POU6F2-AS2靶向miR-125b調控口腔鱗狀細胞癌增殖、侵襲和轉移的機制

李婧 張發奎 鄧智元

(1青海大學附屬醫院口腔頜面外科,青海 西寧 810001;2中南大學湘雅口腔醫院口腔頜面外科)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)與頭、頸部鱗狀細胞癌,是世界上最常見的癌癥之一〔1〕。目前研究發現,檳榔、煙草是導致OSCC發生的主要病因〔2〕,雖然OSCC的診斷和治療取得了較大進步,但由于OSCC發病機制不明確,針對OSCC侵襲轉移及監測復發的分子標志物和治療靶點缺乏,OSCC的5年生存率仍未得到明顯提高〔3〕。探究OSCC侵襲轉移過程的靶標分子,對提高OSCC生存率具有潛在意義。近來研究發現,微小RNA(miR)-125b能調節與遷移、侵襲、凋亡、增殖等致癌表型有關的一系列不同靶基因,參與多種腫瘤的發生發展過程〔4〕,且miR-125b在OSCC中表達下調,與OSCC發生發展關系密切〔5〕。另有研究報道,具有基因重組轉錄功能的新型長鏈非編碼RNA(LncRNA)-POU6F2-AS2也參與OSCC發生發展過程〔6〕。但LncRNA-POU6F2-AS2調控OSCC的基因和途徑均不明確,其是否與miR-125b之間存在調控關系也不甚明確。本研究通過diana軟件預測到LncRNA-POU6F2-AS2與miR-125b有靶向結合位點,對OSCC中LncRNA-POU6F2-AS2及miR-125b表達進行干預表達,并驗證二者的關系,以期闡明LncRNA-POU6F2-AS2在OSCC中的靶向調控機制。

1 材料與方法

1.1細胞來源及主要試劑與儀器 人正常口腔上皮細胞系(HOK,購自上海冠導生物工程有限公司,貨號:GD-C26719840);OSCC細胞系(CAL-27、TSCCa、Tca8113,均購自上海細胞研究所,貨號:MZ-1290、MZ-2347、MZ-1689);CCK-8試劑盒(購自上海經科化學科技有限公司,貨號:CK04-2);Lipofectamine3000轉染試劑盒(購自上海恒斐生物科技有限公司,貨號:L3000-015);基質膠(購自上海晶抗生物工程有限公司,貨號:JK-R5450);增殖標記蛋白(Ki67)、E-鈣黏蛋白(cadherin)、Yes相關蛋白(YAP)、抗氧化蛋白質(PRXL2)、類胡蘿卜素2相關因子(NRF)2、鈣信號轉導因子(TACSTD)2等抗體(均購自美國abcam公司,貨號:ab16667、ab40772、ab56701、ab109118、ab89443、ab227689);實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀購自西安天隆科技有限公司,型號:L988);酶標儀(購自上海研卉生物科技有限公司,型號:HBS-1096A);光學顯微鏡(購自日本尼康,型號:E100)。

1.2細胞培養 HOK及OSCC細胞系(CAL-27、TSCCa、Tca8113)復蘇后,用RPMI1640培養基培養。

1.3qRT-PCR檢測LncRNA-POU6F2-AS2、miR-125b相對表達水平 提取OSCC細胞系(CAL-27、TSCCa、Tca8113)和HOK細胞總RNA,逆轉得到cDNA,進行PCR,用2-ΔΔCt法計算LncRNA-POU6F2-AS2、miR-125b表達水平。引物序列(5′-3′):LncRNA-POU6F2-AS2正向:ACAGCAGTGCCAGAAGGAGT,反向:TTTGCAGACCTGAGCTTGTG;miR-125b正向:TCCCTGAGACCTAACTTGTG,反向:CTGAA-GCTTTCTGGCGATTC;U6正向:CTCGCTTCGGCAGCA,反向:AACGCTTCACGAATTTGCGT;β-actin正向:TCCCTGGAGAAGAGCTACGA,反向:AGCACTGTGTTGGCGTACAG。

1.4細胞轉染及分組處理 取CAL-27細胞按照5×104個/孔的密度接種于96孔板內,并分為空白對照組、LncRNA-POU6F2-AS2干擾載體(Si-POU6F2-AS2)組、LncRNA干擾陰性對照(Si-NC)組、miR-125b激動劑(miR-125b-mimic)組、miR-125b激動劑陰性對照(miR-125b-NC)組,每組6個復孔。用脂質體法向CAL-27細胞轉染LncRNA-POU6F2-AS2干擾載體及其陰性對照載體,得到Si-POU6F2-AS2組及Si-NC組;向CAL-27細胞轉染miR-125b mimic及其陰性對照試劑,得到miR-125b-mimic組及miR-125b-NC組。轉染后24 h,取細胞進行后續試驗。

1.5CCK-8法檢測細胞增殖活性 取轉染后24 h的各組細胞,加入CCK-8溶液10 μl后繼續培養2 h,檢測各組細胞的OD值,計算細胞存活率。

1.6Transwell小室法檢測細胞遷移侵襲能力 用不含10%胎牛血清的培養基重懸轉染后24 h的各組細胞,將100 μl細胞懸液加入上室(侵襲檢測時預鋪基質膠),下室加入500 μl培養液(含10%胎牛血清)孵育24 h后,用4%多聚甲醛固定細胞,并用結晶紫染色后,于光學顯微鏡下進行計數。

1.7RT-qPCR檢測LncRNA-POU6F2-AS2、miR-125b的相對表達 取1.4中轉染24 h后的各組細胞,提取總RNA,按1.3中檢測方法,檢測各組細胞LncRNA-POU6F2-AS2、miR-125b表達水平。

1.8Western印跡檢測各組細胞Ki67、E-cadherin、YAP、PRXL2、NRF2、TACSTD2蛋白表達1.4中提取各組細胞總蛋白并檢測蛋白濃度后,凝膠電泳分離蛋白樣品并轉膜,脫脂奶粉封閉4 h后,4 ℃下與一抗(Ki67、E-cadherin、YAP、PRXL2、NRF2、TACSTD2抗體,均為1∶1 000,GAPDH 1∶2 000)孵育過夜,加二抗(1∶5 000)于室溫下孵育3 h。顯影,用化學發光成像分析系統拍照并分析灰度值。

1.9共轉染Si-POU6F2-AS2與miR-125b-inhibitor后對細胞Ki67、E-cadherin、YAP蛋白相對表達水平檢測 取CAL-27細胞系,以5×104個/孔的密度接種于96孔板內,將Si-POU6F2-AS2與miR-125b-inhibitor及其陰性對照試劑共轉染,并分為Si-NC+miR-125b-NC組、Si-NC+miR-125b-inhibitor組、Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組、Si-POU6F2-AS2+miR-125b-inhibitor組及未轉染組(空白對照組),每組設置6個復孔。Si-POU6F2-AS2+miR-125b-inhibitor組用Lipofectamine3000轉染試劑盒分別轉染Si-POU6F2-AS2和miR-125b-inhibitor;Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組轉染Si-POU6F2-AS2和miR-125b-NC;Si-NC+miR-125b-inhibitor組轉染Si-NC和miR-125b-inhibitor;Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組轉染Si-POU6F2-AS2和miR-125b-NC;空白對照組不做任何處理;各轉染組均按轉染試劑盒說明書進行轉染。各組轉染后24 h,取細胞用1.8中方法檢測各組細胞Ki67、E-cadherin、YAP蛋白相對表達水平。

1.10統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1不同細胞系中LncRNA-POU6F2-AS2及miR-125b表達 與正常口腔上皮細胞系(HOK)相比,OSCC細胞系(CAL-27、TSCCa、Tca8113)中LncRNA-POU6F2-AS2表達明顯升高,miR-125b表達明顯降低(P<0.05),其中 CAL-27細胞系LncRNA-POU6F2-AS2表達最高,miR-125b表達最低,見表1。

表1 不同細胞系中LncRNA-POU6F2-AS2及miR-125b表達比較

2.2抑制LncRNA-POU6F2-AS2或激活miR-125b表達對細胞LncRNA-POU6F2-AS2及miR-125b蛋白表達的影響 與空白對照組比較,Si-POU6F2-AS2組、miR-125b-mimic組細胞LncRNA-POU6F2-AS2表達降低,miR-125b表達升高(P<0.05),見表2。

2.3抑制LncRNA-POU6F2-AS2或激活miR-125b表達對細胞增殖活性的影響 與空白對照組比較,Si-POU6F2-AS2組及miR-125b-mimic組細胞增殖活性明顯降低(P<0.05),見表2。

2.4抑制LncRNA-POU6F2-AS2或激活miR-125b表達對細胞侵襲遷移能力的影響 與空白對照組比較,Si-POU6F2-AS2組及miR-125b-mimic組細胞侵襲遷移能力明顯降低(P<0.05),見表2、圖1。

2.5抑制LncRNA-POU6F2-AS2或激活miR-125b表達對細胞Ki67、E-cadherin、YAP、PRXL2、NRF2、TACSTD2蛋白表達的影響 與空白對照組比較,Si-POU6F2-AS2組及miR-125b-mimic組細胞Ki67、YAP、PRXL2、NRF2、TACSTD2蛋白表達明顯降低,E-cadherin蛋白表達明顯升高(P<0.05),Si-NC組及miR-125b-NC組上述指標與空白對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05),見表2、圖2、表3。

表2 各組細胞中LncRNA-POU6F2-AS2和miR-125b表達、細胞增殖活性、侵襲、遷移能力及Ki67、E-cadherin、YAP蛋白表達比較

圖1 各組空白細胞遷移及侵襲(結晶紫染色,×200)

1～5:空白對照組、Si-NC組、miR-125b-NC組、Si-POU6F2-AS2組、miR-125b-mimic組圖2 各組細胞Ki67、E-cadherin、YAP、PRXL2、NRF2、TACSTD2蛋白表達

2.6共轉染Si-POU6F2-AS2與miR-125b-inhibitor對細胞Ki67、E-cadherin、YAP蛋白相對表達水平的影響 與空白對照組比較,Si-NC+miR-125b-inhibitor組細胞Ki67、YAP蛋白表達明顯升高,E-cadherin表達明顯降低(P<0.05);Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組細胞Ki67、YAP蛋白表達明顯降低,E-cadherin表達明顯升高(P<0.05)。與Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組相比,Si-POU6F2-AS2+miR-125b-inhibitor組細胞Ki67、YAP蛋白表達明顯升高,E-cadherin表達明顯降低(P<0.05),見圖3、表4。

表3 各組細胞中PRXL2、NRF2、TACSTD2蛋白表達水平比較

1～5:空白對照組、Si-NC+miR-125b-NC組、Si-NC+miR-125b-inhibitor組、Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組、Si-POU6F2-AS2+miR-125b-inhibitor組圖3 各組細胞Ki67、E-cadherin、YAP蛋白表達

表4 各組細胞中Ki67、E-cadherin、YAP蛋白表達水平比較

3 討 論

OSCC是常見的口腔癌類型,占全球所有惡性腫瘤的近3%〔7〕,其進展緩慢,但通常確診時已為晚期〔8〕。故闡明OSCC發生和發展的分子機制對OSCC的診斷治療及預后檢測具有重要意義。Xu等〔9〕研究發現,LncRNA-POU6F2-AS2在結腸癌中呈高表達,并能通過抑制miR-377表達促進結腸癌的增殖、侵襲遷移過程。李理等〔10〕研究發現,LncRNA-POU6F2-AS2在胃癌組織中高表達,且其表達與胃癌患者腫瘤分期、淋巴結轉移及生存預后關系密切。Liu等〔6〕首次提出,LncRNA-POU6F2-AS2通過調控DNA修復參與OSCC病理過程,但其調控機制不明。本研究結果提示,LncRNA-POU6F2-AS2與OSCC增殖、侵襲及遷移等惡性生物學關系密切,但其調控的分子機制還不甚明確。另外,研究證實,OSCC發展過程中,細胞膜上E-cadherin及胞間連接復合物不斷被水解,可使細胞間黏附能力下降,腫瘤細胞易發生侵襲和轉移〔11〕;轉錄共激活因子YAP與E-cadherin表達呈負相關,可與Smad蛋白家族結合,通過激活轉化生長因子(TGF)-β的釋放與分泌,促進細胞脫黏附、運動遷移能力,導致OSCC增殖、侵襲和轉移能力增強〔12〕。本研究表明,抑制OSCC中LncRNA-POU6F2-AS2表達,可抑制細胞增殖、侵襲、遷移能力,緩解其惡性生物學進程。但LncRNA-POU6F2-AS2的靶向調控機制,還需進一步研究。

研究證實,microRNA的異常降解參與OSCC的發生發展過程,且對OSCC的臨床診斷、治療及預后檢測有著重要的作用〔13〕,其中miR-125家族成員參與各種癌細胞的細胞分化、增殖、轉移、凋亡和免疫防御等生物學過程〔14〕。miR-125b為miR-125家族成員之一,由染色體11q23及21q21基因轉錄而來,并參與調節與遷移、侵襲、凋亡、增殖等致癌表型有關的不同靶基因表達來調控多種腫瘤生物學過程〔15〕。Pei等〔16〕發現,miR-125b和E-cadherin減少與人類轉移性黑色素瘤發生關系密切,且miR-125 b能夠通過干擾抑制黏著斑激酶(FAK)表達,上調E-cadherin表達,抑制癌細胞的侵襲、遷移過程;Lu等〔17〕發現,miR-125b可直接綁定到長鏈非編碼LncRNA-PICSAR上,并通過抑制YAP1的表達而發揮減毒和抗癌作用,證實miR-125b在腫瘤生長及侵襲遷移過程發揮重要的監管作用。研究發現,miR-125b在OSCC發生發展過程中也扮演重要的角色〔18〕,Nakanishi等〔19〕發現,miR-125b低表達OSCC患者總體生存率降低,可能與其可靶向上調TACSTD2蛋白表達,促進口腔上皮細胞侵襲遷移及腫瘤集落的形成,進而促進OSCC患者腫瘤轉移有關。Chen等〔20〕發現,miR-125b表達下調與OSCC預后不良關系密切,且miR-125b能通過靶向抑制PRXL2-NRF2信號軸的激活,促進腫瘤氧化應激反應,進而抑制OSCC的侵襲與遷移。本研究結果與文獻〔19,20〕結果一致,提示過表達miR-125b表達可抑制其靶標分子TACSTD2及PRXL2-NRF2信號軸的激活,抑制OSCC的增殖、侵襲遷移過程。但miR-125b的異常轉錄也受長鏈非編碼基因的調控〔5〕,Yang等〔21〕研究證實,LncRNA-POU6F2-AS2可通過靶向下調miR-125b表達加重非小細胞肺癌的致癌性;進一步分析提示,miR-125b-inhibitor能逆轉LncRNA-POU6F2-AS2低表達對OSCC的增殖、侵襲遷移的抑制作用。

綜上,敲低Lnc RNA-POU6F2-AS2可能通過上調miR-125b表達抑制OSCC細胞的惡性生物學行為,但LncRNA-POU6F2-AS2在OSCC中的調控機制有待進一步探究。