橘荔散結丸醇提物化學成分的UHPLC-QE-MS分析及其抗子宮肌瘤細胞的藥效機制研究

謝卓庭， 王乃平， 程曉榆， 李坤寅

（1.廣州中醫藥大學東莞醫院，廣東東莞 523000；2.廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東廣州 510375）

子宮平滑肌瘤（簡稱子宮肌瘤，uterine fibroids）是生殖系統最常見的婦科腫瘤，20%~40%性成熟女性患有此病，近些年子宮肌瘤女性妊娠患者比例增多[1-2]。目前，西醫治療子宮肌瘤有激素藥物，非激素藥物如止血劑、非甾體抗炎藥，手術及放射療法等手段[3]，但備孕子宮肌瘤患者在選擇這些治療方式時有所顧慮，往往偏向尋求能夠保障生育的中醫治療。子宮肌瘤歸屬于中醫學“癥瘕”范疇，氣滯血瘀證是最常見的臨床證型，然而臨床觀察發現，備孕子宮肌瘤女性常需固復正氣。中藥復方制劑橘荔散結丸具有行氣活血、消癥散結的功效，治療子宮肌瘤具有良好的臨床療效，尚可同時固復患者正氣[4]。

本研究團隊的李坤寅教授指導并帶領團隊圍繞橘荔散結丸治療子宮肌瘤展開了一系列研究。團隊前期成功構建了人子宮肌瘤細胞模型，并驗證了橘荔散結丸醇提物可下調子宮肌瘤細胞表皮生長因子受體（EGFR）表達[5]，降低子宮肌瘤細胞增殖能力，從而發揮對子宮肌瘤的抑制作用；團隊還成功構建了大鼠荷子宮肌瘤組織移植瘤動物模型，發現橘荔散結丸可下調微小RNA-21（miR-21）抑制Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路進而抑制子宮肌瘤細胞增殖[6]。但其作用機制仍不完全清楚。研究[7-8]表明，子宮肌瘤細胞增殖與氧化應激關系密切，Wnt/糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）/β-catenin 信號通路是氧化應激的經典通路。因此，本研究在對橘荔散結丸醇提物化學成分進行超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱串聯質譜（UHPLC-QE-MS）分析[9]的基礎上，從Wnt/GSK-3β/β-catenin 信號通路角度在細胞水平探討橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞增殖的抑制作用及機制，以期為橘荔散結丸的臨床應用提供更多的科學依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1 藥物及制備橘荔散結丸（由橘核、荔枝核、小茴香、烏藥、川楝子、益母草、海藻、莪術、何首烏、續斷、崗稔根、黨參、生牡蠣、風粟殼組成，由廣州至信藥業有限公司生產，批號：190901、191201、200601）。對照品：橘荔散結片（廣州中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，批號：20200501、20200701、20200901）。米非司酮片（北京紫竹藥業有限公司生產，批號：RU486，25 mg/片）。

橘荔散結丸醇提物制備：碎成粗粉按1∶8料液比加入70%酒精，回流提取2次，每次1 h，收集醇液，再應用旋轉蒸發儀濃縮至無醇味，冷凍干燥成凍干粉。

所有藥物使用時均用DMEM 培養液稀釋，0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，配制成不同濃度的含藥液，pH值為中性。-20 ℃保存備用。

1.2 儀器1290 UPHLC儀（Agilent公司）；Q Exactive Focus 高分辨質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters公司）；PM-20全自動顯微照相倒置式系統顯微鏡（日本Olympus 公司）；ALTRA EPICS 型流式細胞儀（美國Beckman Comlter 公司）；蛋白電泳裝置系統（美國Bio-Rad公司）；7300熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.3 試劑DMEM、胎牛血清、青-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶、PBS 緩沖液（美國Gibco 公司）；Ⅰ型膠原酶（德國BioFroxx公司）；細胞計數試劑盒8（CCK-8，Biosharp 公司）；Wnt 5b、GSK-3β、β-catenin、EGFR和基質金屬蛋白酶2（MMP2）抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）（Ser9）抗體（CST 公司）。甲醇（CAS：67-56-1）、乙腈（CAS：75-05-8）、甲酸（CAS：64-18-6）：LC-MS 級（CNW Technologies 公司）；L-2-氯苯丙氨酸（CAS：103616-89-3，上海恒柏生物科技有限公司生產，純度≥98%）。

1.4 橘荔散結丸醇提物活性成分鑒定橘荔散結丸醇提物凍干粉及橘荔散結片各3批樣本，每份樣品1 g。活性成分鑒定的色譜條件[10]：Waters UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）。進樣量5 μL，流速為0.4 mL/min。流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B），多步線性洗脫梯度程序：0~3.5 min，5%~15%B；3.5~6 min，15%~30%B；6~12 min，30%~70%B；12~18 min，70%~100%B；18~25 min，100%B；25~26 min，100% ~ 5%B；26 ~ 30 min，5%B。活性成分鑒定的質譜條件：每個采集周期中，質量范圍在100~1 500 之間，采用加熱電噴霧離子源，正、負離子模式檢測。具體詳細參數設置如下：毛細管溫度：400 ℃；鞘氣體流速：45 Arb；輔助氣體流速：15 Arb；MS 全分辨率：70 000；MS/MS 分辨率：17 500；碰撞能量：15/30/45（NCE 模式）；噴射電壓：4.0 kV（正極）或-3.6 kV（負極）。方法學驗證符合標準。

1.5 細胞實驗

1.5.1 細胞來源及原代培養 培養人原代子宮肌瘤細胞。病例來源：2021 年1 月至2022 年06 月于廣州中醫藥大學第三附屬醫院婦科住院需行子宮全切術或子宮肌瘤剔除術的子宮肌瘤患者共20例，病理檢査確診為子宮肌瘤組織。本研究方案已獲得廣州中醫藥大學第三附屬醫院倫理委員會許可（倫理號：【2020】016）。

手術室用無菌剪獲取病灶組織約2 cm3，立即置于冰浴磷酸鹽緩沖液（PBS）中，送廣州中醫藥大學嶺南婦科實驗室行原代培養。細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，當生長融合達80%，胰蛋白酶消化、離心細胞懸液，按1∶2 分裝接種傳代，傳至第3代時采用免疫組織化學法鑒定原代人子宮肌瘤細胞。

1.5.2 CCK-8法測定細胞增殖抑制率 將原代人子宮肌瘤細胞（1×106個/mL）接種到96 孔板，24 h后吸出培養基，加入橘荔散結丸醇提物不同濃度（0、0.1、1、2、10 mg/mL）含藥液，每孔100 μL，每組設4個復孔。12、24、48 h后，再次吸出各孔培養基。避光條件下各孔加入含CCK-8 培養基10 μL 孵育2 h。待顏色變為橙色，酶標儀檢測吸光度（OD）值，波長設為450 nm。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組的OD/空白對照組的OD）×100%。

1.5.3 分組與干預方法 將人子宮肌瘤細胞接種于6 孔板（1 × 105mL/孔），每孔2 mL。分為5 組：空白對照組，加入不含藥液DMEM 培養液；二甲基亞砜（DMSO）組，加入含0.05%DMSO 培養液；橘荔散結丸高、低濃度組，依據“1.5.2”項實驗結果，加入含橘荔散結丸醇提物2、1 mg/mL的DMEM培養液；米非司酮組，加入含米非司酮1×10-5g/L的DMEM培養液。置于37 ℃培養箱繼續培養48 h。以下流式細胞術、Western Blot、qPCR法按此分組給藥。

1.5.4 流式細胞術檢測細胞周期 胰酶消化收集按“1.5.3”項干預后的細胞，去上清，PBS洗1次，加入預冷70%乙醇，4 ℃固定過夜。將固定細胞離心去70%乙醇固定液上清，加入1 mL PBS 液室溫重懸細胞5 min 后再次離心去上清。避光條件下，每管加入500 mL PI 染色液（每mL 染色緩沖液加入20 μL RNase A和25 μL PI儲液），室溫染色30 min。流式細胞儀上機檢測，分析實驗結果采用Modifit軟件。實驗重復3次。

1.5.5 Western Blot 法檢測子宮肌瘤細胞Wnt 5b、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、EGFR 和MMP2的蛋白表達水平 取出按“1.5.3”項干預后的細胞，裂解、離心提取蛋白。對蛋白樣品電量、變性處理，上樣，電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉。以β-actin為內參，先后加入一抗（稀釋度1∶2 000）和二抗（稀釋度1∶5 000）孵育。顯影。采用ImageJ軟件系統分析數據，目標蛋白表達水平以目標蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值比值表示。

1.5.6 定量聚合酶鏈反應（qPCR）法檢測子宮肌瘤細胞Wnt 5b、GSK-3β、β-catenin、EGFR和MMP2 mRNA表達水平 從GenBank數據庫檢索相應基因序列，設計引物見表1。提取RNA，取1 μL RNA樣品，分光光度計測定OD260/280，計算RNA 濃度和質量。逆轉錄條件：42 ℃，30 min；95 ℃，5 min。PCR擴增：Stage 1預變性：95 ℃、3 min。Stage 2循環反應：95 ℃、10 s；55 ℃、30 s；72 ℃、1 min，共循環35 次。Stage 3：72 ℃、10 min。ΔCT=CT（目的基因）-CT（內參基因）；ΔΔCT=ΔCT（處理組）-ΔCT（對照組）。采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。GAPDH為內參。

1.5.7 統計方法 采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析，實驗結果為計量資料滿足正態分布，以均數±標準差（±s）表示。多組樣本數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 橘荔散結丸醇提物主要化學成分鑒定按照UHPLC-QE-MS技術條件檢測，得到橘荔散結丸醇提物正離子模式總離子流TIC 圖（見圖1）。通過自建數據庫比對與查閱參考文獻，發現正離子模式能檢出更多化合物，橘荔散結丸醇提物和橘荔散結片共分離出663 個化合物（包括195 個萜類，105 個黃酮類，79 個生物堿類，69 個苯丙素類，43 個酚類及其他類型等）。相對含量占總化合物85%的化學成分被認為是橘荔散結丸醇提物的主要化學成分，共有155個（包括凍干粉91個，中成藥64個）。橘荔散結丸醇提物凍干粉與中成藥橘荔散結片的主要化學成分共有22個（包括水蘇堿、胍基丁酸、地芰普內酯、原莪術烯醇、甜橙黃酮、花椒內酯等）。結果表明，橘荔散結丸化學成分眾多，藥物組成復雜。

圖1 橘荔散結丸正離子模式總離子流TIC圖Figure 1 TIC diagram of total ion flow in positive ion mode of Juli Sanjie Pills

2.2 橘荔散結丸醇提物指紋圖譜的建立將橘荔散結丸醇提物及對照品橘荔散結片檢測所得化學成分質譜原始數值，在正離子條件下進行排序，經過多點較正、譜峰匹配，得到橘荔散結丸醇提物（S1~S3）及橘荔散結片（S4~S6）共6批樣品指紋圖譜疊圖，見圖2。結果顯示，指紋圖譜重疊較好，表明橘荔散結丸醇提物質量穩定，而差異主要由于劑型及制備工藝所致。

圖2 橘荔散結丸醇提物正離子模式指紋圖譜Figure 2 Positive ionisation pattern fingerprints of the alcoholic extract of Juli Sanjie Pills

2.3 橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞增殖的影響圖3 結果顯示：橘荔散結丸醇提物0、0.1、1、2、10 mg/mL 處理12、24、48 h 后，子宮肌瘤細胞抑制率顯著增加，與0 mg/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。1 mg/mL 組細胞抑制率在12 h 時與2 mg/mL 組比較，差異無統計學意義（P= 0.092＞0.05）；2 mg/mL 組細胞抑制率在24、48 h 時與10 mg/mL 組比較，差異無統計學意義（P=0.176＞0.05）。表明橘荔散結丸醇提物可顯著抑制子宮肌瘤細胞增殖，且呈一定時間濃度依賴性。橘荔散結丸醇提物濃度為1、2 mg/mL，處理48 h 時能較好地抑制子宮肌瘤細胞增殖，故將這2個劑量設為高、低濃度組。

圖3 橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞增殖的影響Figure 3 Effect of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on the proliferation of uterine fibroid cells

2.4 橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞周期的影響圖4、圖5 結果顯示：DMSO 組G0/G1 期和G2/M 期的細胞數與空白對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；橘荔散結丸醇提物高、低濃度組G0/G1 期細胞數大于空白對照組，而G2/M 期細胞數小于空白對照組（均P＜0.05）。組間比較，橘荔散結丸醇提物高、低濃度組G0/G1 期和G2/M期的細胞數有顯著性差異（P＜0.05），而橘荔散結丸醇提物高濃度組G0/G1 期和G2/M 期的細胞數與米非司酮組無顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞周期的影響Figure 4 Effect of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on the cell cycle of uterine fibroids

圖5 流式細胞術檢測子宮肌瘤細胞周期結果Figure 5 Flow cytometry for cell cycle results in uterine fibroids

2.5 橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞Wnt/GSK-3β/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達的影響表2、圖6結果顯示：各組子宮肌瘤細胞GSK-3β蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，橘荔散結丸醇提物高、低濃度組及米非司酮組子宮肌瘤細胞Wnt 5b、p-GSK-3β、β-catenin、EGFR和MMP2的蛋白相對表達量均降低（P＜0.05）；橘荔散結丸醇提物高濃度組Wnt 5b、p-GSK-3β、β-catenin、EGFR 和MMP2的蛋白相對表達量均低于橘荔散結丸醇提物低濃度組，差異有統計學意義（P＜0.05）；與米非司酮組比較，橘荔散結丸醇提物高濃度組肌瘤細胞Wnt 5b 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），余蛋白表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。

圖6 Wnt/GSK-3β/β-catenin信號通路關鍵蛋白的Western Blot條帶Figure 6 Western Blot strips of key proteins of the Wnt/GSK-3β/β-catenin signalling pathway

表2 橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞Wnt/GSK-3β/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達水平的影響Table 2 Effects of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on the expression levels of key proteins of Wnt/GSK-3β/β-catenin signalling pathway in uterine leiomyoma cells（±s）

表2 橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞Wnt/GSK-3β/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達水平的影響Table 2 Effects of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on the expression levels of key proteins of Wnt/GSK-3β/β-catenin signalling pathway in uterine leiomyoma cells（±s）

注：①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.01，與橘荔散結丸醇提物低濃度組比較；③P＜0.05，與米非司酮組比較

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2.6 橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞Wnt/GSK-3β/β-catenin 信號通路關鍵蛋白mRNA 表達的影響表3結果顯示：與空白對照組比較，橘荔散結丸醇提物高、低濃度組及米非司酮組子宮肌瘤細胞Wnt 5b、GSK-3β、β-catenin、EGFR、MMP2 的mRNA 相對表達量降低（P＜0.05）；橘荔散結丸醇提物高濃度組Wnt 5b、GSK-3β、β-catenin、EGFR和MMP2的mRNA相對表達量均低于橘荔散結丸醇提物低濃度組，差異有統計學意義（P＜0.05）；橘荔散結丸醇提物高濃度組上述各指標與米非司酮組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞Wnt/GSK-3β/β-catenin信號通路關鍵蛋白mRNA表達水平的影響Table 3 Effects of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on mRNA expression levels of key proteins of Wnt/GSK-3β/β-catenin signalling pathway in uterine fibroid cells（±s）

表3 橘荔散結丸醇提物對子宮肌瘤細胞Wnt/GSK-3β/β-catenin信號通路關鍵蛋白mRNA表達水平的影響Table 3 Effects of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on mRNA expression levels of key proteins of Wnt/GSK-3β/β-catenin signalling pathway in uterine fibroid cells（±s）

注：①P＜0.05，與空白對照組比較；②P＜0.01，與橘荔散結丸醇提物低濃度組比較

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3 討論

子宮肌瘤常見經量增多或延長、下腹包塊、壓迫疼痛、腰腹墜脹等癥狀，根據與子宮肌壁關系分為肌壁間肌瘤（肌瘤位于子宮肌壁間）、漿膜下肌瘤（肌瘤向子宮漿膜面生長）和黏膜下肌瘤（肌瘤向宮腔方向生長）[11]。黏膜下肌瘤對妊娠影響較直接，它影響胚胎種植與著床，增加流產與胎盤早剝風險[12]。肌壁間肌瘤與漿膜下肌瘤若選擇手術方式剔除，增加瘢痕妊娠和剖宮產大出血風險[13]。因而具有生育要求的女性大多選擇中醫藥治療。橘荔散結丸全方系由全國名中醫羅元愷教授根據《普濟方》荔核散及《濟生方》橘核丸加減化裁而成，以行氣活血、消癥散結攻伐為主，補益正氣為輔，含行氣散結類藥橘核、荔枝核、烏藥、小茴香、川楝子，活血消癥類藥莪術、牛膝、益母草，軟堅消腫類藥海藻、醋鱉甲、風栗殼，收斂補益類藥牡蠣、崗稔根、黨參、續斷、何首烏。

UHPLC-QE-MS技術具有色譜高分離能力和質譜高鑒別能力，廣泛用于藥物分析檢測[9]。本研究應用UHPLC-QE-MS 技術對橘荔散結丸醇提物化學成分進行鑒定，建立總離子流圖和指紋圖譜，分離出其主要化合物包括萜類（如地芰普內酯及川續斷皂苷Ⅵ）、黃酮類（如槲皮素及橙皮苷）、生物堿類（如水蘇堿及甜菜堿）、苯丙素類（如花椒內酯）等。現代藥理學研究表明：橘荔散結丸中荔枝核主要成分槲皮素通過減少氧化應激下調活性氧介導下游信號通路、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統等方式，發揮抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[14]；橘核主要成分橙皮苷能抑制GSK-3β信號級聯引起腫瘤細胞凋亡[15]；益母草成分水蘇堿對小鼠子宮平滑肌有較強的興奮作用，能促進子宮收縮復舊[16]，成分甜菜堿可通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路調節改善血脂代謝和免疫應答，提高睪丸抗氧化能力[17]；續斷主要成分川續斷皂苷Ⅵ可激活原代蛻膜細胞和HELA細胞孕激素受體（PR）基因啟動子，有助于降低子宮收縮維持受孕[18]。

本研究通過細胞實驗證實，橘荔散結丸醇提物能夠抑制子宮肌瘤細胞增殖。細胞增殖是細胞分裂和細胞損失平衡的動態過程，體細胞通過有絲分裂過程進行增殖，由細胞周期進程所決定[19]。當體細胞增殖時，細胞周期進程受到正或負信號調節。細胞周期進展為G1、S、G2、M 四個階段，這個過程有賴于細胞周期蛋白依賴激酶和細胞周期蛋白調節[20]。本研究結果表明，橘荔散結丸醇提物可有效阻滯肌瘤細胞從G0/G1 期進展到G2/M期，抑制肌瘤細胞增殖，從而控制肌瘤生長。

細胞周期、增殖、凋亡與氧化應激密切相關，而子宮肌瘤的發生與氧化應激關系密切。Wnt/GSK-3β/β-catenin信號通路是一種具有調節多種細胞功能包括細胞增殖、凋亡、遷移、發育過程中的細胞極性及干細胞維持，是氧化應激的經典通路[21]。研究發現，平滑肌瘤細胞中Wnt 5b 和sFRP1轉錄水平均顯著升高[22]；而Wnt 配體可以激活EGFR 信號通路，EGFR 又可通過PI3K/Akt 通路激活β-catenin，且EGFR 已被證明與β-catenin 形成復合物并增加細胞的侵襲和轉移[23]。基質金屬蛋白酶2（MMP2）是降解細胞外基質蛋白，主要是Ⅳ型膠原的蛋白水解酶。在平滑肌瘤和肌層中，Ⅳ型膠原均局限于平滑肌細胞的細胞外基質包埋束，子宮平滑肌瘤的發病機制和生長與MMP2 有關[24]。本研究結果表明，橘荔散結丸醇提物能夠下調子宮肌瘤細胞Wnt/GSK-3β/β-catenin 信號通路中Wnt 5b、p-GSK-3β、β-catenin、EGFR和MMP2蛋白和mRNA 的表達，說明橘荔散結丸醇提物可通過抑制Wnt/GSK-3β/β-catenin 信號通路傳導，抑制氧化應激反應，從而達到抑制肌瘤生長、縮小子宮肌瘤的作用。

綜上所述，本研究應用UHPLC-QE-MS 技術分離的橘荔散結丸醇提物化學成分眾多，主要成分具有氧化應激調節作用，并建立了橘荔散結丸醇提物指紋圖譜，藥物質量評價穩定。通過細胞實驗論證顯示，橘荔散結丸醇提物可有效抑制子宮肌瘤細胞增殖，其分子機制與抑制Wnt/GSK-3β/β-catenin 信號通路關鍵蛋白表達，進而干預子宮肌瘤細胞微環境氧化應激反應有關。