基于代謝組學分析潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸組織代謝特征及疾病機制

王佳林 馬秀蘭 韓金榮 朱西杰

(寧夏醫科大學 1護理學院,寧夏 銀川 750004;2中醫藥現代化教育部重點實驗室;3中醫學院)

潰瘍性結腸炎(UC)是一種持續或反復發作的腸道慢性炎癥性疾病〔1〕,病變主要累及直腸、結腸黏膜和黏膜下,腹痛、腹瀉和黏液膿血便或血便、里急后重是其最主要癥狀,還伴有食欲不振、貧血、發熱、乏力、體質量下降等全身癥狀及皮膚口腔黏膜、眼、關節及肝膽等腸外表現〔2〕。炎癥性腸病的動態發展常伴隨著機體代謝紊亂,影響能量代謝與氨基酸代謝途徑,導致內源性代謝物水平發生系統性改變而加劇腸道炎癥的發展〔3,4〕。近年來,應用代謝組學技術研究疾病成為熱點。UC 作為人類生活中的常見病,代謝組學有望成為UC早期診斷的重要方法,并能為解釋 UC 的疾病機制提供新的技術手段〔5〕。本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜法(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技術,以疾病代謝產物為切入點,研究UC大鼠模型在疾病發生過程中,機體內源性代謝物變化。以期為推進對 UC 的早期診斷,明確UC疾病病因提供新指標及為臨床治療UC尋找作用靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料 柳氮磺吡啶(Y23A9C59570,源葉生物);2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS;SLCG2384,美國Sigma公司);糞便隱血試劑盒(0730A20,信帆生物技術有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,Merck);甲酸(色譜純,Aladdin)。

1.2實驗動物 SPF級SD大鼠20只,雄性,體質量180～210 g。大鼠及其生長維持飼料均由寧夏醫科大學實驗動物中心提供,飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心屏障。溫度、濕度適宜,分籠飼養。許可證號SCXK(寧)2020-0001,實驗動物倫理審批號:IACUC-NYLAC-2020-022。

1.3實驗儀器 超高效液相色譜(UPLC;ExionLC AD,https://sciex.com.cn/),四級桿飛行時間質譜(TripleTOF 6600,AB SCIEX)。

1.4模型制備及樣本采集 根據隨機分組實驗方法,將大鼠分為空白組6只和模型組14只。根據參考文獻及課題組前期造模經驗〔6,7〕,模型組禁食不禁水36 h,10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉,TNBS-50%乙醇溶液灌腸〔5%TNBS(0.45 ml/100 g)+50%乙醇,兩者2∶1體積混合〕。造模3 d后,觀察一般情況、體質量變化、飲食飲水狀況。利用糞便隱血定性檢測試劑盒檢測糞便隱血情況;隨機選取5只造模大鼠,麻醉殺檢,結腸組織病理學觀察,驗證UC模型制備情況。造模成功后,取病變結腸組織,進行UPLC-Q-TOF-MS/MS代謝組學檢測。

1.5UPLC-Q-TOF-MS/MS代謝組學檢測 ①廣泛靶向檢測采集條件:T3方法色譜采集條件:色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm,2.1 mm×100 mm;流動相:A 相為超純水(0.1 % 甲酸),B 相為乙腈(0.1 %甲酸);流速 0.35 ml/min;柱溫40 ℃;進樣量2 μl。②T3方法質譜采集條件:電噴霧離子源(ESI)溫度 500 ℃,質譜電壓5 500 V,-4 500 V,離子源氣體(GS)Ⅰ 50 psi,GS Ⅱ 50 psi,氣簾氣(CUR) 25 psi,碰撞誘導電離(CAD)參數設置為高。根據優化的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)進行掃描檢測。

1.6統計學處理 數據采集儀器系統主要包括UPLC和串聯質譜(MS/MS;QTRAP?,https://sciex.com/)。利用軟件Analyst1.6.3處理質譜數據。運用R軟件〔R(MetaboAnalystR)〕進行主成分分析(PCA),對數據進行UV標準化,排除非相關因素使分組最大化;采用OPLS-DA模型第一主成分變量權重(VIP)值>1的代謝物,并結合學生t檢驗的P值(<0.05)通過去除不相關的差異來篩選差異變量,尋找差異性表達代謝物。

2 結 果

2.1PCA 在做差異分析前,首先對進行差異比較的分組樣品進行PCA,觀察差異分組之間和組內樣本之間的變異度大小。如圖1A所示,兩組95%可信區間有交集,但樣本呈現分離趨勢;同時在圖1B中可以顯示兩組間明顯的空間差異,PCA結果說明模型組與空白組存在代謝差異。

2.2正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA) 根據OPLS-DA模型分析代謝組數據,繪制各分組得分圖,展示各個分組間的差異。通過去除不相關的差異,空白組、模型組樣品呈現完全分離,篩選出2個差異主成分變量(圖2A)。評價模型的預測參數Ry2=0.957,Q2=0.541,表明該模型擬合度和預測能力都較理想(圖2B)。OPLS-DA的S-plot圖中紅色的點表明這些代謝物的VIP值≥1,綠色的點表示這些代謝物的VIP值<1,結果表明模型組和空白組的主成分與代謝物存在明顯差異(圖2C)。

2.3差異代謝物篩選結果 UC大鼠模型結腸組織中差異性代謝物的篩選結果如表1、2所示,通過 OPLS-DA 分析,根據VIP>1、概率P<0.05 的標準,經 HMDB 數據庫檢索篩選,共鑒定出47種差異性代謝物。對篩選物質進行物質一級分類,上調的31種物質分別歸屬于醇/胺類(7種)、有機酸及其衍生物(6種)、氨基酸及其代謝物、激素及激素相關物質各4種、甘油磷脂類、輔酶和維生素、其代謝物各兩種,雜環化合物、脂肪酰類、核苷酸及其代謝物、碳水化合物各1種;下調的16種物質分別歸屬于有機酸及其衍生物(6種)、甘油磷脂類(4種)、脂肪酰類(2種)、碳水化合物及其代謝物、激素及激素相關物質、鞘脂類、氨基酸及其代謝物各1種。

圖1 PCA

圖2 OPLS-DA

表1 差異代謝物數目統計(上調)

2.4差異代謝物VIP值圖 運用VIP+FC+p-value/FDR三重篩選條件下篩選出模型組與空白組的差異代謝物共129種,這些物質中上調的88種,下調41種(圖3A)。同時,精確在OPLS-DA模型中VIP值最大的前20個代謝物進行注釋及挖掘生物信息。發現上調物質有18種,分別為苯乙酰甘氨酸、N-(鄰甲苯酰)甘氨酸、對甲苯基硫酸、LPE(18∶1/0∶0)、2-〔(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-戊烯氧基〕丁酸、LPC(18∶2/0∶0)、孕烯醇、LPC(0∶0/18∶1)、LPE(0∶0/18∶2)、Thr-Glu-Leu-Lys、LPC(16∶1/0∶0)、1-(13Z,16Z-docosadienoyl)-glycero-3-phosphate、Hecogenin、LPE(0∶0/16∶1)、LPE(18∶2/0∶0)、LPE(14∶0/0∶0)、10-脫氧甲霉素、Glycerophospho-N-Palmitoyl Ethanolamine;下調物質2種,分別為〔(2S)-2-hexadecanoyloxy-3-tetradecanoyloxypropyl〕(6Z,9Z,12Z,15Z)-octadeca-6,9,12,15-tetraenoate、LPC(O-16∶1/0∶0)。見圖3B。

表2 差異代謝物數目統計(下調)

圖3 差異代謝物

3 討 論

氨基酸作為生物體中一類重要的活性分子,是蛋白質分子的基本單位,能夠直接參與生物體的新陳代謝,包括炎癥性腸病(IBD)在內的許多疾病的發生都與氨基酸代謝異常密切相關〔4,8～11〕。由于腸道炎癥會造成氨基酸代謝途徑紊亂,因此氨基酸類代謝物被認為是與結腸炎相關的重要生物標志物〔11〕。本研究中,模型組結腸組織中苯乙酰甘氨酸(氨基酸及其代謝物)、N-(鄰甲苯酰)甘氨酸(氨基酸及其代謝物)出現上調。苯丙氨酸上升可能是與大鼠體內一種能轉換苯丙氨酸生成酪氨酸的酶,即苯丙氨酸-4-羥化酶受到損傷且含量下降有關〔12,13〕,并且已有炎癥性腸病患者代謝組學篩選研究中顯示尿液中升高的甘氨酸和尿液中顯著降低水平的乙酰乙酸能夠區分活動性和緩解期炎癥性腸病〔14,15〕。本研究結果說明,模型組中氨基酸代謝通路受到擾動,可能與苯丙氨酸代謝途徑發生改變相關聯。

研究表明,甘油磷脂水平的變化能反映脂質代謝紊亂,是一個重要的生物學指標,甘油磷脂可以分為不同的類別,包括甘油磷酸甘油、甘油磷脂酸、甘油磷酸肌醇、甘油磷酸絲氨酸、甘油磷酸乙醇胺和心磷脂〔16〕。其基本結構是磷脂酸和磷酸相連的取代基團,根據取代基團的不同可分為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油等,此類成分在失去1條脂肪酸側鏈可轉變為相應的溶血性磷脂,這些磷脂是磷脂酶A2產生游離花生四烯酸和各自溶血磷脂的底物,具有加重炎癥反應的作用〔17〕。三酰甘油作為循環中豐度最高的脂質,與炎癥關系密切,脂質代謝異常與多種疾病的發生有著密切的聯系,如高脂血癥、阿爾茨海默病及癌癥等〔18～20〕。研究顯示,UC 小鼠出現脂質代謝紊亂及相關炎性因子的變化〔21〕。趙麗麗〔22〕研究發現,甘油磷脂PC(16∶0/18∶1)和PE(18∶0/18∶1)的代謝調節貫穿于炎癥的發生和消退過程,可能是炎癥發生、消退過程中的重要脂質標記物。而本研究結果表明,脂質代謝異常也與UC發生具有顯著相關性。另外,在本研究中其他3種物質甲苯基硫酸(有機酸及其衍生物),孕烯醇(醇、胺類),10-脫氧甲霉素(未知)是首次發現的物質,目前尚無相關報道。推測可能是大鼠經TNBS-乙醇復合造模法造模后,內源性代謝物水平發生變化產生代謝的異常物質。

綜上,UC發生展過程中,與體內氨基酸代謝如苯乙酰甘氨酸、N-(鄰甲苯酰)甘氨酸、脂質代謝物質如甘油磷脂類物質、三酰甘油等物質代謝異常有關,疾病代謝機制可能與相關代謝產物激活氨基酸代謝通路及脂質代謝通路相關聯,具體相關聯的通路及激活機制還需本課題組深入研究。