巨噬細胞極化在缺氧性肺動脈高壓中的作用

孫得勝 劉虹延 羅志梅 歐陽瑤 劉先勝

(1遵義醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,貴州 遵義 563003;2華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院呼吸與危重癥醫學科 國家衛健委呼吸疾病重點實驗室;3遵義醫科大學附屬醫院針灸科)

肺動脈高壓可作為獨立的疾病,也可作為一些疾病的病理改變,如慢性阻塞性肺疾病、特發性肺纖維化及動脈粥樣硬化性疾病,嚴重威脅患者生命,其特點是持續的小動脈收縮和重塑〔1～6〕。肺動脈高壓分為5個臨床亞組:動脈性肺動脈高壓、左心疾病所致肺動脈高壓、肺部疾病和(或)低氧所致肺動脈高壓、慢性血栓栓塞性肺動脈高壓和其他肺動脈阻塞性疾病、未明和(或)多因素所致肺動脈高壓。現在廣泛認為低氧驅動的肺血管重構是引起肺動脈高壓的潛在機制。慢性缺氧引起血管重構,繼而引起肺動脈高壓、右心室肥厚,最后引起右心衰竭。血管重構表現為血管壁增厚伴血管肌化和遠端血管稀疏。在缺氧條件下,肺動脈往往會發生收縮,而這種收縮即在通氣血流比值不匹配的情況下出現血液從肺部通氣不良的區域轉移到通氣良好的區域,從而產生更好的氧合,因此更加重了肺功能的降低〔7～11〕。眾多炎癥細胞被證實與肺動脈高壓相關,其中巨噬細胞的富集,特別是M2型巨噬細胞的富集在肺血管重構中起到了關鍵作用〔4,12〕。現今針對肺動脈高壓的發病機制仍處于探究階段,所以臨床上針對肺動脈高壓的治療大多旨在改善肺血管重塑,長遠療效欠佳〔13〕。本研究在缺氧干預下構建肺動脈高壓模型,并觀察這一過程中巨噬細胞極化狀態的改變及其與缺氧性肺動脈高壓的關系,探究肺動脈高壓的發病機制,為臨床治療肺動脈高壓提供新的依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料 本研究于2018年1～5月在華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心進行。20只健康清潔級SD大鼠,體質量約200 g,購于湖北省實驗動物中心〔SCXK(鄂)2015-0018〕實驗動物缺氧裝置(本課題組自主研發,專利號 ZL201820232330.7),Olympus 光學顯微鏡(奧林巴斯有限公司),通用型免疫組化試劑盒(上海基因科技公司),小鼠抗大鼠CD68、Arg1、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2造模方法 采用隨機數字表法將大鼠分為對照組和模型組,各10只,模型組在實驗動物缺氧裝置中給予常壓缺氧(10%O2)處理,每天缺氧處理8 h,同時給予充足飲食,持續4 w。對照組不予以低氧刺激,在常氧條件下喂養。若模型組右心室收縮壓高于對照組,且差異有統計學意義表示建模成功。

1.3血流動力學檢測 在生理多導儀監視下,將大鼠頸靜脈分離出來,結扎遠心端,將內含導絲的測量管插入并緩慢推進,分別經過鎖骨下靜脈,右心房、右心室,當有血液回流時,退出導絲,連接探測儀,觀察波形并調整導管方向,待波形典型并穩定后記錄,最后以 PowerLab 軟件分析右心室收縮壓。

1.4巨噬細胞檢測 免疫組織化學方法觀察肺組織中巨噬細胞的標志物CD68和M2型巨噬細胞標志物Arg1、M1型巨噬細胞標志物iNOS表達水平及分布特點。

1.5統計學方法 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1血流動力學 模型組右心室收縮壓〔(33.33±6.11)mmHg〕顯著高于對照組〔(21.33±3.06)mmHg;t=3.043,P<0.05〕,參照國際共識,肺動脈高壓模型建立成功。見圖1。

2.2巨噬細胞表達 如圖2所示,模型組肺組織中巨噬細胞標志物CD68表達強于對照組,表明缺氧性肺動脈高壓肺組織中有大量巨噬細胞浸潤。

2.3M1及M2型巨噬細胞表達 如圖3所示,以免疫組織化學法對肺組織中M1及M2型巨噬細胞標志物iNOS及Arg1進行染色,發現模型組肺組織中Arg1表達水平強于對照組,iNOS表達水平弱于對照組。

圖1 兩組右心室收縮壓波形

圖2 兩組巨噬細胞標志物CD68表達(免疫組化染色,×400)

圖3 兩組iNOS及Arg1表達(免疫組化染色,×400)

3 討 論

本研究結果證實,肺動脈高壓模型中巨噬細胞明顯富集,并且巨噬細胞朝著M2型的方向極化在缺氧肺動脈高壓中發揮著重要作用。因為對血管重構發生機制了解尚不完全,所以臨床上針對肺動脈高壓的治療,主要是以改善癥狀的藥物如肺血管擴張劑及針對肺動脈高壓形成通路的靶向藥物為主,前者包括鈣通道阻滯劑、前列腺素、內皮素受體阻滯劑及磷酸二酯酶-5抑制劑,后者主要針對前列環素通道和內皮素受體途徑治療〔14〕。除了藥物治療之外,慢性血栓栓塞性肺動脈高壓還可以用外科手段,如肺動脈內膜切除術及球囊肺血管成形術治療〔15〕。上述藥物或手術處理可以緩解肺動脈高壓的臨床癥狀,且在一定程度上提高肺動脈高壓患者的生存率。并且在發現了免疫細胞及炎癥細胞對肺動脈高壓發病中起重要作用后,針對免疫細胞、炎癥細胞及肺部平滑肌細胞之間的相關關系有了進一步研究,很多針對這些細胞的藥物被運用到臨床上,并且取得了極好的療效。但是肺動脈高壓的發病機制未能夠有一個全面的了解,仍然無法逆轉較大范圍的肺小動脈重構,所以臨床療效有待提高,現在仍需對肺動脈高壓的發病機制,特別是針對肺動脈高壓發病中免疫細胞及炎癥細胞的作用做進一步探索研究。

在肺動脈高壓的發病過程中,炎癥和肺內皮功能障礙都與肺動脈高壓的發生和發展相互交織。包括白細胞聚集和抑制在內,免疫過程是炎癥反應和相關疾病的中心步驟,在組織病理學上,肺動脈高壓患者和實驗肺動脈高壓動物模型的肺血管病變組織的特征是不同程度的血管周圍炎性細胞浸潤,包括T和B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞和肥大細胞,很多研究者針對巨噬細胞對于肺動脈高壓血管重構的作用進行研究〔16〕。有研究發現,單核細胞和巨噬細胞在血管周圍或外膜空間的積聚是人類和實驗肺動脈高壓動物模型中發生血管重構的主要特征標志之一〔17〕。Pullamsetti等〔18〕在人肺癌組織及小鼠肺癌模型組織中均發現有肺動脈高壓的典型病理特征,即肺小動脈血管重構;腫瘤細胞和炎癥細胞相互作用及多種細胞因子,如白細胞介素(IL)-8、趨化因子配體2等共同促進了肺血管平滑肌細胞的增殖和遷移;并且免疫及炎癥細胞的缺陷會阻止肺動脈高壓的形成。而巨噬細胞的兩大不同極化類型,即M1及M2型,分別有著不同的作用。M1型在活化后能產生多種促炎癥細胞因子,抵抗病原入侵。M2型分泌抗炎癥細胞因子,并在組織修復與重建、血管重塑、脂類代謝、過敏反應和腫瘤的形成過程中發揮作用。Zawia等〔19〕通過檢測缺氧肺動脈高壓模型中F4/80+巨噬細胞(巨噬細胞總體數量)、iNOS+巨噬細胞(M1型巨噬細胞)、CD206+巨噬細胞(M2型巨噬細胞)發現在缺氧誘導的肺動脈高壓模型中,巨噬細胞總體數量顯著增加,M1與M2型巨噬細胞穩態被打破,呈現為M2型巨噬細胞比例顯著升高。Vergadi等〔20〕檢測了缺氧誘導型肺動脈支氣管肺泡灌洗液中的M2型巨噬細胞標記物Arg1,Fizz1,Ym1及M1型巨噬細胞標記物iNOS、腫瘤壞死因子(TNF)-α、 IL-12β同樣呈現出缺氧條件下巨噬細胞增多且向M2型極化,除此之外,在體外缺氧條件下巨噬細胞原代培養也表現向M2型極化的趨勢。Park等〔7〕利用巨噬細胞甘露糖受體的示蹤劑68Ga-NOTA-MSAPET成像顯示肺動脈高壓患者及動物模型中巨噬細胞,發現隨著肺動脈高壓的進展,巨噬細胞在肺中浸潤的程度也不斷上升。同樣,為了證實巨噬細胞參與肺動脈高壓的形成及消除巨噬細胞有利于改善肺動脈高壓模型中的血管重構,在研究中往往需要使用特定的方法清除巨噬細胞。除了使用含氯膦酸脂質體來耗盡單核細胞/巨噬細胞譜系的細胞這一方法外,Zawia等〔19〕利用CD68+MacLow小鼠巨噬細胞耗竭的低巨噬細胞轉基因小鼠,利用多西環素處理后證實,巨噬細胞減少有利于改善肺動脈高壓中的血管重構。在特發性肺動脈高壓的研究中發現,肺動脈高壓患者肺中M2巨噬細胞標記物占優勢,而健康個體肺中M1巨噬細胞亞型占優勢,巨噬細胞活化為M2表型主要觸發巨噬細胞和肺動脈平滑肌細胞,因此可能是肺血管重塑過程中的早期關鍵事件〔21〕。在肺動脈高壓發生的病理過程中,肺小血管重構是不可或缺的一步。本研究證實在缺氧所致肺動脈高壓中,巨噬細胞向著M2型的極化且有統計學意義,這也許是因為在機體內參與血管重構的M2型巨噬細胞推動了缺氧肺動脈高壓的發生進程。

綜上,缺氧性肺動脈高壓的發生發展中,巨噬細胞的募集和朝著M2這一亞型的極化可能在這一過程中發揮了作用。肺動脈高壓的發生機制尚未完全闡明,但M2巨噬細胞在其中發揮的關鍵作用可能作為臨床上治療缺氧性肺動脈高壓的依據,抑制巨噬細胞的募集或抑制巨噬細胞向M2亞型的極化可能作為臨床上針對肺動脈高壓的新的治療方法。本研究將探討巨噬細胞影響缺氧性肺動脈高壓的上游因子,繼續探索肺動脈高壓的發生機制,為臨床治療提供依據。