禾谷炭疽菌中內(nèi)吞相關(guān)蛋白找尋及特征解析

張凱強(qiáng), 韓長(zhǎng)志,2*

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院, 昆明 650224; 2.云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650224)

受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用作為諸多生物體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞與環(huán)境相互作用的重要途徑之一[1-2],通過(guò)內(nèi)吞相關(guān)蛋白作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)于特定生物大分子的攝取[3]。文獻(xiàn)[4]對(duì)于模式真菌(釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉等)中的內(nèi)吞作用相關(guān)蛋白展開(kāi)了諸多研究工作,明確含有NPFxD基序以及DPFxD基序的蛋白,且基序蛋白通常參與內(nèi)吞靶向信號(hào)過(guò)程。對(duì)于植物病原絲狀真菌而言,其內(nèi)吞過(guò)程與菌絲細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化以及發(fā)育等關(guān)系密切[5]。

禾谷炭疽菌[Colletotrichumgraminicola(Cesati) Wilson]是一種半活體營(yíng)養(yǎng)型植物病原絲狀真菌,可以侵染玉米、小麥、高粱等禾本科植物而引起炭疽病,給世界各國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。20世紀(jì)以來(lái),學(xué)者們對(duì)植物病原絲狀真菌的研究主要集中在遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[8]、細(xì)胞凋亡[9]、異源蛋白表達(dá)[10]等方面。隨著2012年該菌全基因組序列的釋放[11]，促進(jìn)了學(xué)術(shù)界對(duì)于其促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[12]和G蛋白信號(hào)調(diào)控因子(regulators of G-protein signaling, RGS)[13]以及Rab蛋白[14]等研究工作。本研究小組前期對(duì)該菌的G蛋白信號(hào)通路相關(guān)蛋白[15-16],碳水化合物活性酶類(lèi)蛋白[7]、RGS蛋白[13]、效應(yīng)分子motif序列[17]等開(kāi)展了諸多研究報(bào)道,并且對(duì)該菌NPFxD基序蛋白進(jìn)行了找尋及特征解析[18]。NPFxD基序以及DPFxD基序蛋白作為模式真菌中均含有的內(nèi)吞相關(guān)蛋白,對(duì)于植物病原絲狀真菌來(lái)說(shuō),以上兩種蛋白的找尋及特征解析有助于后續(xù)有針對(duì)性的開(kāi)展生物學(xué)試驗(yàn)對(duì)其功能進(jìn)行研究,但目前學(xué)術(shù)界對(duì)于植物病原絲狀真菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中DPFxD基序蛋白的報(bào)道較為少見(jiàn),且中外學(xué)者對(duì)禾谷炭疽菌中存在具有DPFxD基序的蛋白情況尚未見(jiàn)學(xué)術(shù)報(bào)道。

鑒于此,基于文獻(xiàn)[19]報(bào)道,利用模式真菌構(gòu)巢曲霉Aspergillusnidulans中具有DPFxD基序的蛋白氨基酸序列,利用同源序列比對(duì)及關(guān)鍵詞搜索等方法,對(duì)禾谷炭疽菌中全蛋白進(jìn)行分析,找尋具有DPFxD基序的蛋白,并對(duì)上述蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、理化性質(zhì)等特征進(jìn)行分析,為進(jìn)一步開(kāi)展生物學(xué)的試驗(yàn)驗(yàn)證工作打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載禾谷炭疽菌M1.001全基因組序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Colletotrichum+graminicola)。

1.2 DPFxD基序蛋白序列找尋方法

利用EMBOSS fuzzpro[20]預(yù)測(cè)獲取具有DPFxD保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列,對(duì)上述所獲得序列進(jìn)行匯總分析,最終明確該菌中DPFxD基序蛋白登錄號(hào)、功能等相關(guān)信息。

1.3 DPFxD基序蛋白特征分析

1.3.1 跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站HMMTOP version 2.0[21]和TMHMM Server v.2.0[22]等對(duì)具有DPFxD基序的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.3.2 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用在線保守結(jié)構(gòu)域特征分析軟件SMART[23]對(duì)具有DPFxD基序的蛋白進(jìn)行分析。

1.3.3 蛋白亞細(xì)胞定位分析

利用亞細(xì)胞定位分析軟件ProtComp v9.0[24]對(duì)具有DPFxD基序的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)進(jìn)行并繪制其的定位情況。

1.3.4 理化性質(zhì)分析

利用理化性質(zhì)測(cè)定程序Protscale[25]對(duì)具有DPFxD基序的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.5 信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽線在分析軟件TargetP 2.0 Server[26]對(duì)具有DPFxD基序的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè),利用蛋白質(zhì)信號(hào)肽在線分析軟件SignalP 5.0 Server[22]對(duì)具有DPFxD基序的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在線分析軟件Phyre[27]對(duì)具有DPFxD基序的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中在線進(jìn)行Blastp搜索獲取同源序列,并利用ClustalX[28]和MEGA X軟件[29]分別對(duì)其進(jìn)行多重比對(duì)分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 禾谷炭疽菌中DPFxD基序蛋白找尋

文獻(xiàn)[19]對(duì)構(gòu)巢曲霉中的全基因組開(kāi)展DPFxD基序蛋白的搜索工作,利用EMBOSS fuzzpro軟件包進(jìn)行預(yù)測(cè)[20],通過(guò)對(duì)禾谷炭疽菌全基因組序列進(jìn)行分析,共獲得了48條含有DPFxD基序的蛋白序列,如表1所示。

表1 禾谷炭疽菌中DPFxD蛋白的基本信息及獲取方法

2.2 保守結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位分析

基于TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)域分析,具有1個(gè)及以上跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白共9個(gè),而具有2個(gè)及以上跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白共4個(gè),其ID分別為GLRG_05394、GLRG_01154、GLRG_09972、GLRG_01891;進(jìn)一步利用HMMTOP進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),具有1個(gè)及以上跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白共18個(gè),而具有2個(gè)及以上跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白共9個(gè),其中ID為GLRG_09972、GLRG_05394、GLRG_01891的蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)量較多,分別為19、8和7個(gè)。

SMART在線分析表明,僅有9個(gè)蛋白具有明顯的保守結(jié)構(gòu)域,其ID分別為GLRG_00466、GLRG_05048、GLRG_05276、GLRG_00892、GLRG_09336、GLRG_02591、GLRG_10373、GLRG_10778、GLRG_03100(圖1)。這些蛋白具有的保守結(jié)構(gòu)域不相同,包括抑制蛋白C末端結(jié)構(gòu)域、Tre-2-BUB2p-Cdc16p結(jié)構(gòu)域、與各種細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的ATP酶、水解酶、類(lèi)GAL4 Zn(II)2Cys6(或C6鋅)雙核簇DNA結(jié)合域、真菌特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域、UVSB PI-3激酶,MEI-41和ESR-1的結(jié)構(gòu)域、類(lèi)固醇結(jié)合域、泛素相互作用基序等。

Arrestin_C為抑制蛋白C末端結(jié)構(gòu)域;TBC為T(mén)re-2-BUB2p-Cdc16p結(jié)構(gòu)域;AAA為AAA結(jié)構(gòu)域;Cutinase為角質(zhì)酶;GAL4為類(lèi)GAL4 Zn(II)2Cys6(或C6鋅)雙核簇DNA結(jié)合域;Fungal trans為真菌特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域;UME為UVSB PI-3激酶,MEI-41和ESR-1的結(jié)構(gòu)域;FATC為FRAP、ATM、TRRAP C終端命名的結(jié)構(gòu)域;Cyt-b5為類(lèi)固醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域;UIM為泛素相互作用基序圖1 DPFxD基序蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.1 Conserved domain prediction of protein with DPFxD motif protein

對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析(圖2),結(jié)果表明,ID為GLRG_04048、GLRG_05276、GLRG_09972、GLRG_10373的蛋白亞細(xì)胞定位分別在質(zhì)膜、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體,其余44個(gè)蛋白均定位在胞外。

圖2 亞細(xì)胞定位分析Fig.2 Subcellular localization

2.3 理化性質(zhì)分析

對(duì)48個(gè)DPFxD基序蛋白中氨基酸組成情況進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,A(丙氨酸)含量最高,平均達(dá)64個(gè);L(亮氨酸)、S(絲氨酸)含量次之,均為58個(gè);而W(色氨酸)、C(半胱氨酸)含量較低,平均僅為10個(gè)和6個(gè)(圖3)。

圖3 DPFxD基序蛋白氨基酸組成情況Fig.3 Amino acid composition of DPFxD motif protein

理論等電點(diǎn)位于5.51～6.00的蛋白數(shù)量最多,達(dá)10個(gè),所占比例為20.83%;等電點(diǎn)位于4.51～5.00、5.01～5.50、6.01～6.50和8.50～9.00的蛋白數(shù)量次之,均為6個(gè),所占比例為12.50%[圖4(a)]。就蛋白穩(wěn)定性而言,共31個(gè)蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40,所占比例為65.58%親水性總平均值小于0的蛋白共43個(gè),所占比例為89.58%,且親水性總平均值總和為-19.69,平均為-0.41[圖4(b)],屬于親水性蛋白。就脂肪族氨基酸指數(shù)而言,共34個(gè)蛋白分布于70～105,所占比例為70.83%,其中脂肪族氨基酸指數(shù)在70～80的蛋白數(shù)量最多,達(dá)16個(gè),所占比例為33%[圖4(b)]。

圖4 DPFxD基序蛋白基本理化性質(zhì)Fig.4 Basic physical and chemical properties of DPFxD motif protein

對(duì)48個(gè)DPFxD基序蛋白的親(疏)水性進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果表明,在親(疏)水性最強(qiáng)氨基酸殘基及位置方面也存在較大差異。蛋白ID為GLRG_01254的蛋白中位于1 442位的R親水性最強(qiáng),親水性系數(shù)為-4.100;而ID為GLRG_05394的蛋白中位于294位和298位的L和V疏水性最強(qiáng),疏水性系數(shù)為3.744[圖5(a)]。進(jìn)一步對(duì)每個(gè)蛋白的最強(qiáng)親(疏)水性氨基酸殘基進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示:最強(qiáng)親水性氨基酸殘基為D和R的蛋白數(shù)量最多,分別為12和11個(gè);而最強(qiáng)疏水性氨基酸殘基為L(zhǎng)、A和V的蛋白數(shù)量最多,分別為12、9、8個(gè)[圖5(b)]。

圖5 DPFxD基序蛋白的親(疏)水性氨基酸殘基的分布Fig.5 Distribution of hydrophilic (hydrophobic) amino acid residues of DPFxD motif protein

2.4 轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)肽特征

通過(guò)TargetP分析,8個(gè)DPFxD基序蛋白定位于信號(hào)肽,僅有1個(gè)蛋白定位于線粒體,其余蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)可靠性不高,未得到有效定位情況。其中ID為GLRG_04278的蛋白定位于線粒體,預(yù)測(cè)可靠性高達(dá)90.36%;ID為GLRG_06381的蛋白定位于信號(hào)肽,預(yù)測(cè)可靠性達(dá)99.99%。由于TMHMM和HMMTOP程序?qū)τ诳缒そY(jié)構(gòu)和信號(hào)肽的預(yù)測(cè)存在重疊性,利用SignalP 5.0進(jìn)一步分析,結(jié)果顯示,6個(gè)DPFxD基序蛋白具有明顯的信號(hào)肽,其余均無(wú)明顯信號(hào)肽,信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于15～20的蛋白有4個(gè),所占比例為67%(表2)。

表2 DPFxD基序蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)肽特征

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白ID為GLRG_07485的蛋白α螺旋比例較高,達(dá)84%,但其卻不含TM螺旋和β螺旋;ID為GLRG_06771的蛋白無(wú)規(guī)則卷曲的比例高達(dá)96%,而其他3種結(jié)構(gòu)比例較低;總體來(lái)看48個(gè)蛋白中TM螺旋與β螺旋比例較低,最高僅為43%和37%,如圖6所示。

圖6 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Secondary structure analysis

2.6 遺傳關(guān)系分析

以C.graminicola中的48個(gè)含有DPFxD基序的蛋白序列為基礎(chǔ),在NCBI中進(jìn)行同源蛋白找尋。結(jié)果顯示,該菌中的DPFxD蛋白與炭疽菌屬中有較高同源性以及較近親緣關(guān)系的病菌有C.sublineola、C.incanum、C.tofieldiae等,分為明顯的4大類(lèi)(圖7),表明C.graminicola中大部分DPFxD基序蛋白之間的同源性較高。4個(gè)分支中所含DPFxD基序蛋白數(shù)量分別為17、17、5和9個(gè),其中ID為GLRG_11942、GLRG_02591、GLRG_09867、GLRG_10778、GLRG_09021的5個(gè)蛋白屬于同一分支,其親緣關(guān)系較近,但與其他幾個(gè)分支相比該分支蛋白數(shù)量最少;ID為GLRG_06381、GLRG_06312、GLRG_10946、GLRG_05394、GLRG_01891、GLRG_09972、GLRG_07696、GLRG_07485、GLRG_00466的9個(gè)蛋白屬于同一分支;其余兩個(gè)分支中蛋白數(shù)量最多,均為17個(gè)。結(jié)果表明,C.graminicola中具有DPFxD基序的蛋白在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中總體較為穩(wěn)定,但部分蛋白在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了較大分化。

3 討論

植物病原絲狀真菌中的分泌蛋白及CAZymes等致病因子在其生長(zhǎng)發(fā)育及致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[30],隨著學(xué)術(shù)界對(duì)禾谷炭疽菌致病因子不斷的深入研究,一些如GPCR[16]、PI-PLC[31]、Pth11[32]、CFEM[33]等涉及G蛋白信號(hào)效應(yīng)分子逐漸得到進(jìn)一步確認(rèn)。然而,對(duì)于禾谷炭疽菌DPFxD基序蛋白的研究報(bào)道還比較罕見(jiàn)。具有DPFxD基序的蛋白可用于其他正常受體的內(nèi)化過(guò)程,對(duì)于缺乏泛素化位點(diǎn)的受體尤為重要[34]。內(nèi)吞作用可以大量存在絲狀真菌菌絲尖端,并且菌絲尖端的快速延伸可能需要配合內(nèi)吞作用[35]來(lái)實(shí)現(xiàn)。中外學(xué)者對(duì)內(nèi)吞在病菌菌絲生長(zhǎng)中的作用已有了相對(duì)明確的了解,如稻瘟菌中內(nèi)吞調(diào)控蛋白可以有效抑制寄主免疫反應(yīng)[36]。根據(jù)前人內(nèi)吞機(jī)制調(diào)控蛋白研究成果分析,禾谷炭疽菌菌絲成長(zhǎng)過(guò)程極有可能與內(nèi)吞機(jī)制的調(diào)控有關(guān)聯(lián)。當(dāng)植物通過(guò)各種信號(hào)途徑激活體內(nèi)的免疫受體,從而減緩病菌等的進(jìn)一步擴(kuò)散和傳播;同樣,當(dāng)禾谷炭疽菌感應(yīng)到植物的免疫防御反應(yīng)時(shí)也會(huì)采取的應(yīng)對(duì)手段,如分泌毒素、角質(zhì)酶、果膠酶和纖維素酶等致病因子的方式,破壞寄主植物的免疫受體,建立寄生關(guān)系,從而達(dá)到侵染的目的。而內(nèi)吞作用在禾谷炭疽菌寄生過(guò)程中的地位和作用,內(nèi)吞作用與解毒物質(zhì)分泌之間的聯(lián)系,內(nèi)吞作用與植物防御反應(yīng)情況以及內(nèi)吞作用對(duì)效應(yīng)分子分泌和植物中營(yíng)養(yǎng)吸收的影響等問(wèn)題均有待于對(duì)具有DPFxD基序的蛋白功能開(kāi)展進(jìn)一步的研究和探討,從而較好地明確內(nèi)吞機(jī)制,更好地防控植物病原菌。

4 結(jié)論

通過(guò)關(guān)鍵詞搜索、Blastp比對(duì)分析、跨膜結(jié)構(gòu)域以及亞細(xì)胞定位等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,首先明確了C.graminicola中存在48個(gè)DPFxD基序蛋白;其次,通過(guò)在線分析軟件SMART、ProtComp v9.0等,明確其保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、遺傳關(guān)系等情況;最后測(cè)定出有多條與DPFxD基序蛋白預(yù)測(cè)功能相同的蛋白質(zhì)序列;此外,通過(guò)遺傳關(guān)系分析,明確禾谷炭疽菌DPFxD基序蛋白與炭疽菌屬中的C.incanum、C.sublineola、C.tofieldiae等病菌有較高的同源性和較近的親緣關(guān)系等。以上這些成果為深入研究其他炭疽菌屬真菌DPFxD基序蛋白提供有益的參考價(jià)值。