白芍總苷基于Jak/stat3信號通路對高糖誘導的視網膜色素上皮細胞增殖、凋亡的影響

袁小波 彭小珊 周麗麗 唐靜

(1湘潭市第一人民醫院醫學轉化中心,湖南 湘潭 411100;2重慶青年職業技術學院健康醫學院;3湘潭市第一人民醫院營養科;4湖南交通工程學院護理學院)

糖尿病視網膜病變(DR)是歐洲主要的致盲原因,影響近33.3%的糖尿病患者,是人群視力損害的主要原因之一。DR的治療包括激光手術、玻璃體切除術和向眼部注射皮質類固醇或抗血管內皮生長因子藥物。然而,這些治療方法往往不能完全恢復患者失去的視力〔1〕。視網膜色素上皮(RPE)具有強大的抗氧化能力,在維持血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡中發揮作用,并被證明在DR的發展中發揮關鍵作用〔2〕。實驗性的RPE暴露于高糖狀態下會導致結構異常、細胞因子分泌模式的改變及血-視網膜屏障功能障礙〔3〕。白芍總苷(TGP)是從芍藥根中提取的有效成分,已被作為中藥用于治療類風濕關節炎〔4〕。芍藥苷是TGP的主要成分之一,研究〔5〕表明,芍藥苷可降低RPE細胞的氧化應激和線粒體功能障礙,進而減輕心房纖束介導的細胞損傷。本研究猜測TGP能夠保護RPE細胞免受損傷。Janus激酶/信號轉導子及轉錄激活子(Jak/stat3)信號通路是激活炎癥反應的上游信號通路,被認為是炎癥性疾病的治療靶點。已證實高糖能夠通過促進人RPE細胞中Jak/stat3通路上調脂肪酸合成酶(Fas)信號通路和細胞因子信號轉導抑制因子(SOCS)水平,進而加重細胞凋亡〔6〕。然而,Jak/stat3通路在TGP減輕RPE細胞凋亡和損傷中的功能和分子機制仍不清楚。本研究通過構建高糖誘導的體外損傷模型來模擬DR,探討TGP對高糖損傷的人RPE細胞的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 人RPE細胞系ARPE-19細胞取自美國ATCC培養庫。DMEM/F-12培養基、胎牛血清、鏈霉素和青霉素均購自賽默飛公司;葡萄糖、胰島素樣生長因子(IGF)-1、CCK-8試劑盒購自MCE公司;TGP購自寧波立華制藥有限公司;膜聯蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司;白細胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-8酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司;二氯二醋酸熒光素(DCFH-DA)活性氧(ROS)熒光探針購自北京百奧萊博科技有限公司;增殖蛋白〔細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21〕、凋亡蛋白〔B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、Pro-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、活化型(Cleaved)-caspase-3〕、p-Jak、Jak、p-stat3、stat3、β-actin抗體及辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔IgG二抗購自abcam公司。酶標儀購自美國Bio-Rad公司;流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2細胞培養及處理 ARPE-19細胞在含10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM/F-12培養基中培養。這些細胞置于37 ℃,95%的空氣和5%的CO2中孵育。培養基每周更新2或3次。ARPE-19細胞隨機分為正常組、高糖組、TGP低、中、高濃度組和TGP高濃度+IGF-1組。正常組ARPE-19細胞用5.5 mmol/L葡萄糖刺激;其余5組ARPE-19細胞加入50 mmol/L葡萄糖處理來誘導產生細胞損傷模型〔7〕,TGP低、中、高濃度組依次加入2.5、5.0、10.0 μg/ml TGP〔8〕,TGP高濃度+IGF-1組加入10 μg/ml TGP和20 μmol/L Jak/stat3通路激活劑IGF-1〔9〕。

1.3CCK-8檢測ARPE-19細胞的生存能力 ARPE-19細胞被接種在96孔培養板,密度為5×103個細胞/孔,在37 ℃和95%的空氣和5%的CO2下培養48 h,CCK-8溶液(10 μl/孔)被添加到培養基中,細胞在相同條件下孵育1 h。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度。

1.4流式細胞儀檢測ARPE-19細胞的凋亡能力 經過處理的ARPE-19細胞,用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次。采用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。將處理后的細胞重新懸浮于1×結合緩沖液中,并在流動管中加入500 μl細胞懸液。隨后,在細胞懸液中添加5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI,室溫黑暗染色15 min。采用流式細胞儀分析。實驗數據采用FlowJo軟件進行分析。

1.5ELISA檢測ARPE-19細胞中促炎因子水平 從24孔板上收集處理后的各組ARPE-19細胞的培養上清。隨后,根據生產廠家提供的方案,采用ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-6和IL-8的促炎細胞因子濃度。

1.6DCFH-DA流式細胞術檢測ARPE-19細胞內ROS水平 處理后的細胞與10 μmol/L DCFH-DA在37 ℃黑暗條件下孵育20 min。然后用PBS洗滌3次,再在PBS中懸浮調整濃度至1×106個細胞/ml。隨后,在488 nm激發波長和521 nm發射波長下使用流式細胞儀監測細胞。使用FACScan流式細胞儀和CellQuest軟件分析ROS生成。

1.7Western印跡檢測ARPE-19細胞內增殖、凋亡及Jak/stat3信號通路相關蛋白表達 TGP和高糖處理后收集ARPE-19細胞,4 ℃下用RIPA裂解緩沖液提取30 min,用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒分析總蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品蛋白。隨后,蛋白質被轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂乳阻斷后,與CyclinD1、p21、Bax、Bcl-2、Pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3、p-Jak、Jak、p-stat3、stat3和β-actin在4 ℃與膜孵育過夜,然后與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育1 h。使用標準增強化學發光檢測試劑觀察信號。采用ImageJ軟件對條帶強度進行量化。

1.8統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1TGP對高糖誘導的RPE細胞增殖的影響 與正常組相比,高糖組細胞活性顯著下降,CyclinD1表達明顯減小,p21表達明顯增加(P<0.05);與高糖組相比,TGP低、中、高濃度組細胞活性和CyclinD1表達顯著升高,p21表達顯著降低,并呈現明顯濃度依賴性(P<0.05);與TGP高濃度組相比,TGP高濃度+IGF-1組細胞活性和CyclinD1表達明顯降低,p21表達明顯升高(P<0.05),見表1、圖1。

2.2TGP對高糖誘導的RPE細胞凋亡的影響 與正常組比較,高糖組細胞凋亡率明顯升高,Bax表達升高,Bcl-2表達降低,Cleaved/Pro-Caspase-3比值增大,有統計學差異(P<0.05);與高糖組比較,TGP低、中、高濃度組細胞凋亡率依次下降,Bax表達依次降低,Bcl-2表達依次升高,Cleaved/Pro-Caspase-3比值依次降低,有統計學差異,并呈明顯劑量依賴性(均P<0.05);與TGP高濃度組比較,TGP高濃度+IGF-1組細胞凋亡率明顯升高,Bax表達明顯升高,Bcl-2表達明顯降低,Cleaved/Pro-Caspase-3比值明顯增大(P<0.05),見表1、圖1、圖2。

表1 TGP對高糖誘導的RPE細胞增殖和凋亡的影響

1～6:正常組、高糖組、TGP低濃度組、TGP中濃度組、TGP高濃度組、TGP高濃度+IGF-1組圖1 TGP對高糖誘導的RPE細胞增殖蛋白、凋亡蛋白及細胞中Jak/stat3信號通路蛋白的影響

圖2 TGP對高糖誘導的RPE細胞凋亡的影響

2.3TGP對高糖誘導的RPE細胞炎癥因子的影響 高糖組細胞中IL-1β、IL-6、IL-8含量顯著高于正常組(P<0.05);TGP低、中、高濃度組細胞中IL-1β、IL-6、IL-8含量明顯比高糖組低,且隨著TGP濃度的升高明顯降低(P<0.05);TGP高濃度+IGF-1組細胞中IL-1β、IL-6、IL-8含量比TGP高濃度組明顯增高(P<0.05),見表2。

2.4TGP對高糖誘導的RPE細胞中ROS的影響 高糖組細胞中ROS熒光強度比正常組明顯增加(P<0.05);TGP低、中、高濃度組細胞中ROS熒光強度顯著低于高糖組,且呈明顯濃度依賴性(P<0.05);TGP高濃度+IGF-1組細胞中ROS熒光強度比TGP高濃度組降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

2.5TGP對高糖誘導的RPE細胞中Jak/stat3信號通路蛋白表達的影響 與正常組相比,高糖組p-Jak/Jak與p-stat3/stat3比值變大,差異有統計學意義(P<0.05);與高糖組相比,TGP低、中、高濃度組p-Jak/Jak、p-stat3/stat3比值變小,且呈劑量依賴性(P<0.05);與TGP高濃度組比較,TGP高濃度+IGF-1組p-Jak/Jak與p-stat3/stat3比值增大,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1、表2。

表2 TGP對高糖誘導的RPE細胞炎癥因子、細胞中ROS及Jak/stat3信號通路蛋白表達的影響

3 討 論

相關研究顯示,DR的發病率隨糖尿病病程的增加而增加,約為44.4%;而7年后發病率可上升到56%。DR的發生與多種危險因素有關,如高血糖、聚乙醇代謝異常、細胞凋亡、自由基作用等〔10〕。但目前關于DR的發病機制尚不完全清楚,而且現有的治療手段對DR患者的視力恢復是非常有限的。因此,闡明DR發生的分子機制及找尋有效的靶向藥物對DR治療非常重要。

最近,高血糖被認為是DR損傷的主要原因。研究〔11〕發現,高糖可導致RPE細胞損傷,從而影響新生血管和玻璃體增殖。另有研究〔12〕表明,高糖可引起RPE細胞增殖分化和功能改變。近年來,高糖誘導的細胞損傷模型被廣泛用于模擬DR過程,而ARPE-19細胞作為人類RPE細胞系,也被廣泛應用于DR的許多研究中。本研究結果與Dai等〔7〕的研究一致。提示高糖誘導ARPE-19細胞體外損傷模型構建成功。CyclinD1和p21均與細胞增殖相關,CyclinD1發揮正調節作用,p21發揮負調節作用〔13〕。在受損的RPE細胞中,抗凋亡蛋白Bcl-2水平減小,促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3水平增加〔14〕。本研究結果說明,高糖對ARPE-19細胞損傷的誘導作用與相關蛋白的表達失調有關。

越來越多的證據表明,植物和果實中天然藥物化合物具有較強的抗糖基化能力〔15〕。TGP是從中藥白芍根中提取的具有生理活性成分的混合物,具有較強的抗炎免疫能力。芍藥苷作為TGP的一種,已被發現在大鼠視網膜缺血動物模型中通過抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(NLRP)3炎癥小體信號通路來延緩視網膜損傷〔16〕。另外,張博等〔17〕認為,芍藥苷可能通過抑制膠質細胞活化,提高視網膜谷氨酸轉運體及谷氨酰胺合成酶表達,從而對糖尿病大鼠視網膜Muller細胞產生保護作用。然而,TGP是否對DR有保護作用還不清楚。本研究結果表明,TGP可抑制高糖誘導的ARPE-19細胞凋亡,促進增殖,減輕細胞損傷。提示TGP可能是治療DR的一種有效藥物。

Jak/stat3通路通過調節多種細胞生物學過程參與多種疾病的進展。Qi等〔18〕在增生性玻璃體視網膜病變患者的玻璃體中發現了高水平的IL-6,進一步實驗證實IL-6可顯著激活RPE細胞中Jak/stat3通路,進而促進細胞增殖、遷移和細胞外基質合成。Jing等〔19〕發現,WP1066能夠特異性阻斷Jak/stat3信號通路,降低IL-2誘導的RPE細胞遷移能力。另外,在高糖環境下,Jak/stat3信號通路可增加ARPE-19細胞流動性和通透性〔20〕。本研究結果說明,該通路的激活可能參與高糖相關DR的發病機制,提示TPG可抑制Jak/stat3通路。IGF-1是Jak/stat3信號通路激活劑,能夠逆轉馬錢素的抗炎作用,從而緩解炎癥性腸病〔9〕。本研究說明,該通路被激活,同時IGF-1的治療能夠顯著抑制TPG對ARPE-19細胞損傷的保護作用,使凋亡能力、炎癥因子及ROS水平明顯升高,增殖能力明顯減弱,進一步表明,TPG可能通過抑制Jak/stat3信號通路減輕高糖誘導的ARPE-19細胞損傷,促進細胞增殖并抑制其凋亡。

綜上,TPG通過阻斷Jak/stat3信號通路,抑制高糖誘導的RPE細胞凋亡和炎癥損傷,促進增殖。