nm;11-羰基-β-乙酰乳香酸的檢測波長250 nm。

4.2色譜條件的選擇 通過參考文獻[28],流動相選擇酚酸類成分常用比較理想的相系乙腈:0.1%磷酸溶液。為了簡化試驗流動相比例選擇了20∶80和30∶70兩個比例分別測定。此法雖然簡便一些,但也可以進一步完善成梯度洗脫。經考察0～15 min(20∶80),16～35 min(30∶70)較為理想。

4.3供試品溶液制備方法 采用加熱回流和超聲提取方式,設計0.5 h、1 h、2 h分別考察,結果兩種方式沒有統計學差異。為了簡便安全,最終確定供試品溶液的制備方法。

通過試驗本文確立了高效液相法對乳香藥材中乳香酸多組分的含量測定方法,彌補了現行藥典的不足,能客觀地評價藥材質量。說明該方法簡便、可行、專屬性強。為乳香藥材優劣判定提供科學的依據。