小麥TabHLH112-2B 基因克隆及每穗小穗數(shù)相關(guān)功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)

范子培 李 龍 史雨剛 孫黛珍,* 李超男,* 景蕊蓮

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山西太谷 030801; 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

小麥?zhǔn)俏覈?guó)的主要口糧作物, 小麥生產(chǎn)對(duì)于保障糧食安全至關(guān)重要。然而, 由于氣候變化引發(fā)的降水量減少和溫度上升等, 預(yù)測(cè)到2050 年全球小麥產(chǎn)量可能下降23.2%～27.2%[1]。小麥生育期內(nèi)的干旱和高溫脅迫往往同時(shí)發(fā)生, 例如我國(guó)黃淮海和北方小麥主產(chǎn)區(qū)在灌漿期經(jīng)常出現(xiàn)干熱風(fēng)天氣, 嚴(yán)重威脅小麥產(chǎn)量, 降低品質(zhì)[2]。因此, 培育高產(chǎn)廣適品種是應(yīng)對(duì)復(fù)雜環(huán)境、保障小麥安全生產(chǎn)的重要途徑。

小麥產(chǎn)量由單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重三要素組成。產(chǎn)量三要素中的穗粒數(shù)與每穗小穗數(shù)密不可分, 通過(guò)提高每穗小穗數(shù)可以進(jìn)一步提高小麥產(chǎn)量[3-4]。Ding 等[5]鑒定出 5 個(gè)小麥 QTL, 其中QSns.sau-2D能在不同環(huán)境下增加14.72%的每穗小穗數(shù), 并發(fā)現(xiàn)每穗小穗數(shù)與開(kāi)花期、株高、穗長(zhǎng)和穗粒數(shù)之間呈顯著正相關(guān)。WAPO1通過(guò)調(diào)節(jié)末端小穗形成的時(shí)間影響每穗小穗數(shù), 與野生型相比, 功能缺失突變體wapo-A1的每穗小穗數(shù)顯著降低, 而攜帶由天然啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的額外拷貝WAPO-A1的轉(zhuǎn)基因小麥株系具有更多的每穗小穗數(shù)、更緊湊的穗頂端區(qū)域和更小的頂生小穗, 產(chǎn)量較高[6-7]。

bHLH 家族作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 廣泛存在于真核生物中[8], 研究表明bHLH 家族基因參與調(diào)節(jié)作物耐逆性和產(chǎn)量。該家族蛋白存在一個(gè)由 50～60 個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的bHLH 結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域由兩部分組成: 一段10～15個(gè)氨基酸殘基組成的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一段約40個(gè)氨基酸組成的α 螺旋-環(huán)-α 螺旋結(jié)構(gòu)域[9-10]。在水稻中, 干旱脅迫誘導(dǎo)OsbHLH130 的積累, 進(jìn)而激活OsWIH2的表達(dá),OsWIH2通過(guò)調(diào)節(jié)角質(zhì)層蠟質(zhì)的生物合成, 降低植物失水率和ROS 積累, 從而提高水稻抗旱性[11];OsbHLH57的突變體與野生型相比, 籽粒變小、結(jié)實(shí)率變低, 降低糧食產(chǎn)量, 而過(guò)表達(dá)OsbHLH57提高水稻產(chǎn)量[12]; TabHLH49 正向調(diào)控脫水蛋白基因WZY2表達(dá), 提高小麥抗旱性[13]; bHLH蛋白TaPGS1 能夠直接與Fl3(PLATZTF)啟動(dòng)子的E-box 基序結(jié)合, 誘導(dǎo)Fl3的表達(dá), 增加籽粒大小和重量[14]。因此, 研究bHLH 家族基因?qū)τ谔岣咝←溎湍嫘院彤a(chǎn)量具有十分重要的意義。

本研究克隆了小麥TabHLH112-2B基因, 分析其基因序列和蛋白結(jié)構(gòu), 檢測(cè)其在小麥不同發(fā)育階段的組織表達(dá)模式, 明確了其對(duì)ABA、IAA、MeJA等植物激素和干旱、高鹽、低溫和高溫等脅迫具有應(yīng)答反應(yīng); 序列多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)存在2個(gè)SNP, 根據(jù)SNP-682 開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記, 鑒定出干旱、高溫等多種環(huán)境下與每穗小穗數(shù)相關(guān)的優(yōu)異等位變異, 為進(jìn)一步解析TabHLH112-2B功能, 以及利用分子標(biāo)記輔助選育高產(chǎn)廣適小麥新品種提供了基因資源和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究以4 個(gè)小麥群體作為主要實(shí)驗(yàn)材料。群體1 由32 份高多態(tài)性的小麥材料組成[15], 用于分析基因序列多態(tài)性。群體2 是由323 份小麥種質(zhì)組成的自然群體, 包含12 份地方品種、36 份高代品系和275 份現(xiàn)代育成品種[16], 用于表型性狀與基因型的關(guān)聯(lián)分析; 群體3 由157 份地方品種組成, 群體4 包括348 份現(xiàn)代育成品種[17], 用于分析基因單倍型在我國(guó)小麥育種歷史中的應(yīng)用情況。群體2 分別于3個(gè)生長(zhǎng)季(2014—2017)種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所北京順義(40°23'N, 116°56'E)和昌平(40°13'N, 116°13'E)試驗(yàn)基地, 設(shè)雨養(yǎng)(drought stress,DS)和灌溉(well-watered, WW)兩種水分處理, 以及高溫脅迫處理(heat stress, HS), 小區(qū)長(zhǎng)2 m, 4 行, 行距30 cm, 每行40 粒種子, 成熟后調(diào)查株高、穗長(zhǎng)、每穗小穗數(shù)、穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀。DS 為全生長(zhǎng)期雨養(yǎng), 3 個(gè)生長(zhǎng)季的降水量分別為161、173 和143 mm;WW 分別在越冬前、開(kāi)花期和灌漿期灌溉, 灌水量為750 m3hm–2。HS 是在開(kāi)花后1 周用聚乙烯塑料膜覆蓋的溫室模擬高溫環(huán)境。群體4 于2005—2006生長(zhǎng)季種植在河南洛陽(yáng)(34°61'N, 112°45'E),2010—2011 生長(zhǎng)季種植在北京順義, 成熟后統(tǒng)計(jì)農(nóng)藝性狀。

以小麥品種旱選10 號(hào)為材料檢測(cè)基因表達(dá)水平。將小麥材料種植于25℃、16 h/20℃、8 h (光照/黑暗)的人工氣候室, 培養(yǎng)2 周后對(duì)其葉、根基(莖基部次生根發(fā)生的部位)、根進(jìn)行取樣, 用于提取RNA,分析基因在幼苗期組織中的表達(dá)模式。在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所試驗(yàn)基地(39°48′N(xiāo), 116°28′E),利用聚氯乙烯(PVC)硬管和軟質(zhì)塑料管套裝的管栽法種植小麥[16], 分別在拔節(jié)期、抽穗期、開(kāi)花期對(duì)地上部和地下部的組織取樣, 用于基因表達(dá)模式分析。將小麥種植于人工氣候室(22℃、相對(duì)濕度70%、光照強(qiáng)度150mol m–2s–1、16 h 光照/8 h 黑暗), 水培1 周左右, 待生長(zhǎng)至一葉一心, 對(duì)幼苗分別進(jìn)行不同激素和脅迫處理(50 μmol L–1ABA、0.1 mmol L–1IAA、0.1mol L–1MeJA、16.1% PEG-6000、250 mmol L–1NaCl、4℃、34℃), 在處理后0、0.5、1、2、3、6、12、24、48 和72 h 分別對(duì)根系進(jìn)行取樣,用于提取RNA, 檢測(cè)不同處理下的基因表達(dá)水平。

1.2 生物信息學(xué)分析

通過(guò)Ensembl Plants (https://plants.ensembl.org/index.html) 獲取TabHLH112-2B(TraesCS2B02G 510800)基因的序列信息; 通過(guò) WheatOmics 1.0(http://wheatomics.sdau.edu.cn/)下載TabHLH112-2B基因的啟動(dòng)子序列。使用在線工具對(duì)TabHLH112-2B進(jìn)行生物信息學(xué)分析(表1)。

1.3 TabHLH112-2B 序列多態(tài)性分析

利用DNAMAN 設(shè)計(jì)特異性引物TabHLH112-2B-F/R、TabHLH112-pro-2B-F/R (表2), 使用Pfu 高保真酶(AP231-22, 北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)擴(kuò)增群體1 的DNA 樣品, 以獲得TabHLH112-2B的基因序列和啟動(dòng)子序列。PCR 反應(yīng)體系:TransStartFastPfuFly DNA Polymerase 0.4L、5×TransStartFastPfubuffer 4L、2.5 mmol L–1dNTPs 1.6L、TabHLH112-2B-CDS-F/R 0.4L/0.4L、ddH2O 13.2L。PCR 程序?yàn)?5 ℃ 2 min; 95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 40個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 產(chǎn)物, 在紫外燈下切割目標(biāo)條帶, 利用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒(TD407-200, 北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司)回收PCR產(chǎn)物。

表2 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 2 Primers used in this study

將目的DNA 片段連接于pEASY-Blunt Cloning載體上(CB101, 北京全式金生物技術(shù)股份有限公司), 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell 感受態(tài)細(xì)胞(CD501, 北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)。挑選單菌落, 利用M13F/R 引物進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè), 挑選陽(yáng)性菌落測(cè)序。使用 SeqMan 軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果, 分析TabHLH112-2B的多態(tài)性位點(diǎn)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用植物總RNA 提取試劑盒(ZP405K-2, 北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)提取樣品RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR116-02, 天根生物科技(北京)有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

設(shè)計(jì)特異性引物TabHLH112-2B-qRT-F/R 和內(nèi)參基因引物TaTUB-F/R (表2), 使用SYBR Premix ExTaq(RR420A, 北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)(qRT-PCR), 反應(yīng)體系為: TB Green 10L, cDNA 0.3L (50 ngL–1), 引物F/R 0.4L (10mol L–1), ddH2O 8.9L。采用2–△△Ct(Ct 為反應(yīng)循環(huán)數(shù))計(jì)算TabHLH112-2B在不同組織部位中的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 dCAPS 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

根據(jù)單核苷酸位點(diǎn) SNP-682, 利用 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記, 設(shè)計(jì)特異性引物 TabHLH112-2BBamH I-F/R (表2)。使用BamH I 酶切PCR 產(chǎn)物, 根據(jù)酶切產(chǎn)物大小區(qū)分兩種單倍型。

1.6 關(guān)聯(lián)分析

利用開(kāi)發(fā)的dCAPS 分子標(biāo)記檢測(cè)群體2 樣品的基因型, 采用TASSEL 5 軟件的一般線性模型(GLM)對(duì)群體 2 的基因型與農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 以P<0.05 作為顯著性相關(guān)閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TabHLH112-2B 序列分析

利用WheatOmics 分析TabHLH112-2B基因序列,從起始密碼子至終止密碼子基因序列全長(zhǎng)2481 bp,包含7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子, 其中編碼區(qū)1335 bp,非編碼區(qū)668 bp, 編碼444 個(gè)氨基酸(圖1-A)。蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示, 在TabHLH112-2B 的第320～372位氨基酸處有一個(gè)典型的HLH 保守結(jié)構(gòu)域, 表明該基因是bHLH 家族成員(圖1-B)。

圖1 TabHLH112-2B 基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析Fig.1 Predictive analysis of TabHLH112-2B gene sequence and protein structure

采用SOPMA 工具分析TabHLH112-2B 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白主要由 α-螺旋(alpha helix)、β-轉(zhuǎn)角(beta turn)、無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)、延伸鏈(extended strand)組成。其中, α-螺旋有108 個(gè)氨基酸, 占24.32%; β-轉(zhuǎn)角有24 個(gè)氨基酸, 占5.41%;無(wú)規(guī)則卷曲有263 個(gè)氨基酸, 占59.23%; 延伸鏈有49 個(gè)氨基酸, 占11.04% (圖1-C)。利用Phyre2 預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu), TabHLH112-2B 蛋白為典型的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(圖1-D)。

利用ProtParam 預(yù)測(cè)分析TabHLH112-2B 蛋白理化性質(zhì)。結(jié)果表明, 該蛋白由20 種氨基酸組成, 其中絲氨酸含量最高, 有52 個(gè), 占氨基酸總數(shù)的11.7%;其次是丙氨酸, 有49 個(gè), 占總數(shù)的11.0% (圖2-A)。該蛋白分子式為C2040H3152N594O646S17, 原子數(shù)為6449,相對(duì)分子質(zhì)量為46,880.08, 理論等電點(diǎn)(pI)為7.04, 帶正電的氨基酸殘基(Arg+Lys)為32, 帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp+Glu)為 33。利用 ExPASy-ProtScale 分析TabHLH112-2B 的親/疏水性, 發(fā)現(xiàn)整個(gè)氨基酸序列中親/疏水氨基酸分布不均, 親水性平均系數(shù)為–0.472(圖2-B)。

圖2 TabHLH112-2B 蛋白性質(zhì)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of TabHLH112-2B protein properties and phosphorylation sites

利用NetPhos-3.1 預(yù)測(cè)TabHLH112-2B 氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn), 結(jié)果顯示分值大于閾值0.5 的氨基酸磷酸化位點(diǎn)有85 個(gè), 且分布不均, 其中絲氨酸(Serine) 65 個(gè), 蘇氨酸(Threonine) 16 個(gè), 酪氨酸(Tyrosine) 4 個(gè)(圖2-C)。位于第83 位、第97 位、第271 位、第276 位、第397 位、第401 位絲氨酸的磷酸化預(yù)測(cè)值均高于0.990, 遠(yuǎn)高于閾值0.5 (圖2-D)。

2.2 TabHLH112-2B 在不同發(fā)育時(shí)期的多個(gè)組織中表達(dá)

為了研究TabHLH112-2B在小麥不同發(fā)育時(shí)期的組織表達(dá)模式, 利用qRT-PCR 檢測(cè)其在幼苗期、拔節(jié)期、抽穗期和開(kāi)花期各組織中的表達(dá)量, 結(jié)果顯示TabHLH112-2B在各組織中均有表達(dá)。在幼苗期,TabHLH112-2B在葉中的表達(dá)量是根和根基中的2 倍(圖3-A); 拔節(jié)期TabHLH112-2B的表達(dá)主要集中在心葉、根和根基中(圖3-B); 抽穗期TabHLH112-2B在根中表達(dá)量最高, 且表達(dá)水平為所有發(fā)育時(shí)期中的最大值(圖3-C); 開(kāi)花期TabHLH112-2B在根中的表達(dá)量最高(圖3-D)。

圖3 小麥TabHLH112-2B 在不同發(fā)育時(shí)期的組織表達(dá)譜Fig.3 Tissue expression pattern of TabHLH112-2B genes at different developmental stages in wheat

2.3 TabHLH112-2B 響應(yīng)激素和脅迫處理

對(duì)TabHLH112-2B起始密碼子上游2000 bp 的啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測(cè), 發(fā)現(xiàn)其中存在大量的順式作用元件, 例如脫落酸(ABA)響應(yīng)元件ABRE, 茉莉酸甲酯(MeJA)響應(yīng)元件CGTCA-motif、TCT-motif, 干旱響應(yīng)元件MYC、MBS, 低溫響應(yīng)元件LTR, 厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件ARE, 以及光響應(yīng)元件I-box、LAMPelement、Sp1 等, 表明TabHLH112-2B的表達(dá)受脫落酸等激素信號(hào)和光信號(hào)的調(diào)節(jié), 并參與干旱和低溫等非生物脅迫應(yīng)答。此外, 還存在與分生組織發(fā)育相關(guān)的順式作用元件CAT-box (圖4-A), 表明該基因可能參與小麥生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)。

圖4 小麥幼苗根中TabHLH112-2B 在不同激素處理下的表達(dá)譜Fig.4 Relative expression pattern of TabHLH112-2B genes in wheat seedling roots under different hormone treatments

為了進(jìn)一步明確TabHLH112-2B響應(yīng)激素信號(hào)和非生物脅迫, 結(jié)合該基因在小麥根中的表達(dá)情況, 利用qRT-PCR 檢測(cè)不同激素處理?xiàng)l件下TabHLH112-2B在根中的表達(dá)譜。結(jié)果顯示, 在ABA 處理24 h 以后,TabHLH112-2B的表達(dá)水平整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 處理72 h 的表達(dá)量最高(圖4-B); 在IAA 處理后的24 h 內(nèi),TabHLH112-2B的表達(dá)受到抑制, 48～72 h 表達(dá)量上升(圖4-C); MeJA 處理1 h 時(shí),TabHLH112-2B的表達(dá)量急劇升高, 處理6 h 后表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖4-D)。

我們還檢測(cè)了小麥幼苗在干旱、高鹽、低溫(4℃)、高溫(34℃)處理?xiàng)l件下TabHLH112-2B的表達(dá)情況, 在PEG 模擬干旱處理1 h 內(nèi)TabHLH112-2B的表達(dá)量顯著下降, 隨后升高(圖5-A)。在鹽脅迫處理下,TabHLH112-2B受到誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá), 在24 h 達(dá)到峰值(圖5-B); 在低溫脅迫處理下,TabHLH112-2B表達(dá)量顯著下調(diào), 72 h 降到最低值(圖5-C); 在高溫脅迫下,TabHLH112-2B表達(dá)量在24 h 顯著上調(diào), 48 h達(dá)到最高值(圖5-D)。因此,TabHLH112-2B的表達(dá)受長(zhǎng)期干旱和高溫脅迫誘導(dǎo), 在高鹽脅迫下被誘導(dǎo),受低溫脅迫抑制。

圖5 不同脅迫處理下小麥幼苗中TabHLH112-2B 的表達(dá)譜Fig.5 Relative expression patterns of TabHLH112-2B genes in seedling stage under abiotic stress conditions in wheat

2.4 基因序列多態(tài)性及其分子標(biāo)記

以小麥群體1 材料的DNA 為模板, 利用特異性引物TabHLH112-2B-F/R、TabHLH112-pro-2B-F/R 分別擴(kuò)增TabHLH112-2B基因序列及啟動(dòng)子序列, 測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)存在2 個(gè)SNP 位點(diǎn), 分別是位于–910 bp 的SNP-910(T/C)和位于?682 bp 的SNP-682(C/T), 這2 個(gè)SNP 緊密連鎖, 組成了2 種單倍型Hap-2B-1 和Hap-2B-2 (圖6-A)。

圖6 TabHLH112-2B 的序列多態(tài)性及其dCAPS 分子標(biāo)記Fig.6 Sequence polymorphism and dCAPS molecular marker of TabHLH112-2B

基于SNP-682, 利用dCAPS Finder 2.0 設(shè)計(jì)了dCAPS 標(biāo)記TabHLH112-682-dCAPS, 通過(guò)引入1 個(gè)錯(cuò)配堿基G, 形成BamH I 酶切位點(diǎn)(G▼GATCC)。經(jīng)過(guò)2 輪PCR 擴(kuò)增, 即先用TabHLH112-pro-2B-F/R 進(jìn)行第1 輪擴(kuò)增, 再利用TabHLH112-2B-BamH I- F/R對(duì)第1 輪PCR 產(chǎn)物進(jìn)行第2 輪擴(kuò)增, 得到長(zhǎng)度為287 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物。利用BamH I 酶切第2 輪PCR 產(chǎn)物,其中Hap-2B-2(T)的PCR 產(chǎn)物可以被酶切為264 bp和23 bp 兩個(gè)片段;Hap-2B-1(C)的PCR 產(chǎn)物不能被切開(kāi), 酶切產(chǎn)物仍為287 bp (圖6-B), 因此可以區(qū)分2 種單倍型。

2.5 每穗小穗數(shù)的優(yōu)異單倍型及其分布

利用開(kāi)發(fā)的TabHLH112-682-dCAPS 標(biāo)記掃描小麥群體2 的基因型, 并與16 種環(huán)境(年份×地點(diǎn)×處理)下的農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示,TabHLH112-2B標(biāo)記與14 種環(huán)境下的每穗小穗數(shù)顯著關(guān)聯(lián)(表3), 具有單倍型Hap-2B-2 基因型的小麥材料每穗小穗數(shù)多于Hap-2B-1 基因型(圖7)。因此,單倍型Hap-2B-2 是在干旱、高溫等多種種植環(huán)境下每穗小穗數(shù)較多的優(yōu)異單倍型。

圖7 TabHLH112-2B 單倍型與每穗小穗數(shù)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Fig.7 Analysis of association between haplotype of TabHLH112-2B and spikelet number per spike

表3 TabHLH112-2B 單倍型與16 種環(huán)境下每穗小穗數(shù)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 3 Association analysis between haplotype of TabHLH112-2B and spikelet number per spike

為了明確TabHLH112-2B兩種單倍型在我國(guó)十大麥區(qū)的地理分布, 以及其在小麥育種歷史中的應(yīng)用情況, 本研究統(tǒng)計(jì)了來(lái)自十大麥區(qū)的157 份地方品種(群體3)和348 份現(xiàn)代育成品種(群體4)中2 種單倍型的頻率。結(jié)果表明: 在地方品種中具有優(yōu)異單倍型Hap-2B-2 的基因型僅占3.8%, 并且僅在3個(gè)麥區(qū)檢測(cè)到Hap-2B-2 基因型, 包括在黃淮冬麥區(qū)(II, 5.7%)、西南冬麥區(qū)(IV, 4.3%)和新疆冬春麥區(qū)(X,30.0%), 其頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單倍型Hap-2B-1 (占比96.2%) (圖8-A)。在現(xiàn)代育成品種中, 具有優(yōu)異單倍型Hap-2B-2 的基因型頻率顯著增加, 提高至11.3%,除華南冬麥區(qū)(V)、北部春麥區(qū)(VII)、青藏春冬麥區(qū)(IX)外, 單倍型Hap-2B-2 在育成品種中的頻率都有較大幅度增加, 表明在我國(guó)的小麥育種歷史中與較多小穗數(shù)相關(guān)的優(yōu)異單倍型Hap-2B-2 受到了一定程度的正向選擇(圖8-B)。

圖8 TabHLH112-2B 優(yōu)異單倍型在我國(guó)小麥育種歷史中的應(yīng)用Fig.8 Application of TabHLH112-2B favorable haplotype in Chinese wheat breeding history

根據(jù)育成年代將群體4 的348 個(gè)品種分為6 組,以觀察隨育種年代推移2 種單倍型的頻率變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示, 從20 世紀(jì)50 至90 年代, 育成品種的每穗小穗數(shù)呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì)(圖8-C), 單倍型Hap-2B-2 的占比從0 增加到15%, 而單倍型Hap-2B-1 的占比從100%下降到85% (圖8-D)。該結(jié)果表明, 在我國(guó)的小麥育種進(jìn)程中, 每穗小穗數(shù)較多的優(yōu)異單倍型Hap-2B-2 經(jīng)歷了正向選擇。

3 討論

bHLH 轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)具有basic Helix-Loop-Helix 結(jié)構(gòu)域的蛋白家族, 在動(dòng)植物中廣泛分布[18]。前人研究表明, bHLH 基因參與小麥的生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫應(yīng)答。在PEG 模擬干旱脅迫和外源ABA 處理下, 過(guò)表達(dá)TabHLH1轉(zhuǎn)基因小麥提高了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累、ROS 穩(wěn)態(tài)和氣孔關(guān)閉能力, 因而增強(qiáng)了對(duì)滲透脅迫的耐受性[19]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族基因TaMYC2 通過(guò)與TaICE41 和TaJAZ7的相互作用, 激活下游抗寒途徑ICE-CBF-COR 模塊表達(dá),TaMYC2過(guò)表達(dá)株系在低溫條件下脯氨酸含量增加, 抗氧化能力提高, 抗凍性增強(qiáng)[20]。本研究通過(guò)順式作用元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TabHLH112-2B啟動(dòng)子區(qū)存在脫落酸、茉莉酸甲酯、干旱脅迫、低溫脅迫等應(yīng)答元件, 以及與分生組織發(fā)育相關(guān)的作用元件。組織表達(dá)模式和激素、非生物脅迫處理下的表達(dá)分析結(jié)果表明,TabHLH112-2B主要在葉和根中發(fā)揮作用,且參與對(duì)ABA、IAA、MeJA 等植物激素和干旱、高鹽、低溫、高溫等非生物脅迫的應(yīng)答。

近年來(lái), 氣候變化導(dǎo)致的溫度、降水等環(huán)境變化已嚴(yán)重影響小麥生產(chǎn)[21]。研究表明, 干旱脅迫損傷了小麥葉片PSII 反應(yīng)中心, 葉片凈光合速率降低,光合作用產(chǎn)物減少, 導(dǎo)致地上部分生物量和產(chǎn)量下降[22]。高溫脅迫破壞小麥的生物膜結(jié)構(gòu), 使旗葉凈光合速率下降, 植株光合機(jī)能減弱, 加速了植株衰老, 穗粒數(shù)及粒重顯著降低[23]。在實(shí)際生產(chǎn)中, 干旱和高溫往往同時(shí)發(fā)生在小麥的開(kāi)花期和/或灌漿期,影響葉片的光合作用, 縮短灌漿持續(xù)時(shí)間, 導(dǎo)致減產(chǎn)[15,24]。因此, 培育抗旱耐高溫的抗逆高產(chǎn)廣適品種是作物育種工作的重要目標(biāo)。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展, 分子標(biāo)記輔助育種成為準(zhǔn)確選育目標(biāo)性狀、提高育種效率的重要手段之一。本研究通過(guò)分析小麥TabHLH112-2B基因組序列多態(tài)性, 發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)存在2 個(gè)SNP, 分為2 種單倍型。基于SNP-682 開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記, 關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)TabHLH112-2B與干旱、高溫等多種環(huán)境下的每穗小穗數(shù)顯著相關(guān), 且單倍型Hap-2B-2 是每穗小穗數(shù)較多的優(yōu)異單倍型。隨著育種年代的推進(jìn), 優(yōu)異單倍型Hap-2B-2受到了正向選擇, 但在現(xiàn)代育成品種中該優(yōu)異單倍型占比偏低, 具有較大的提升空間, 為在正常灌溉、干旱、高溫、干旱高溫并存的多種環(huán)境下培育高產(chǎn)新品種提供了優(yōu)異基因資源。

不同小麥品種啟動(dòng)子區(qū)的序列變異是影響基因表達(dá)、產(chǎn)生顯著表型差異的重要因素[25]。例如, 小麥雄性不育突變體ms2(male-sterile2)是由于雄性不育基因Ms2啟動(dòng)子區(qū)插入了一個(gè)TRIM (末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子微型元件), 該元件的插入激活了Ms2轉(zhuǎn)錄, 導(dǎo)致小麥不育[26]。在TaMOR-B啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)159 bp 的MITE (微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件)插入,導(dǎo)致DNA 甲基化及低水平表達(dá), 該MITE 插入與根干重低和株高矮的表型有關(guān)[27]。與此類(lèi)似, 啟動(dòng)子區(qū)ARFs 結(jié)合位點(diǎn)的變異導(dǎo)致TaPYL4-2A基因的表達(dá)差異, 使得TaPYL4-2A兩種單倍型的株高和穗下節(jié)長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著差異[28]。本研究在TabHLH112-2B的啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到2 個(gè)SNP, 即SNP-682(C/T)和SNP-910(T/C), 經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)SNP-910 的堿基T 與C的差異導(dǎo)致了上游LFY (LEAFY)結(jié)合位點(diǎn)的變異(http://www.softberry.com/)。LFY基因在植物花分生組織形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29], 在擬南芥中, LFY 通過(guò)激活下游AG(AGAMOUS)的表達(dá), 促進(jìn)最內(nèi)層花器官的發(fā)育, 過(guò)表達(dá)LFY可以將所有側(cè)稍轉(zhuǎn)變成花芽[30-31]。因此, LFY 結(jié)合位點(diǎn)的改變可能是導(dǎo)致TabHLH112-2B兩種單倍型每穗小穗數(shù)表型差異的原因, 需要進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

小麥TabHLH112-2B基因在不同發(fā)育時(shí)期各組織中均有表達(dá), 響應(yīng)植物激素信號(hào)和非生物脅迫,在多種環(huán)境下與每穗小穗數(shù)顯著相關(guān),Hap-2B-2 為每穗小穗數(shù)較多的優(yōu)異單倍型, 利用分子標(biāo)記TabHLH112-682-dCAPS 可以選擇優(yōu)異基因型, 提高抗旱耐熱高產(chǎn)品種選育效率。