胃癌病人AHNAK表達與巨噬細胞浸潤及預后的相關性

孫潔 查秀芳 徐瑾 趙君寧 何偉 張楠楠

胃癌(GC)為僅次于肺癌和結直腸癌(死亡率分別為18.4%和9.3%)的第三大癌癥相關的死因[1]。大多數GC病人早期無特異性癥狀,因此確診時多已進展至晚期GC。盡管目前早期GC治療的成功率有所提高,但晚期GC病人預后仍較差,其5年生存率<20%[2]。腫瘤微環境(TME)的結構成分主要包括基質細胞和免疫細胞。AHNAK也稱橋粒蛋白,最初被認為是神經母細胞瘤細胞類型中的一種大分子腫瘤相關核蛋白,在血腦屏障形成、細胞結構和遷移、心臟鈣通道調節和腫瘤轉移等多種過程中發揮重要作用[3]。腫瘤免疫治療是繼靶向治療的另一種具有巨大潛力的治療策略,而TME是影響免疫治療反應的重要因素,結合TME中多種免疫調節機制的新型免疫療法將可能改善GC病人的預后[4]。然而,AHNAK在GC預后中的作用及與免疫細胞浸潤之間的關系尚不明確。本研究通過生物信息數據庫,分析GC組織中AHNAK的表達與免疫細胞浸潤水平之間的關系以及其對GC病人預后的預測作用,為GC的診斷、預后評估、腫瘤免疫治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1AHNAK表達水平分析 利用UALCAN[5](http://ualcan.path.uab.edu/index.html)數據比較AHNAK基因在GC組織與正常組織中的表達水平。UALCAN是一個基于TCGA數據庫的相關癌癥數據進行在線分析和挖掘的網站工具,可對研究的癌癥查看整體的基因表達情況,獲得基因表達熱圖,并且對相關基因進行鑒定、表達譜分析、生存分析以及亞組分析等。

1.2 腫瘤免疫細胞浸潤評估 使用TIMER 2.0[6](http://timer.cistrome.org/)分析AHNAK的表達水平與GC免疫細胞浸潤水平及免疫細胞標志物表達水平的相關性。TIMER數據庫主要采用RNA-Seq表達譜數據,其中,免疫細胞主要包括以下6種細胞:B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞。

1.3 GC病人的生存分析 根據AHNAK表達水平的中位數將GC病人分為高表達組和低表達組。使用Kaplan-Meier Plotter[7](http://kmplot.com/analysis/)分析AHNAK不同表達水平對總生存期(OS)的影響。下載TCGA數據庫中GC病人的相關臨床資料,分析不同臨床特征對GC病人預后的影響。

1.4 統計學處理 使用SPSS 24.0軟件進行統計學分析,采用log-rank檢驗比較2組生存曲線間的差異;各指標間的相關性采用Spearman相關分析;采用Cox回歸分析可能影響GC病人預后的因素。使用RMS包將影響預后的相關因素構建預測GC病人1、3、5年生存概率的列線圖,并進行校準分析與可視化。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1AHNAK在GC病人中的表達情況 UALCAN數據庫分析顯示,與正常組織相比,AHNAK在GC組織中低表達(P<0.05),見圖1A;進一步對GC病人的年齡進行分組,結果顯示,41～60歲、61～80歲、81～100歲GC病人的AHNAK表達量明顯低于正常組織(P<0.01),且41～60歲及61～80歲GC病人的AHNAK表達量高于81～100歲GC病人(P<0.05),見圖1B。

注:A:AHNAK在GC組織與正常組織的表達情況比較;B:AHNAK在不同年齡GC病人中的表達情況比較;TPM:transcript per million。圖1 AHNAK在GC病人中的表達情況

2.2AHNAK與免疫細胞浸潤的關系以及二者對GC病人OS的影響 TIMER數據庫分析結果顯示,AHNAK表達水平與巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞浸潤水平均存在相關性(P<0.05),見圖2A;進一步分析發現,高巨噬細胞浸潤水平的GC病人的OS更短(P=0.004),其他免疫細胞浸潤水平對GC病人的OS無顯著影響(P均>0.05),見圖2B。Kaplan-Meier Plotter數據庫分析顯示,AHNAK低表達的GC病人的OS更短(P<0.01,圖2C)。

注:A:AHNAK與免疫細胞浸潤的相關分析;B:不同免疫細胞浸潤水平與GC病人預后的Kaplan-Meier曲線(藍線為低浸潤水平,紅線為高浸潤水平);C:不同AHNAK表達水平病人預后的Kaplan-Meier曲線。圖2 AHNAK與免疫細胞浸潤的關系及二者對GC預后的影響

2.3AHNAK與不同分化類型巨噬細胞浸潤及其標記物之間的關系 TIMER數據庫分析結果顯示,AHNAK的表達水平與M2型巨噬細胞浸潤水平呈正相關(P<0.001)與M1型巨噬細胞浸潤水平無關(P=0.204),見圖3A;進一步分析AHNAK與M2型巨噬細胞相關基因表達水平之間的關系,結果顯示,AHNAK表達水平與RAI14、PCOLCE2、CTSK、MS4A4A、CD163、VSIG4基因表達水平均呈正相關(P<0.001),見圖3B。

注：A:AHNAK與不同分化類型巨噬細胞浸潤的相關分析;B:AHNAK與M2型巨噬細胞相關基因的相關分析。

2.4 Cox回歸分析不同臨床病理特征對GC病人預后的影響 將TCGA數據庫中GC病人的相關資料與預后情況先進行單因素Cox回歸分析,再將單因素Cox回歸分析中P<0.1的因素納入多因素回歸分析,結果顯示,N分期、M分期、AHNAK表達水平、年齡是GC病人預后的獨立影響因素(P<0.05)。見表1。

表1 Cox回歸分析不同臨床病理特征對GC病人預后的影響

2.5 預測GC病人1、3、5年生存概率的列線圖及校準曲線的構建 將N分期、M分期、年齡、AHNAK表達水平納入RMS包構建預測GC病人1年、3年、5年生存概率的列線圖,見圖4A。圖4B為列線圖的校準曲線,圖中的偏差修正線接近理想曲線,表明預測值與觀測值之間具有良好的一致性。

注：A:預測GC病人1、3、5年生存概率的列線圖;B:預后校準圖驗證列線圖的預測效果。

3 討論

GC是我國最常見的癌癥之一,早期診斷GC有治愈可能,但晚期GC多已表現為廣泛浸潤和轉移,預后較差[8]。TME是圍繞腫瘤細胞的動態復雜環境,包括各種免疫細胞、細胞外基質、成纖維細胞、信號分子和血管。腫瘤免疫細胞浸潤是影響癌癥發展和治療的關鍵因素,其中,腫瘤相關巨噬細胞(TAM)在腫瘤的進展中發揮重要作用,其與癌癥轉移和較差的預后有關[9]。研究表明,M2型巨噬細胞分泌的轉化生長因子-β、血管內皮生長因子等細胞因子在誘導腫瘤細胞侵襲和遷移方面具有不同的功能[10]。因此,深入了解不同巨噬細胞分化類型在TME中的潛在分子機制及其對腫瘤細胞侵襲和遷移的影響,對探索新的診斷方法和治療靶點非常重要。

近年來,多項研究表明,AHNAK在不同類型的癌癥中發揮不同的作用。有研究發現,AHNAK2基因在肺腺癌腫瘤組織中顯著過表達,是肺腺癌病人的獨立預后預測指標。本研究通過對權威數據庫進行分析,發現與正常組織相比,AHNAK在GC組織中低表達,且41～60歲及61～80歲GC病人的AHNAK表達量高于81～100歲GC病人(P<0.05),提示年齡與GC病人AHNAK的表達密切相關,且高齡老年人的AHNAK表達量較低。

研究表明,AHNAK的表達與活化B細胞、CD8+T細胞和未成熟B細胞浸潤呈負相關,與CD4+T細胞、TAM、M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞浸潤呈正相關[11]。本研究免疫浸潤分析結果顯示,AHNAK的表達水平與巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞浸潤水平均存在相關性,其中高巨噬細胞浸潤水平與GC病人較差的預后相關;此外,AHNAK表達水平與M2型巨噬細胞中的RAI14、PCOLCE2、CTSK、MS4A4A、CD163、VSIG4標記性基因的表達水平均呈正相關(P<0.001),從而進一步提示AHNAK可能通過影響M2型巨噬細胞浸潤改變TAM,并影響GC進展。

本研究多因素Cox回歸分析結果顯示,年齡>65歲、AHNAK低表達、高NM分期為GC病人預后差的獨立危險因素,此外,利用上述危險因素構建的預測GC病人預后的列線圖,其預后校準圖提示預測值與觀測值具有較好的一致性。綜合以上數據表明,AHNAK可作為預測GC病人OS有價值的生物標志物,且在>65歲的老年病人中具有重要的預后價值,可作為輔助臨床診療的參考依據。

本研究存在一定的局限性。首先,本文是通過使用公共數據庫的回顧性數據進行分析和驗證的,因此,未來仍需要前瞻性的臨床及實驗數據來驗證其臨床實用性。其次,由于數據信息有限,未能進行更為詳細的亞組分析,將來需收集更為詳細的數據以便進行深入分析。總之,AHNAK的表達水平與GC病人預后和免疫細胞浸潤水平相關,AHNAK可能在免疫細胞浸潤中發揮重要作用,可作為預測老年GC病人預后的候選標志物。