紫朱軟膏對金黃色葡萄球菌感染急性化膿性感染傷口的干預(yù)作用

廖久棋 劉靜 惠超 李東寧

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科,遼寧 錦州 121000)

急性化膿性感染是臨床上常見的嚴(yán)重創(chuàng)傷傷口感染,主要由于致傷過程與不潔物品相關(guān),加之傷口創(chuàng)面直接暴露于空氣中,感染金黃色葡萄球菌所致〔1,2〕。金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的急性化膿性感染,膿液中含有大量變性壞死的中性粒細(xì)胞,膿液渾濁呈凝乳狀,大量的細(xì)菌污染導(dǎo)致傷口創(chuàng)面很難愈合〔3,4〕。臨床上創(chuàng)面通常由于抗生素耐藥、清創(chuàng)不徹底而引起愈合時間長、愈合較難等情況,嚴(yán)重影響患者的身心健康〔5,6〕。本研究探討紫朱軟膏對金黃色葡萄球菌感染急性化膿性感染傷口的干預(yù)作用。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取清潔級SD大鼠50只,10周齡,雄性,體質(zhì)量為(200±20)g,由廣州賽業(yè)百沫生物科技有限公司提供,所有大鼠在相對濕度、室溫分別為50%、23 ℃的無菌鼠籠中行7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)。本試驗嚴(yán)格按照動物實驗倫理要求進(jìn)行操作,且通過醫(yī)院倫理委員會審批同意。主要試劑:紫朱軟膏主藥比例為1∶5∶6∶3∶3∶7(冰片、黃芪、黃芪、龍血竭、紫草、朱砂),輔料比例為0.06∶3.00∶9.00∶9.00∶26.00∶70.00∶24.00∶34.00〔對羥基苯甲酸乙酯、聚乙二醇4 000、聚乙二醇1 500、聚乙二醇、丙三醇(甘油)、水、泊洛沙姆、泊洛沙姆〕。醫(yī)用凡士林紗布(浙江安吉華埠實業(yè)有限公司),水合氯醛(武漢榮燦生物科技有限公司),金黃色葡萄球菌(上海市疾病預(yù)防控制中心提供),實驗開始前將菌液稀釋為110個/ml備用。透明生物膜(香港施樂輝有限公司),哥倫比亞綿羊血瓊脂平板(上海科瑪嘉生物技術(shù)有限公司),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)。主要儀器:剪刀、鑷子、勻漿器、注射器、解剖盤、石蠟切片機(jī)及包埋機(jī)、光學(xué)顯微鏡、生物組織烤片機(jī)及體式顯微鏡等儀器,由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2建模及分組 將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組(凡士林紗布覆蓋)及低、中、高劑量(紫朱軟膏)組各10只。大鼠背部感染創(chuàng)面模型按綜合造模法構(gòu)建。腹腔注入0.3 ml/100 g 10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉,對各組大鼠的背部脊柱右側(cè)行約2 cm×2 cm備皮,備皮前應(yīng)施以常規(guī)消毒、鋪巾,將皮膚逐層剪開,對深筋膜及肌肉層予以保留。止血后,0.2 ml含110個/ml菌液滴于創(chuàng)面,待菌液完全浸潤后,覆蓋并固定醫(yī)用凡士林紗布。48 h后將敷料及凡士林紗布去除,以大鼠創(chuàng)面肉芽組織呈灰白色,出現(xiàn)膿性分泌物,皮膚邊緣紅腫為建模成功,共40只大鼠成功建模。模型組行常規(guī)清洗創(chuàng)面并覆蓋凡士林紗布。紫朱軟膏治療組分別選取高劑量(2.0%)中(1.0%)低(0.5%)無菌敷料包扎(含0.312 5 g基質(zhì)的紗布),每日換藥。制作藥物紗布方法:20 g藥膏制為4張藥物紗布,剪取16片,1片/次。干預(yù)14 d后經(jīng)麻醉予以處死。

1.3標(biāo)本采集與處理 治療后0、4、12 d分別取各組創(chuàng)面模型中心的少量活組織,稱重,之后加99倍的無菌生理鹽水制成組織勻漿,按1∶10稀釋后取稀釋液100 μl接種至綿羊血瓊脂糖平板上,孵育24 h(37 ℃)。對平板上的細(xì)菌菌落數(shù)進(jìn)行計數(shù)。每克組織內(nèi)的細(xì)菌數(shù)(CFU/g)=菌落數(shù)(CFU×稀釋倍數(shù)×1 000)/組織重量(g)。

1.4標(biāo)本采集 分別于治療后0、4、12 d取3組未愈合殘余創(chuàng)面及距創(chuàng)緣0.5 cm以內(nèi)正常皮膚,取材深度不超肌肉層,經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋后切薄片為5 μm厚,烘干后脫蠟,采用梯度酒精、蒸餾水行水化及洗滌,后用HE染色,于光學(xué)顯微鏡下對大鼠的組織病理形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.5炎癥因子檢測 分別于治療后0、4、12 d,取創(chuàng)面組織,裂解液提取蛋白,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定TNF-α、IL-6、IL-1β水平,接著于酶標(biāo)孔內(nèi)加10、40 μl待測樣品稀釋液,搖勻,加酶標(biāo)試劑70 μl,封板并孵育60 min(37 ℃),將孔中液體棄去,洗滌液重復(fù)清洗后加50 μl顯色劑,搖晃均勻,顯色處理15 min(37 ℃),后加終止液50 μl,OD值在450 nm波長處檢測TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.6創(chuàng)面面積計算 對治療后0、4、12 d的創(chuàng)面面積進(jìn)行記錄。取透明生物膜5 cm×5 cm貼于創(chuàng)面的中心處,創(chuàng)面邊緣用記號筆予以描摹,后導(dǎo)入PhotoshopCS6軟件(美國Adobe公司),算出不同時間點各組的創(chuàng)面面積。

1.7創(chuàng)面感染情況檢測 治療后0、4、12 d分別取各組創(chuàng)面模型中心位置的少部分活組織,稱重,稀釋,勻漿,取釋液100 μl于10 cm的綿羊血瓊脂糖平板上接種,37 ℃孵箱行24 h孵育,計數(shù)平板上的細(xì)菌菌落數(shù),方法同1.3。

1.8磷酸化(P)-核因子(NF)-κBp65、Toll樣受體(TLR)-2、TLR-4蛋白表達(dá)水平檢測 組織中蛋白按組織蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行萃取,P-NF-κBp65、TLR-2、TLR-4表達(dá)量通過Western印跡法進(jìn)行檢測,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PDGE)于每孔加80 μg蛋白,結(jié)束電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉PVDF膜,P-NF-κBp65、TLR-2、TLR-4一抗(1∶1 000)于搖床上孵育,共進(jìn)行2 h孵育,完成后用TBST洗膜3次,5 min/次,后將P-NF-κBp65、TLR-2、TLR-4二抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,共孵育1 h,后通過TBST洗膜3次,10 min/次,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影,以β-actin為內(nèi)參,相對條帶灰度光密度值采用ImageJ軟件分析。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件行獨(dú)立樣本t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察 空白組組織中的細(xì)胞排列整齊,未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。模型組組織中細(xì)胞間隙增寬,排列出現(xiàn)不規(guī)則狀態(tài),并且存在顯著的炎性細(xì)胞浸潤。在經(jīng)過治療后,細(xì)胞間所呈現(xiàn)出的較寬間隙逐漸改善,細(xì)胞排列情況逐漸趨于整齊,炎性細(xì)胞浸潤情況也得到減輕,其中,中劑量組>高劑量組>低劑量組。見圖1。

圖1 各組創(chuàng)面組織病理(HE染色,×400)

2.2各組炎癥因子水平比較 如表1所示,與模型組比較,低、中、高劑量組TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯降低(P<0.05);與低、高劑量組相比,中劑量組TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯較低(P<0.05)。

2.3治療后不同時間點創(chuàng)面面積比較 治療后0 d時,各組創(chuàng)面面積無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。治療后4 d時,與模型組相比,低、中、高劑量組創(chuàng)面面積均明顯減小,且中劑量組明顯小于低、高劑量組(P<0.05)。治療后12 d時,與模型組相比,各劑量組創(chuàng)面面積均明顯減小,且中劑量組面積明顯小于低高劑量組(P<0.05)。見表1。

2.4治療不同時間點每克肉芽組織中的細(xì)菌含量比較 治療后0 d時,各組每克肉芽組織中的細(xì)菌含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。治療后4 d時,與模型組相比,低、中、高劑量組細(xì)胞含量均明顯較低,且中劑量組明顯低于低、高劑量組(P<0.05)。治療后12 d時,中劑量組細(xì)菌含量相比其他劑量組均明顯較低(P<0.05)。見表2。

2.5大鼠皮膚組織中P-NF-κBp65、TLR-2、TLR-4蛋白表達(dá)水平 與模型組相比,低、中、高劑量組P-NF-κBp65、TLR-2、TLR-4蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05);與低、高劑量相比,中劑量組P-NF-κBp65、TLR-2、TLR-4蛋白表達(dá)水平明顯較低(P<0.05)。見表2、圖2。

表1 各組炎癥因子水平及治療后不同時間點創(chuàng)面面積比較

表2 各組治療后不同時間點每克肉芽組織中的細(xì)菌含量及皮膚組織中P-NF-κBp65、TLR-2、TLR-4蛋白表達(dá)水平比較

圖2 各組P-NF-κBp65、TLR-2、TLR-4蛋白表達(dá)

3 討 論

金黃色葡萄球菌感染急性感染傷口愈合較不理想,為臨床目前研究的重點及難點〔7,8〕。目前,常規(guī)的治療方法常伴有明顯的不良反應(yīng),其中最為嚴(yán)重的是細(xì)菌抗生素耐藥和創(chuàng)面不愈合〔9〕。紫朱軟膏具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等作用,臨床應(yīng)用效果明確,已逐漸被應(yīng)用于糖尿病足等創(chuàng)面的治療中,但紫朱軟膏在金黃色葡萄球菌感染急性化膿性感染的報道較少〔10,11〕。目前研究表明,紫朱軟膏有清創(chuàng)、抑菌、消炎的效果〔12,13〕。而紫朱軟膏對金黃色葡萄球菌感染創(chuàng)面治療的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

本研究結(jié)果提示,紫朱軟膏能夠有效抑制炎癥反應(yīng)。創(chuàng)面炎癥反應(yīng)與細(xì)菌感染有一定關(guān)聯(lián),而炎性因子水平變化可有效反映局部炎癥〔14〕。本研究說明,紫朱軟膏能夠有效地減少炎性細(xì)胞數(shù)量,降低炎癥反應(yīng)程度,發(fā)揮消炎作用。

本研究說明,紫朱軟膏促進(jìn)創(chuàng)面愈合。創(chuàng)面面積是傷口恢復(fù)程度的直觀指標(biāo)。創(chuàng)面愈合是個復(fù)雜而又有序的病理生理過程,是受細(xì)胞因子和炎癥因子精確調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過程,創(chuàng)面面積的大小是傷口恢復(fù)程度的直觀檢測指標(biāo)〔15,16〕。本文在紫珠軟膏治療創(chuàng)面后4和12 d創(chuàng)面恢復(fù)較好,證實經(jīng)該方法治療后創(chuàng)面內(nèi)出現(xiàn)新生神經(jīng)組織,故可發(fā)現(xiàn)紫朱軟膏治療對神經(jīng)組織生長有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

本研究顯示,紫朱軟膏治療金黃色葡萄球菌感染急性化膿性感染,創(chuàng)面愈合效果更為明顯。紫朱軟膏具有抗菌活性,能夠有效抑制感染創(chuàng)面內(nèi)金黃色葡萄球菌的生長,使用紫朱軟膏干預(yù)能夠有效抑制創(chuàng)面內(nèi)細(xì)菌的生長,且只有達(dá)到一定治療劑量時治療效果才最為明顯,劑量較小或過量都無法達(dá)到較好的治療效果。

金黃色葡萄球菌感染急性化膿性感染所涉及的炎癥通路非常復(fù)雜,其中的經(jīng)典通路就是TLR/NF-κB通路〔17,18〕。TLR2是常見細(xì)菌結(jié)構(gòu)模式的信號受體,同時也是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁成分的信號受體〔19,20〕。TLR4由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞及T、B淋巴細(xì)胞表達(dá),主要存在于淋巴組織中〔21〕。TLR家族可對NF-κB予以激活,以釋放過度的促炎細(xì)胞因子,引起炎癥〔22,23〕。本研究結(jié)果說明,紫朱軟膏可通過減緩TLR/NF-κB炎癥通路而降低炎癥反應(yīng),促使患者皮膚加快愈合。

綜上,紫朱軟膏可顯著減輕金黃色葡萄球菌感染急性化膿性感染的炎癥反應(yīng),加速創(chuàng)面愈合,抑制創(chuàng)面金黃色葡萄球菌的生長。