黃芪甲苷調控JAK2/STAT3/CXCL12信號通路抑制炎癥細胞浸潤改善小鼠胃炎的機制研究

江曉濤， 楊澤虹， 王姝燁， 安金琪， 黃遠程， 鄒雨杉， 文藝， 李培武

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

胃炎患者的胃黏膜中存在著多種炎癥細胞的浸潤[1]。過量浸潤的炎癥細胞通過分泌多種炎癥介質誘發胃黏膜炎癥反應[2-3]，從而引起胃黏膜的損傷[4-5]，導致癥狀反復。因此，抑制炎癥細胞浸潤是修復胃黏膜損傷、減少癥狀反復的關鍵。微環境中脂多糖（LPS）持續存在是導致炎癥持續存在的主要原因，其可活化Janus 激酶2/信號傳導和轉錄激活因子3（JAK2/STAT3）蛋白、轉錄因子κB（NF-κB）等經典炎癥信號通路合成和釋放多種細胞因子誘導免疫細胞浸潤至免疫微環境[6]。JAK2/STAT3 通路作為重要的信號傳導途徑，廣泛參與機體免疫調節、炎癥反應、凋亡等過程[7-8]。STAT3 的磷酸化水平常被用于評估JAK2/STAT3信號通路的活化程度，磷酸化的STAT3 通常入核促進下游細胞因子的轉錄表達[9]，進而誘導炎癥細胞浸潤。CXCL12作為關鍵的趨化因子，通常由促炎性刺激劑[LPS或腫瘤壞死因子（TNF）]激活STAT3、NF-κB、Sp1、AP1、PARP1等轉錄因子轉錄而來[10]，其通過與免疫細胞膜上的受體趨化因子受體（CXCR）4/CXCR7相互作用誘導免疫細胞遷移至免疫微環境發揮功能[11]。因此，抑制CXCL12 上游轉錄因子激活是減少炎癥細胞向微環境浸潤的關鍵靶點。

多項臨床研究[12-14]已經證實，黃芪及其相關中藥方劑對于慢性胃炎有確切的療效。黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ）作為黃芪[為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根]的主要藥理成分，已被報道具有一定的抑炎作用。本研究采用黃芪甲苷對LPS誘導的人胃黏膜上皮細胞GES-1 炎癥模型和小鼠胃炎模型進行干預，通過檢測JAK2/STAT3/CXCL12通路上相關分子的表達，探討黃芪甲苷改善胃黏膜炎癥的作用機理，以期為臨床應用黃芪甲苷及黃芪治療胃炎提供循證依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞人胃黏膜上皮細胞株GES-1，購自中國科學院上海細胞庫。

1. 2 動物SPF 級C57BL/6 小鼠24 只，5 周齡，體質量16~20 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（粵）2022-0002。動物飼養于廣州中醫藥大學SPF級實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（粵）2018-0001。飼養環境溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，5只/籠，自由飲水與攝食。動物實驗經廣州中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，批準號：20230315013。

1. 3 藥物、試劑與儀器黃芪甲苷（分子式C41H68O14，分子量784.97，純度≥98%，生產廠家：上海源葉生物科技公司，批號：C14J9Q65866）；p-STAT3抑制劑BP-1-102（MCE公司，批號：HY-100493）。幽門螺桿菌脂多糖（Hp-LPS）（卡邁舒公司，批號：22E031201）；RPMI-1640 細胞培養液、胎牛血清（FBS）（美國Gibco 公司）；細胞計數試劑盒8（CCK-8）（美國MCE 公司）；RNA 提取試劑盒、RNA 反轉錄試劑盒（EZB 公司）；兔源磷酸化STAT3（p-STAT3）抗體、兔源CXCL12 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG 二抗（Abmart 公司）；人源趨化因子CXCL12 酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、鼠源趨化因子CXCL12 ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業股份有限公司）。Nanodrop 核酸定量儀（美國Thermo 公司）；熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏公司）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；多用途酶標儀（美國Biotek 公司）；化學發光凝膠成像設備（美國ProteinSimple 公司）；病理切片機（上海徠卡設備股份有限公司）。

1.4 體外實驗

1.4.1 細胞培養 GES-1細胞用加入10%胎牛血清（FBS）、1% 青霉素的RPMI-1640 培養液在37 ℃和5%CO2條件下進行體外培養。定期更換培養液，直到超過80%進行傳代培養。

1.4.2 LPS誘導GES-1炎癥模型最佳濃度篩選將GES-1 細胞分成不同濃度（1、2.5、5、10、20 μg·mL-1）LPS 模型組及空白對照組（等體積PBS）。干預24 h 后，采用定量聚合酶鏈反應（qPCR）法檢測不同濃度LPS 誘導的GSE-1 細胞CXCL12 mRNA 表達水平，ELISA 法檢測上清液CXCL12因子含量，以此確定LPS的最佳濃度。

1.4.3 CCK-8法測定黃芪甲苷干預后GES-1細胞存活率 GES-1 細胞生長至對數生長期時，接種于96 孔板中，細胞密度為4 ×103個/孔，每孔100 μL培養液。細胞貼壁附著后，更換新的培養液，對照組加入100 μL完全培養液，黃芪甲苷3個濃度組分別加入黃芪甲苷終濃度為0.1、1、10 μg·mL-1的培養液100 μL（設置3 個復孔）。同時設置空白孔（加入不含細胞和黃芪甲苷的培養液）。24 h后，吸出培養液。每孔用100 μL 檢測試劑（10 μL CCK-8+90 μL 無血清培養液）在37 ℃避光孵育1 h。應用酶標儀測定光密度（OD）值（波長設置為490 nm）。公式：細胞存活率=（OD給藥-OD空白）/（OD對照-OD空白）。

1.4.4 黃芪甲苷抑制CXCL12 表達的最佳濃度篩選 GES-1 在6 孔板中按1 × 105個/孔的數量進行培養，并分成5 組，即空白對照組、模型組和黃芪甲苷0.1、1、10 μg·mL-1組。空白對照組不做干預，其余各組均加入最佳濃度的LPS，孵育24 h。黃芪甲苷3 個濃度組分別加入終濃度為0.1、1、10 μg·mL-1的黃芪甲苷培養液，黃芪甲苷使用0.05% DMSO 作為溶劑，處理24 h。采用qPCR法、ELISA法分別對應檢測不同濃度黃芪甲苷干預下GSE-1 細胞CXCL12 mRNA 表達水平、上清液中CXCL12 因子含量，以此確定最佳的黃芪甲苷濃度。

1.4.5 黃芪甲苷與STAT3分子對接 在PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）獲取STAT3 的PDB 格式，選擇原則為：人源蛋白、分辨率高（小于等于2.5?）、具有原始配體以及結晶pH值應盡量接近人體正常生理范圍。從PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）將STAT3 分子結構下載至本地計算機，使用chendraw 繪制小分子的3D立體結構，使用AutoDock vina 對接蛋白和小分子，在PyMOL中實現可視化。

1.4.6 細胞分組 GES-1 細胞在6 孔板中，按照每孔1 × 105個的數量進行培養，培養液為2 mL。培養24 h，細胞貼壁后棄去培養液。將GES-1 細胞分成空白對照組、模型組、黃芪甲苷組和p-STAT3 抑制劑組。空白對照組不做干預，其余3 組給予最佳濃度（10 μg·mL-1）的LPS 處理24 h。黃芪甲苷組給予最佳濃度（10 μg·mL-1）的黃芪甲苷（用0.05%DMSO作為溶劑）最佳濃度處理24 h，陽性藥物組即p-STAT3 抑制劑組，給予5.0 μmol·L-1p-STAT3 抑制劑BP-1-102（使用0.05%DMSO 作為溶劑）處理24 h。采用Western Blot法檢測p-STAT3和CXCL12蛋白表達水平。

1.4.7 qPCR方法測定CXCL12 mRNA 表達量 從細胞中提取RNA 后，測定其濃度和純度并轉錄成cDNA。反應體系為20 μL（包括Premix、上游引物、下游引物、模板cDNA 和MilliQ 水）。單個循環設置為95 ℃熱啟動10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸1 min，重復40 個循環。設定GAPDH 為內參基因，采用2-△△CT法測定mRNA 的相對表達量。人源CXCL12 基因的引物序列：正向，5’-ATTCTCAACACTCCAAACTGTGC-3’；反向，5’-ACTTTAGCTTCGGGTCAATGC-3’。 鼠源CXCL12 基因引物序列：正向，5’-GGAGGATAG ATGTGCTCTGGAAC-3’； 反向，5’-AGTGAGGA TGGAGACCGTGGTG-3’。引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計與合成。

1. 4. 8 ELISA 法檢測細胞上清液中CXCL12含量 對于細胞樣本，以300×g離心10 min，去除沉渣，然后將上部的澄清液收集。用ELISA 法測定CXCL12在細胞上清液中的濃度。

1. 4. 9 Western Blot 法檢測p-STAT3 和CXCL12蛋白表達水平 提取細胞總蛋白、胞漿和胞核蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定細胞總蛋白、胞漿和胞核蛋白濃度，進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。每孔上樣量為50 μg，電泳、轉膜、封閉。后根據檢測需要，添加針對目標蛋白的p-STAT3、CXCL12 一抗（稀釋比均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入二抗室溫孵育2 h。洗膜后，再添加曝光溶液進行曝光，利用凝膠成像系統進行圖像處理。使用ImageJ 軟件對得到的條帶進行灰度處理，然后通過計算目的蛋白/內參蛋白（GAPDH）比值，表示目的蛋白的表達水平。

1.5 體內實驗

1.5.1 小鼠分組、模型復制與給藥 小鼠適應性喂養1周后，隨機分成正常組、模型組、黃芪甲苷組和抑制劑組，每組6只。除正常組外，其他3組每日給予LPS 160 μg 灌胃和100 μg·mL-1LPS 自由飲用。持續1周后停止LPS灌胃，繼續保持LPS自由飲用，同時，黃芪甲苷組給予黃芪甲苷（用1%的羧甲基纖維素鈉溶液溶解）20 mg·kg-1·d-1[15-16]灌胃，p-STAT3 抑制劑組給予BP-1-102[用0.05%DMSO溶解]10 mg·kg-1·d-1[17]灌胃，干預1周后取材。

1.5.2 小鼠體質量測量及胃黏膜組織病理檢測記錄各組小鼠干預前后體質量。取材后，使用4%多聚甲醛溶液固定胃黏膜標本，再用乙醇梯度脫水、石蠟包埋。切片后，采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察組織學變化。

1.5.3 Western Blot法檢測胃黏膜p-STAT3、CXCL12蛋白表達水平 取胃黏膜組織提取總蛋白、胞漿和胞核蛋白后，余操作同“1.4.9”項內容。

1. 5. 4 免疫組織化學法檢測胃黏膜p-STAT3、CXCL12蛋白陽性表達水平 取小鼠胃黏膜組織經4%多聚甲醛溶液中固定、乙醇梯度脫水、包埋、切片后，脫蠟和水化，檸檬酸抗原修復緩沖液（pH6.0）抗原修復。3%過氧化氫溶液室溫避光孵育25 min，3%牛血清白蛋白室溫封閉30 min。加入一抗p-STAT3、CXCL12（稀釋比例分別為1∶100、1∶300）4 ℃孵育過夜。加入HRP 標記的IgG二抗（稀釋比例為1∶800）室溫孵育50 min，3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）顯色。蘇木素復染、脫水、透明和封片，于顯微鏡下觀察并拍照。使用Quant Center 2.3分析軟件中PatternQuant模塊將棕色區域（呈陽性）和藍色部分區分，兩部分Mask Area 作為組織面積，在棕色區域下一層級添加HistoQunant以統計陽性部分的面積，將陽性面積與組織面積的比值作為陽性率。

1.5.5 ELISA法用于檢測血漿中CXCL12含量 采用EDTA 抗凝法采集血標本后，將其離心，收集上部的血漿。用ELISA法測定CXCL12在血漿中的濃度。

2 結果

2. 1 LPS 誘導GES-1 細胞炎癥模型的濃度圖1結果顯示：10 μg·mL-1LPS 誘導GES-1 細胞24 h后，CXCL12 mRNA 表達水平和細胞上清液中CXCL12因子含量相比空白對照組上調最顯著（P＜

圖1 不同濃度的脂多糖（LPS）對GES-1細胞CXCL12 mRNA和蛋白表達的影響（±s，n=3）Figure 1 Effects of different concentrations of lipopolysaccharide（LPS）on mRNA and protein expression of CXCL12 in GES-1 cells（±s，n=3）

0.01 或P＜0.001），當LPS 濃度在10 μg·mL-1以上時，CXCL12 mRNA 表達水平和細胞上清液中CXCL12因子含量反而下降。因此，選擇10 μg·mL-1作為誘導GES-1 細胞發生炎癥模型的LPS 的最合適濃度，并應用于后續實驗。

2.2 黃芪甲苷對GES-1 細胞存活率的影響圖2結果顯示，與空白對照組比較，黃芪甲苷0.1、1、10 μg·mL-1組GES-1 細胞存活率無顯著性差異（P＞0.05）。表明0.1、1、10 μg·mL-1黃芪甲苷對GES-1 細胞活力沒有明顯影響，故選擇對0.1、1、10 μg·mL-1黃芪甲苷濃度開展后續的干預實驗。

2.3 黃芪甲苷干預LPS 誘導的GES-1 細胞的最佳濃度圖3結果顯示：與空白對照組比較，10 μg·mL-1LPS組GES-1 細胞誘導24 h 后CXCL12 mRNA表達水平和上清液中CXCL12因子含量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.001）；與模型組比較，黃芪甲苷0.1、1、10 μg·mL-1組CXCL12 mRNA 表達水平和細胞上清液中CXCL12因子含量均降低，且隨黃芪甲苷濃度逐漸升高而逐漸下調，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。當黃芪甲苷濃度為10 μg·mL-1時，CXCL12 mRNA 水平（P＜0.01）和CXCL12 因子水平（P＜0.05）下調最為顯著，故選用本濃度開展后續實驗。

2.4 黃芪甲苷與STAT3 分子對接圖4 分子對接計算結果表明，黃芪甲苷能與STAT3 靶點發生結合，其結合能皆＜5 kcal/mol，提示黃芪甲苷與STAT3 具有較強的結合力。STAT3 的氨基酸ARG-1127、ASN-986、GLN-955 與黃芪甲苷之間的氫鍵結合能較小，形成的活性口袋穩定，此為黃芪甲苷與STAT3結合的潛在位點。

圖4 黃芪甲苷與STAT3對接結果Figure 4 Docking results of astragaloside Ⅳwith STAT3

2.5 黃芪甲苷對LPS 誘導的GES-1 細胞炎癥模型p-STAT3、CXCL12 蛋白表達水平的影響圖5 結果顯示：模型組細胞中p-STAT3、CXCL12 蛋白表達水平均高于正常組（P＜0.001）；與模型組比較，黃芪甲苷組和p-STAT3 抑制劑組GES-1 細胞p-STAT3、CXCL12 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01 或P＜0.001）。表明黃芪甲苷能抑制LPS 誘導的GES-1 細胞p-STAT3、CXCL12蛋白的表達。

圖5 黃芪甲苷對脂多糖（LPS）誘導的GES-1 細胞炎癥模型p-STAT3、CXCL12蛋白表達水平的影響（±s，n=3）Figure 5 Effect of astragaloside Ⅳon protein expressions of p-STAT3 and CXCL12 in GES-1 inflammation model stimulated by LPS（±s，n=3）

2.6 黃芪甲苷對胃炎小鼠體質量和胃黏膜病理的影響圖6-A 結果顯示：與空白對照組比較，模型組小鼠的體質量顯著降低（P＜0.001）；黃芪甲苷組和p-STAT3 抑制劑組小鼠體質量較模型組顯著升高（P＜0.01）。圖6-B 組織病理學結果顯示：空白對照組胃黏膜腺管排列整齊，壁細胞和主細胞之間界限清晰，固有層內未見炎癥細胞浸潤；模型組胃腺管紊亂，黏膜固有層變薄、紊亂，可見炎癥細胞滲入；黃芪甲苷組和p-STAT3抑制劑組小鼠胃黏膜固有層炎癥細胞數目減少，胃腺排列略顯規整。提示黃芪甲苷可以改善胃炎小鼠的一般情況和病理損傷。

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圖6 黃芪甲苷對胃炎小鼠體質量和胃黏膜病理變化的影響（±s，n=6）Figure 6 Effect of astragaloside Ⅳon body mass and stomach mucosa histopathology of mice with gastritis（±s，n=6）

2. 7 黃芪甲苷對胃炎小鼠胃黏膜p-STAT3、CXCL12 蛋白表達水平的影響圖7 結果顯示：模型組胃黏膜p-STAT3、CXCL12 蛋白表達水平較空白對照組顯著升高（P＜0.01 或P＜0.001）；與模型組比較，黃芪甲苷組和p-STAT3 抑制劑組胃黏膜中p-STAT3、CXCL12 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001）。提示黃芪甲苷可以抑制LPS 誘導的胃炎小鼠胃黏膜中p-STAT3、CXCL12蛋白表達水平。

圖7 黃芪甲苷對胃炎小鼠胃黏膜p-STAT3、CXCL12蛋白表達水平的影響（±s，n=6）Figure 7 Effect of astragaloside Ⅳon protein expressions of p-STAT3 and CXCL12 in gastric mucosa of mice with gastritis（±s，n=6）

2.8 黃芪甲苷對胃炎小鼠血漿中CXCL12 含量的影響圖8結果顯示：模型組血漿中CXCL12含量較空白對照組顯著升高（P＜0.01）；黃芪甲苷組和p-STAT3抑制劑組血漿中CXCL12含量較模型組顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。提示黃芪甲苷可以下調LPS 誘導的胃炎小鼠血漿中CXCL12 因子水平。

圖8 黃芪甲苷對胃炎小鼠血漿中CXCL12含量的影響（±s，n=6）Figure 8 Effect of astragaloside Ⅳon the content of CXCL12 in plasma of mice with gastritis（±s，n=6）

3 討論

胃炎是消化系統的常見病和難治病，目前，我國幽門螺桿菌感染率為40.6%~55.8%，感染者幾乎均存在慢性活動性胃炎[18]。大多數患者有不同程度的上腹部疼痛、腹脹、早飽等輕微癥狀，嚴重情況下可能會出現貧血、腹瀉、嘔血、黑便等，這對患者的生活質量和生命健康產生較大影響[19]。胃炎若得不到積極有效的干預，病程遷延，會伴有一定的癌變風險[19]。胃炎通常與胃黏膜上的炎癥細胞浸潤有關[20]，炎癥細胞不斷釋放炎癥介質，導致非可控性炎癥發生。持續的炎癥會損傷胃黏膜，進一步加劇炎癥反應[21]。因此，抑制黏膜微環境中炎癥細胞的浸潤是改善胃黏膜損傷的關鍵。

胃炎歸屬于中醫學“胃脘痛”“胃痞”范疇，本病的基本病機為脾胃虛弱，補益脾胃是基本治法。黃芪是治療脾胃消化系統疾病的常用藥物，具有補中益氣、利水消腫、斂瘡生肌的功效[22]。有研究[23]報道，穴位注射黃芪注射液能改善慢性胃炎患者黏膜病理狀態。黃芪建中湯、補中益氣湯等以黃芪為君藥的經典名方也被證實有助于糾正慢性胃炎患者的胃黏膜損傷[24-26]。黃芪甲苷是黃芪的主要活性物質，發揮調節免疫、抗炎的作用[27]。研究表明，黃芪甲苷可以通過升高大鼠血清中一氧化氮（NO）水平、提高超氧化物歧化酶（SOD）活性以及降低丙二醛（MAD）含量，改善酒精導致的急性胃黏膜損害[28]，另外，還能調節Hedgehog 信號途徑，進而對慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜損傷具有一定的改善作用[29]。以上結果表明，黃芪甲苷在胃炎防治上有潛在的臨床意義。

本研究使用LPS 誘導構建體外胃上皮細胞炎癥模型和體內胃炎小鼠模型，發現p-STAT3、CXCL12表達水平上調，小鼠胃黏膜炎癥細胞浸潤增加。STAT3 磷酸化是JAK2/STAT3 信號通路活化的關鍵標志之一，磷酸化的STAT3 通常入核促進下游一系列細胞因子的轉錄表達[9-10]，進而趨化炎癥細胞浸潤。CXCL12 又稱基質細胞衍生因子1（SDF-1），編碼序列位于10q11.1，其與CXCR4/CXCR7 受體結合對淋巴細胞有強烈的趨化作用[11]。故本研究結果提示，LPS 可激活JAK2/STAT3信號通路，促進CXCL12的表達并介導炎癥細胞浸潤及炎癥發生。

分子對接是一種計算生物學和藥物設計中的重要技術，常用于研究確定潛在藥物與生物分子（通常是蛋白質）的結合方式，有助于理解藥物與生物分子的相互作用[30]。分子對接結果顯示，黃芪甲苷與STAT3 具有較高的親和力，提示黃芪甲苷具有潛在抑制STAT3 的活性。進一步使用黃芪甲苷干預LPS 誘導的GES-1 炎癥模型后，細胞中CXCL12 mRNA 表達水平和上清液中CXCL12 含量顯著下調，STAT3磷酸化水平明顯降低。體內研究結果顯示，黃芪甲苷能改善LPS誘導的胃炎小鼠胃黏膜病理情況，抑制胃炎小鼠胃黏膜中p-STAT3蛋白磷酸化水平，下調胃黏膜和血漿中CXCL12因子的含量。上述研究結果提示，黃芪甲苷可能是通過抑制STAT3 的磷酸化，進而抑制JAK2/STAT3通路的活化及下游CXCL12 的轉錄，CXCL12-CXCR4/CXCR7 趨化信號進一步受到抑制，使炎癥細胞浸潤減少，黏膜炎癥改善。

綜上所述，黃芪甲苷可能是通過抑制JAK2/STAT3 信號通路活化，抑制CXCL12 表達，進而減少炎癥細胞浸潤，達到改善胃黏膜炎癥水平的作用。