松黃和黃芩及其配伍對肝腎綜合征小鼠肝腎功能的影響

趙士博 吳忠港 張藝馨 陳俠宇 王一杰 黃鎖義

(右江民族醫(yī)學(xué)院 1臨床醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000;2藥學(xué)院;3廣西高校右江流域特色民族藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

松黃即松花粉,松科植物油松、馬尾松等松屬植物的單性花粉,為我國傳統(tǒng)食藥兩用的天然產(chǎn)物〔1,2〕。《神農(nóng)本草經(jīng)》等醫(yī)學(xué)古著中介紹松黃具有益氣除風(fēng)、生肌止血等多種保健預(yù)防功效。因其味甘、性溫、無毒、營養(yǎng)豐富、成分比例均衡等特性,使得松黃在日常生活中食用與藥用價(jià)值突出〔3,4〕。黃芩,唇形科黃芩屬多年生草本植物黃芩的干燥根,味苦性寒、具有清熱燥濕、止血等功效,主要活性成分為黃芩苷等黃酮類物質(zhì),具有抗纖維化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等作用〔5,6〕。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),松黃和黃芩二者都對急性肝腎損傷具有良好的治療作用〔7～10〕,但尚未有松黃和黃芩配伍對肝腎綜合征的相關(guān)研究報(bào)道。本試驗(yàn)旨在探究松黃和黃芩配伍對肝腎綜合征小鼠肝腎功能的改善效果并尋求濃度與療效之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級昆明種小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2)g。由右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供,許可證號:SCXK桂2012-0003。

1.2藥品鑒定 藥材松黃和黃芩由右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心鑒定為松科植物松屬喬木馬尾松的干燥花粉與是唇形科黃芩屬多年生草本植物黃芩的干燥根。

1.3儀器與耗材 JMF-320G多級閃蒸器(河南智晶生物科技股份有限公司);DLSB-5低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);TWCL-T 5000磁力攪拌器(上海標(biāo)和儀器有限公司);TH-UP-10實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)(山東滕海分析儀器有限公司);FA1204B電子天平(上海精科天美儀器有限公司)JSC電子天平秤CN-BH(福州科迪電子技術(shù)有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物研究所);清潔級實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)。

1.4藥物提取 因松黃細(xì)胞壁中的孢粉素耐酸堿耐溫耐壓,對消化系統(tǒng)酶及胃酸等也具有穩(wěn)定的理化特性,故以43%乙醇依照固液比(W∶V)為1∶10、浸泡時(shí)間10 d以提高其破壁率〔11〕。參照文獻(xiàn)〔12〕松黃的乙醇提取方法,95%乙醇濃度按料液比為1∶25,70 ℃提取3次后合并濾液進(jìn)行閃蒸濃縮與冷凍干燥,得到藥物干燥粉末。取干燥黃芩依照體積比1∶8加入95%乙醇,加熱回流提取3次每次1 h,過濾后合并提取液,閃蒸濃縮后干燥〔13〕。松黃和黃芩提取物用純水配成生藥量為1 g/ml的溶液。提取液自然冷卻后置于4 ℃冰箱冷藏備用,實(shí)驗(yàn)開始前分別配制所需濃度。

1.5動物分組與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法使用5%苦味酸標(biāo)記,共分6個(gè)實(shí)驗(yàn)組,即模型對照組、松黃組、黃芩組、松黃與黃芩體積比1∶1配伍低、中、高3個(gè)劑量組。每組10只雌雄各半隨機(jī)分籠飼養(yǎng)。低、中、高3個(gè)配伍組分別對應(yīng)1.5、4.5、7.5 mg/ml濃度藥液。實(shí)驗(yàn)動物逐一測定體質(zhì)量,為保證灌胃劑量的準(zhǔn)確與實(shí)驗(yàn)科學(xué)性與嚴(yán)謹(jǐn)性,實(shí)驗(yàn)期間每3 d測定一次體質(zhì)量。各組均按體質(zhì)量20 ml/kg給予對應(yīng)藥液,即劑量20 g/kg,模型對照組與其余組按等體積給予0.9%生理鹽水。遵從24 h灌胃原則,實(shí)驗(yàn)操作均遵守動物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.6肝腎綜合征模型的制備 參照文獻(xiàn)〔14〕,除模型對照組外,其余小鼠以0.06 ml/10 g經(jīng)皮下注射四氯化碳(CCl4),模型對照組按等劑量注射生理鹽水,每周3次,共6 w。連續(xù)給藥6 w后禁食12 h斷尾取血測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)與尿素(SCr)、肌酐(BUN)含量,結(jié)果顯示其余組血生化指標(biāo)均超過模型對照組的10%,血清ALT、AST、SCr與BUN較模型對照組含量升高表明模型建造成功〔10〕。

1.7試驗(yàn)指標(biāo)測定 末次給藥1 h后,經(jīng)眼球取血收集小鼠血液,經(jīng)低溫離心后采用全自動生化儀測定小鼠血清ALT、AST、SCr及BUN含量。開腹游離出肝臟稱重后計(jì)算肝臟指數(shù):肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。取出小鼠左腎,稱重計(jì)算腎臟指數(shù),公式如下:腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。肝臟和右腎分別制成勻漿,采用試劑盒分別測定肝臟與腎臟SOD含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)及ANOVA法。

2 結(jié) 果

與模型對照組相比,松黃及黃芩組肝、腎功能指標(biāo)改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與松黃、黃芩組比較,配伍低劑量組肝、腎功能指標(biāo)改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與配伍低劑量比較,配伍中、高劑量組肝功能指標(biāo)改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且配伍效果隨生藥濃度升高而提高,二者呈正相關(guān)。在肝臟SOD改善方面配伍組十分顯著(P<0.05)。除腎臟SOD外,配伍中、高劑量組腎功能指標(biāo)與配伍低劑量組差異顯著(均P<0.05)。見表1。

表1 各組肝、腎功能指標(biāo)比較

3 討 論

肝腎綜合征是末期肝病患者常見的嚴(yán)重并發(fā)癥,是因肝功能異常所致的腎衰竭,可以用五行理論中的“子病及母”來解釋,治療以肝腎同治為主〔15～17〕。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝腎綜合征是氧化應(yīng)激/抗氧化防御失衡進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或死亡。自由基是機(jī)體自我調(diào)節(jié)能力受損時(shí)產(chǎn)生的有害基團(tuán)與抗氧化失衡的主要元兇,CCl4在肝微粒體細(xì)胞色素P450作用下生成三氯甲基等幾種能夠引起脂質(zhì)細(xì)胞膜下不飽和脂質(zhì)破壞的自由基,進(jìn)而引起干細(xì)胞脂質(zhì)過氧化性損傷,進(jìn)而對細(xì)胞膜產(chǎn)生不可逆損傷。松黃作為松科植物馬尾松的花粉部分,具有調(diào)節(jié)機(jī)體活動、促進(jìn)新陳代謝和消除自由基、增強(qiáng)免疫力的功效〔18～20〕。黃芩中黃芩素能夠抗脂質(zhì)過氧化,抑制并清除CCl4產(chǎn)生自由基,因此二者配伍治療肝腎綜合征療效優(yōu)于單味藥可能是二者在脂質(zhì)抗氧化方面的協(xié)同作用〔21〕。賈亦臣等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過減少腎臟細(xì)胞凋亡來減輕損傷程度。

朱良等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)松黃中總黃酮類物質(zhì)能夠顯著降低血清ALT與SAT、提高SOD活力。而機(jī)體內(nèi)SOD主要作用為清除自由基,抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生,進(jìn)而防止脂質(zhì)過氧化對組織的損害。王蕾等〔24〕研究表明,松黃對腎臟和肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷具有一定的修復(fù)作用,通過對抗脂質(zhì)過氧化表現(xiàn)出對肝腎綜合征小鼠的肝腎損傷修復(fù)作用。

本研究提示,松黃和黃芩及其配伍具有良好的肝腎修復(fù)效果,并對CCl4所致肝腎綜合征具有十分顯著的損傷抑制作用,二者配伍對肝腎綜合征小鼠的肝腎功能改善具有一定的作用,其療效與配伍濃度呈正相關(guān)。原因可能有:首先,隨配物濃度增加肝腎指數(shù)亦隨之增加,考慮松黃和黃芩配伍可加快肝腎循環(huán)代謝,且隨配比濃度的提高循環(huán)代謝速率加快,從而使高劑量組發(fā)揮出了最明顯的改善效果;第二,考慮松黃和黃芩配伍的肝腎改善效果與二者含有的黃酮、多糖等物質(zhì)在清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化方面存在協(xié)同作用;第三,二者配伍在機(jī)體內(nèi)進(jìn)一步反應(yīng)結(jié)合生成加快肝腎有效血流量及改善肝腎實(shí)質(zhì)性損害的物質(zhì)進(jìn)而改善肝腎功能。