基于內質網應激探討越婢加術湯對糖尿病腎病患者的治療機制

黃賽嬌， 林意， 盧艷， 朱葉

（瓊海市中醫(yī)院，海南瓊海 571400）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）為糖尿病并發(fā)癥之一，近年來DKD 進展為慢性腎衰的比率逐年攀升，是造成終末期腎衰竭的主因[1]。據報道[2]，我國DKD 在終末期腎病中約占15%。DKD 發(fā)病機制復雜，研究[3]發(fā)現內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與DKD 發(fā)病關系密切，高血糖可誘發(fā)機體ERS，而ERS 及其介導的細胞凋亡在DKD 發(fā)病過程中起重要作用。中藥在DKD 早期防治中有獨特優(yōu)勢，可使DKD 的病情進展得到有效延緩。越婢加術湯出自醫(yī)圣張仲景的《金匱要略》，由石膏、麻黃、白術、生姜、大棗等組成，功在疏風清熱、宣肺利水[4]。現代醫(yī)學研究[5-6]表明：（1）越婢加術湯可改善阿霉素腎病大鼠腎功能以及減輕其腎臟病理損害；（2）越婢加術湯對于DKD 患者腎性水腫有一定改善作用，有利于病情好轉。但越婢加術湯是否能通過對DKD患者的ERS 產生影響而發(fā)揮治療作用，目前尚不清楚?；诖耍狙芯繑M從ERS 角度，探討越婢加術湯對DKD 患者的治療效果及機制?，F將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組選取2020年8月～2022年8 月海南省瓊海市中醫(yī)院收治的114 例脾腎陽虛型DKD 患者為研究對象，按照隨機數字表法將患者隨機分為觀察組和對照組，每組各57 例。本研究符合醫(yī)學倫理學要求并通過海南省瓊海市中醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審核批準。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 參照《中國成人糖尿病腎臟病臨床診斷專家共識》[7]中的DKD 診斷標準：①糖尿病病史明確；②尿白蛋白/肌酐之比（albumin/creatinine ratio，ACR）≥30 mg/g 或尿白蛋白排泄率（albumin excretion rate，AER）≥20 μg/min。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準 參照張伯禮等主編、人民衛(wèi)生出版社出版的《中醫(yī)內科學》[8]制定DKD 脾腎陽虛型的中醫(yī)辨證標準：①主癥：肢體浮腫，小便不利，身倦乏力；②次癥：食欲降低，腰膝酸軟；③舌脈：舌淡胖，苔薄白，脈沉細。

1. 3 納入標準①符合上述DKD 的西醫(yī)診斷標準，且DKD 分期處于Ⅳ期；②中醫(yī)證型為脾腎陽虛型；③年齡30～75 歲，性別不限；④智力正常，意識清晰，能配合相關治療和指標檢測；⑤入組前未行DKD 相關治療；⑥病歷資料完整；⑦自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1. 4 排除標準①有原發(fā)性腎臟疾病的患者；②1 型糖尿病患者；③有腎毒性藥物服用史的患者；④合并有嚴重心、腦、肝、肺功能障礙的患者；⑤合并有精神系統(tǒng)疾病、凝血功能障礙、惡性腫瘤、藥源性蛋白尿的患者；⑥孕婦及哺乳期女性；⑦已知對受試藥物過敏的患者；⑧正在接受其他臨床研究的患者。

1.5 剔除標準①不符合納入標準而被誤納入的患者；②依從性差，不能堅持治療的患者；③治療過程中發(fā)生嚴重不良反應，研究者認為不適合繼續(xù)參加臨床試驗的患者；④試驗期間自行要求退出的患者。

1.6 治療方法

1. 6. 1 對照組 給予常規(guī)西醫(yī)治療。①基礎治療：根據《中國2型糖尿病防治指南（2020年版）》[9]進行基礎治療，如控制血脂、降血壓、健康宣教、飲食指導等，并根據病情給予降糖藥或者注射胰島素等。②還原型谷胱甘肽注射液（福安藥業(yè)集團湖北人民制藥有限公司生產，批準文號：國藥準字H20 183086；規(guī)格：0.6 g/瓶）1.8 g，用0.9%氯化鈉注射液（浙江康樂藥業(yè)股份有限公司生產，批準文號：國藥準字H33 020655；規(guī)格：250 mL∶2.25 g）250 mL 稀釋后靜脈滴注，每天1 次。療程為3個月。

1.6.2 觀察組 在對照組的基礎上聯(lián)合越婢加術湯治療。方藥組成：麻黃12 g、石膏30 g、生姜5 片、甘草6 g、白術15 g、大棗6枚。上述中藥均由海南省瓊海市中醫(yī)院中藥房提供。每天1劑，常規(guī)煎取藥汁300 mL，分早、中、晚3次溫服。療程為3個月。

1.7 觀察指標及療效評價標準

1.7.1 中醫(yī)證候評分 參照文獻[10]制定中醫(yī)證候評分量表，根據癥狀嚴重程度分為無、輕度、中度、重度4 級，主癥分別計為0、2、4、6 分，次癥分別計為0、1、2、3 分；分值越高，表示癥狀越嚴重。觀察2組患者治療前后主癥積分和次癥積分的變化情況。

1.7.2 臨床療效評價 參照文獻[10]制定療效評價標準，分顯效、有效、無效3級。①顯效：臨床癥狀和AER 均明顯改善，AER 降幅≥50%，證候總積分（主癥積分+次癥積分）降幅≥75%；②有效：臨床癥狀和AER 均有所改善，10%≤AER 降幅＜50%，30% ≤證候總積分降幅＜75%；③無效：臨床癥狀和AER 均未見改善，AER 降幅＜10%，證候總積分降幅＜30%?？傆行?（顯效例數+有效例數）/總病例數×100%。

1.7.3 血糖指標和腎功能指標檢測 分別于治療前后，抽取患者空腹外周靜脈血3 mL，以3 000 r/min離心處理15 min（離心半徑為10 cm），取上層血清。采用日立7600-020型全自動生化分析儀（上海企晟醫(yī)療器械有限公司）測定尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、24 h尿蛋白、肌酐（serum creatinine，SCr）、空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）水平。由醫(yī)院檢驗科負責檢測。觀察2組患者治療前后各項血糖指標和腎功能指標的變化情況。

1.7.4 內質網應激相關指標檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法測定外周血中葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose regulatory protein 78，GRP78）、蛋白激酶R 樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）mRNA表達水平。具體操作步驟如下：將血液標本以1 000 r/min離心處理5 min（離心半徑為10 cm），行血漿分離，低溫保存。利用超快血液總RNA提取試劑盒（Trizol法）提取血漿中的總RNA，利用NanoDrop1000超微量分光光度計（上海實維實驗儀器技術有限公司）定量總RNA 質量，利用cDNA 第一鏈合成試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）將總RNA 逆轉錄為cDNA，而后在Thermofisher 7500 Real-Time定量PCR儀（上海恒斐生物科技有限公司，試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司）上行PCR反應（反應體系：cDNA 1.0 μL、PCR mix 10.0 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH2O 8.2 μL；反應條件：93 ℃條件下變性60 s，55 ℃條件下退火60 s，72 ℃條件下延伸60 s，40 個循環(huán)）。結果以2-△△Ct法表示。引物序列如下：內參GAPDH：正向5’-CACA GTCCATGCCATCACTGC-3’與反向5’-GGTCTAC ATGGCAACTGTGAG-3’；GRP78：正向5’-CCGT GCTGCGCTTCTTCTTCTGTG-3’與反向5’-GCGGG ACTTGAGTTCGAGGGATGG-3’；PERK：正向5’-AGGCGTGCAAATCTGTCTCG-3’與反向5’-TGCA TTTGGATAGCTGGTTTAGT-3’；CHOP：正向5’-CACAAGCACCTCCCAAAGC-3’與反向5’-CTCTC ATTCTCCTGCTCCTTCTC-3’。觀察2 組患者治療前后GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達水平的變化情況。

1.7.5 安全性評估 觀察2 組患者治療過程中不良反應發(fā)生情況，評價2組治療方案的安全性。

1.8 統(tǒng)計方法應用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件進行數據的統(tǒng)計分析。計量資料（均符合正態(tài)分布和方差齊性要求）以均數±標準差（±s）表示，組內治療前后比較采用配對設計t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。均采用雙側檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2 組患者脫落情況及基線資料比較治療過程中，2組患者均無脫落剔除病例，均能完成全部療程的治療。對照組57 例患者中，男31 例，女26 例；年齡30～75歲，平均年齡（57.50±3.48）歲；2型糖尿病（T2DM）病程（7.85±1.02）年，DKD病程（16.52±2.27）個月。觀察組57例患者中，男33例，女24 例；年齡30～75 歲，平均年齡（58.23 ±3.67）歲；T2DM 病程（7.91±1.12）年，DKD 病程（17.05±2.19）個月。2 組患者的性別、年齡、病程等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明2 組患者的基線特征基本一致，具有可比性。

2.2 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較表1結果顯示：治療前，2組患者的主癥積分和次癥積分比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。治療后，2組患者的主癥積分和次癥積分均較治療前明顯降低（P＜0.01），且觀察組對主癥積分和次癥積分的降低幅度均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1 2組脾腎陽虛型糖尿病腎病（DKD）患者治療前后中醫(yī)證候積分比較Table 1 Comparison of TCM syndrome scores between two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment （±s，分）

表1 2組脾腎陽虛型糖尿病腎?。―KD）患者治療前后中醫(yī)證候積分比較Table 1 Comparison of TCM syndrome scores between two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment （±s，分）

注：①P＜0.01，與治療前比較；②P＜0.01，與對照組治療后比較

?

2.3 2組患者臨床療效比較表2結果顯示：治療3 個月后，觀察組的總有效率為91.23%（52/57），對照組為70.18%（40/57），組間比較（χ2檢驗），觀察組的臨床療效明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表2 2組脾腎陽虛型糖尿病腎?。―KD）患者臨床療效比較Table 2 Comparison of clinical efficacy between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type [例（%）]

2.4 2組患者治療前后血糖指標比較表3結果顯示：治療前，2 組患者的FPG、HbA1c 水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。治療后，2組患者的FPG、HbA1c 水平均較治療前明顯降低（P＜0.05），且觀察組對FPG、HbA1c 水平的降低幅度均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表3 2組脾腎陽虛型糖尿病腎?。―KD）患者治療前后血糖指標比較Table 3 Comparison of blood glucose indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment（±s）

表3 2組脾腎陽虛型糖尿病腎病（DKD）患者治療前后血糖指標比較Table 3 Comparison of blood glucose indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment（±s）

注：①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.01，與對照組治療后比較

?

2.5 2組患者治療前后腎功能指標比較表4結果顯示：治療前，2 組患者的SCr、24 h 尿蛋白、BUN 水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。治療后，2 組患者的SCr、24 h 尿蛋白、BUN 水平均較治療前明顯降低（P＜0.01），且觀察組對SCr、24 h尿蛋白、BUN水平的降低幅度均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表4 2組脾腎陽虛型糖尿病腎?。―KD）患者治療前后腎功能指標比較Table 4 Comparison of renal function indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment（±s）

表4 2組脾腎陽虛型糖尿病腎?。―KD）患者治療前后腎功能指標比較Table 4 Comparison of renal function indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment（±s）

注：①P＜0.01，與治療前比較；②P＜0.01，與對照組治療后比較

?

2.6 2 組患者治療前后內質網應激相關指標比較表5 結果顯示：治療前，2 組患者的GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。治療后，2組患者的GRP78、PERK、CHOP mRNA表達水平均較治療前明顯降低（P＜0.01），且觀察組對GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達水平的降低幅度均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表5 2組脾腎陽虛型糖尿病腎?。―KD）患者治療前后內質網應激相關指標比較Table 5 Comparison of endoplasmic reticulum stress related indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment （±s，2-△△Ct）

表5 2組脾腎陽虛型糖尿病腎?。―KD）患者治療前后內質網應激相關指標比較Table 5 Comparison of endoplasmic reticulum stress related indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment （±s，2-△△Ct）

注：①P＜0.01，與治療前比較；②P＜0.05，與對照組治療后比較

?

2.7 安全性分析治療期間，2 組患者均未發(fā)生嚴重不良反應，患者的血壓、心電圖、血常規(guī)、肝功能等均未見明顯異常，具有較高的安全性。

3 討論

糖尿病腎?。―KD）為糖尿病微血管并發(fā)癥中的一種，臨床表現為大量蛋白尿、水腫、腎功能降低等，是導致糖尿病患者死亡的重要原因。現代醫(yī)學治療DKD 的手段包括控制血糖、降血壓、擴張腎臟入球小動脈、營養(yǎng)干預等，但總體療效欠佳[11-12]，近年來臨床中越來越多的學者選擇聯(lián)合應用中醫(yī)藥療法治療DKD，取得令人滿意的療效。

根據DKD 的臨床表現，可將其歸屬于中醫(yī)“消渴”“關格”“消渴腎病”等范疇，本虛標實為其基本病機特點。DKD 發(fā)展至Ⅳ期，患者往往是在氣陰兩虛證候的基礎上出現了陽氣虛衰，故以脾腎陽虛為其主要病機。脾主運化，腎主水，機體脾氣虛弱，腎陽不足，水液代謝失調，濕濁之邪泛溢肌膚，而成水腫；津液精微不歸正化，導致谷氣下流、精微外泄，而成大量蛋白尿?！妒備洝吩疲骸跋什∪站茫I氣受損，腎主水，腎氣虛衰，則氣化不利，開闔失司，水液積聚，而成水腫?！盵13]故宜將溫補脾腎、利水化濁作為主要治則。

本研究選取的越婢加術湯中，麻黃為君藥，性溫，味辛、微苦，入肺經、膀胱經，具有利水消腫、發(fā)汗解表、宣肺平喘之功；白術為臣藥，性溫，味苦、甘，入脾、胃經，可健脾利水；石膏性大寒，味甘、辛，入肺、胃經，具有宣肺清熱、除煩止渴之功；生姜性微溫，味辛，入脾、肺、胃經，具有解表散寒、溫肺止咳、溫中止嘔、解毒之功；大棗性溫，味甘，入脾、胃經，可補脾和胃，補中益氣，調營衛(wèi)，解藥毒；甘草性平，味甘，入脾、心、肺、胃經，具有清熱解毒、潤肺止咳、益氣健脾、補中扶正、調和諸藥之效?？v觀全方，可達溫補脾腎、利水消腫之效，緊扣DKD 脾腎陽虛證的病機要點?，F代藥理研究[14-15]證實，高、低劑量白術對大鼠陽虛型下焦水腫有積極影響，可降低尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）及尿蛋白含量；麻黃水煎液可通過降低腎臟水通道蛋白1/2（aquaporin 1/2，AQP1/2）表達而發(fā)揮對腎陽虛水腫大鼠的利水消腫作用。本研究結果顯示，治療3 個月后，觀察組的總有效率為91.23%（52/57），對照組為70.18%（40/57），組間比較，觀察組的臨床療效明顯優(yōu)于對照組，且觀察組對主癥積分和次癥積分的降低作用均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示越婢加術湯對脾腎陽虛型DKD 患者療效顯著，有一定臨床應用價值。同時，2組患者治療后的空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、SCr、24 h 尿蛋白、BUN 水平均較治療前明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），且觀察組對上述指標的降低作用均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示越婢加術湯有助于改善脾腎陽虛型DKD 患者的血糖指標和腎功能指標水平。

近年來，大量報道[16-17]均證實DKD的發(fā)生、發(fā)展與內質網應激（ERS）密切相關，DKD狀態(tài)下ERS參與了腎小球系膜細胞、足細胞、腎小球內皮細胞損傷。目前調控ERS 已成為DKD 防治領域的熱點之一，在中醫(yī)藥的防治研究中受到了廣泛關注。葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）為ERS 中重要的分子伴侶蛋白，在ERS 相關疾病中呈異常高表達，被認為是ERS發(fā)生的標志蛋白[18]。蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）通路為ERS 中的關鍵通路，ERS 發(fā)生時該通路最先啟動。ERS 狀態(tài)下，體內GRP78 從PERK 上解離后大量表達，而后PERK 經自身磷酸化激活，進而激活下游一連串反應，增加活化轉錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）表達水平，進一步激活C/EBP 同源蛋白（CHOP）基因而誘導細胞凋亡[19]。CHOP 是ERS 中間信號分子，也是ERS 介導凋亡過程中的關鍵蛋白，可被PERK/ATF4 通路激活[20]。已有研究[21]發(fā)現，DKD小鼠腎組織內GRP78、PERK表達量明顯上調，CHOP 轉錄活性明顯增強，小鼠CHOP 基因敲除后上述指標表達水平下降，其腎臟病變亦減輕。本研究中，2組患者治療后的GRP78、PERK、CHOP mRNA 表達水平均較治療前明顯降低（P＜0.01），且觀察組對GRP78、PERK、CHOP mRNA表達水平的降低幅度均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明越婢加術湯可能通過抑制內質網應激，從而起到延緩DKD 進展的作用。

綜上所述，越婢加術湯治療脾腎陽虛型DKD患者療效確切，有助于緩解患者臨床癥狀，改善患者腎功能和血糖水平，其療效機制可能與抑制內質網應激有關。