磷轉(zhuǎn)運蛋白StPHO1.2 提高馬鈴薯耐熱性

李 萬 李 成 程 敏 吳 芳

1 商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院, 陜西商洛 726000; 2 西安潤壯稼農(nóng)業(yè)科技有限公司, 陜西西安 710003; 3 商洛學(xué)院科技處, 陜西商洛 726000; 4 商洛學(xué)院國內(nèi)合作與校友工作處, 陜西商洛 726000

磷元素(Pi)是植物不易獲取的、天然土壤中稀有的營養(yǎng)元素之一[1]。研究表明, 植物體內(nèi)的分解作用、呼吸作用、光合作用、物質(zhì)運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等理化反應(yīng)都離不開磷元素的參與, 其對植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性具有重要影響[2]。植物對磷元素的獲取主要通過磷轉(zhuǎn)運蛋白(phosphate transporters)實現(xiàn), 磷轉(zhuǎn)運蛋白能夠通過增強植物對磷素營養(yǎng)的吸收和轉(zhuǎn)運, 為植物提供充足磷元素, 從而促進植物的生長發(fā)育, 提高產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性。

磷轉(zhuǎn)運蛋白包括6 類: PHT1、PHT2、PHT3、PHT4、PHT5 和PHO1[3], PHT1 亞家族是高親和力轉(zhuǎn)運蛋白。擬南芥PHT1 亞家族PHT1;1、PHT1;2、PHT1;6和PHT1;8等4 個基因的表達量降低會導(dǎo)致植物對磷的攝取和轉(zhuǎn)運能力下降[4-5]; 在磷元素缺乏時, 有5 個基因(PHT1;1、PHT1;4、PHT1;5、PHT1;8和PHT1;9)在根部的表達量上調(diào)[6]。缺磷或磷充足條件下, 水稻PHT1 亞家族基因OsPT8的沉默會降低其對磷元素的攝取和轉(zhuǎn)運, 降低結(jié)實率[7]。在水稻中過表達番茄PHT1 家族基因LePT1和LePT2, 在缺磷環(huán)境下, 水稻根系和葉肉細胞中LePT1和LePT2的表達量上調(diào), 增強水稻對磷元素的吸收, 促進植株生長; 磷過量條件下, 過表達LePT1和LePT2會抑制水稻生長發(fā)育, 降低株高, 減少分蘗[8]。這些結(jié)果均表明PHT1 亞家族在根系統(tǒng)從土壤獲取磷過程中的關(guān)鍵作用。PHT2、PHT3 和PHT4 這3 個亞家族成員都是低親和力轉(zhuǎn)運蛋白[3]。PHT2 亞家族成員對磷元素在植物體內(nèi)的分配和光合作用有影響, 例如,在小麥中抑制PHT2 亞家族成員的表達, 能夠降低小麥葉片和葉綠體中的磷元素濃度, 且無論磷元素缺乏或充足, 該小麥植株都呈現(xiàn)出矮小、光合能力弱等表型[9]。大豆GmPHT2;1和GmPHT2;2基因具有響應(yīng)低磷脅迫的能力, 在低磷脅迫下, 大豆GmPHT2;2的表達量顯著高于GmPHT2;1; 此外,GmPHT2;1可能還在響應(yīng)低溫脅迫中發(fā)揮著一定的功能[10]。線粒體合成的ATP 進入其他細胞器時需要磷元素的協(xié)助, PHT3 亞家族則負責(zé)介導(dǎo)調(diào)控該部分磷元素的轉(zhuǎn)運[11]。過表達擬南芥PHT3 亞家族成員PHT3;3的植株對鹽脅迫更為敏感[12]。PHT4 亞家族對酵母中的磷元素轉(zhuǎn)運具有高度特異性, 同時也介導(dǎo)了植物細胞質(zhì)和葉綠體、異養(yǎng)質(zhì)體和高爾基體之間的磷元素的轉(zhuǎn)運[2-3]。在馬鈴薯中, 過表達PHT4亞家族基因StPHT4;2的轉(zhuǎn)基因植株, 其塊莖產(chǎn)量更高, 類胡蘿卜素含量也更高, 表明StPHT4;2 可能與馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)[13]。PHT5 亞家族能夠增加植物耐低磷脅迫的能力[2-3]。在甘藍型油菜中, 基因BnPHT5;1a和BnPHT5;1b均影響油菜磷穩(wěn)態(tài), 但BnPHT5;1b適應(yīng)磷波動能力顯著降低,BnPHT5;1a則與耐低磷脅迫能力密切相關(guān)[14]。PHO1 亞家族負責(zé)磷酸鹽的攝取和分配, 參與磷酸鹽饑餓狀態(tài)下的信號傳導(dǎo)[15-17]。過表達草莓 PHO1 亞家族基因FaPHO1;H9的擬南芥植株磷含量顯著高于野生型植株, 表明FaPHO1;H9在磷轉(zhuǎn)運中起作用[18]。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn), 馬鈴薯磷轉(zhuǎn)運蛋白PHO1 亞家族的StPHO1.1、StPHO1.2 和StPHO1.3 對磷元素的吸收和轉(zhuǎn)運, 以及馬鈴薯耐熱性具有重要作用。

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是小麥、水稻和玉米之后的第四大糧食作物, 高溫易使馬鈴薯減產(chǎn)甚至絕收[20]。本研究以提高馬鈴薯耐熱性為出發(fā)點,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo), 在馬鈴薯中過表達基因StPHO1.2,比較轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系在高溫脅迫下的生長差異, 闡明StPHO1.2 對馬鈴薯生長和耐熱性的影響;利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補(BiFC)技術(shù)篩選StPHO1.2 的互作蛋白, 為進一步探究StPHO1.2 影響馬鈴薯耐熱性的分子機制奠定基礎(chǔ), 對培育出耐高溫、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的馬鈴薯新品種提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建

過表達載體pBI121 和熒光表達載體p1300-RFP由本課題組保存, 酵母雙雜交相關(guān)載體pNubG-Fe65、pTSU2-APP、pPR3N、pOST1-NubI、pBT3-STE、pBT3-SUC、pBT3-N、pBT3-C, BiFC 載體NY、CY, 以及膜系統(tǒng)文庫質(zhì)粒均由西北農(nóng)林科技大學(xué)吳云鋒教授提供。

從Phytozome (https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)下載基因StPHO1.2序列(PGSC0003DMT400044207),設(shè)計特異性引物(表1), 通過PCR 從馬鈴薯cDNA 中擴增基因StPHO1.2, 根據(jù)北京全式金生物技術(shù)有限公司的一步法無縫克隆試劑盒(CU201)操作說明書,構(gòu)建相關(guān)載體。

1.2 構(gòu)建過表達StPHO1.2 的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯轉(zhuǎn)化 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建過表達StPHO1.2的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系。試驗所用馬鈴薯品種為“Desiree” (野生型, 對照), 用于轉(zhuǎn)化的外植體為馬鈴薯葉片。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制參照張超[21]的方法。

轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pBI121-StPHO1.2 至根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101, 篩選陽性克隆并置于含有抗生素(Kan、Rif)的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(20 mL), 待菌液OD600為0.6～0.8 時, 離心收菌, 使用同體積無抗性LB 液體培養(yǎng)基重懸菌體, 待用。將生長良好的馬鈴薯葉片置于含有20%蔗糖的MS 液體培養(yǎng)基中(MS2), 用手術(shù)刀切除葉柄和葉尖, 在葉片背面劃出數(shù)道傷口并加入待用菌液, 輕輕搖晃5～10 min 后,暗培養(yǎng)2 d。轉(zhuǎn)移暗培養(yǎng)完成的轉(zhuǎn)化葉片至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng), 10 d 后轉(zhuǎn)移至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(每7～10 d 更換一次), 約4～6 周會形成芽。待芽長至1～3 cm 時剪下置于含有抗生素(Kan amycin)的MS2 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 陽性轉(zhuǎn)基因株系鑒定 待芽組織生長至完整植株時, 采用CTAB 法[22]提取DNA, 設(shè)計擴增抗性標(biāo)記基因(Kan+)的特異性引物(KanF: 5′-GCTATG ACTGGGCACAACAG-3′; KanR: 5′-ATACCGTAA AGCACGAGGAA-3′), 利用PCR 初步鑒定陽性植株。提取初步鑒定的陽性植株的RNA 并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA, 設(shè)計定量引物(DLStPHO1.2F: 5′-GCCAAGT CGATGCAATTCCT-3′; DLStPHO1.2R: 5′-GAGGAA GTAGAAGCGCGTTG-3′), 以ubi3為內(nèi)參基因[23],對轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系中StPHO1.2的基因表達量進行定量分析[24]。

1.3 StPHO1.2 對馬鈴薯耐熱性的影響

利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)擴繁轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系組培苗, 待生長4～6 周后, 選擇長勢一致的植株分別置于高溫(35℃)和常溫(22 ℃± 1 ℃)條件下培養(yǎng), 每種溫度下的轉(zhuǎn)基因或野生型植株各9 株。將不同溫度下培養(yǎng)的9 株植株, 平均分成3 組, 分別用無磷(0 mmol L–1Pi)、缺磷(0.1 mmol L–1Pi)和富含磷(1.0 mmol L–1Pi)的Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)(青島海博生物技術(shù)有限公司, HB8870-3、HB8870-2、HB8870-1), 3 周后觀察生長差異。

1.4 StPHO1.2 的互作蛋白篩選

1.4.1 StPHO1.2 的亞細胞定位 種植本氏煙草,待其生長4～6 周后用于亞細胞定位試驗。轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒p1300-RFP-StPHO1.2 至根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101, 篩選陽性克隆并置于10 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h 左右, 離心收菌。用重懸液(含5%蔗糖和0.02% silwet L-77)重懸菌體并調(diào)整OD600值為1.0, 黑暗中放置3 h, 備用。用針頭在煙草葉片背面輕觸產(chǎn)生創(chuàng)口, 將準(zhǔn)備好的菌液通過創(chuàng)口注射進煙草, 覆膜保濕培養(yǎng)2 d, 在激光共聚焦掃描顯微鏡下(日本Olympus, IX83-FV1200)觀察熒光。

1.4.2 酵母雙雜交篩選互作蛋白 按照表2 組合共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細胞NMY51, 分別涂布于SD-TL培養(yǎng)基(0.67% YNB, 2%葡萄糖, 0.064% SD-Trp/-Leu,1.5%瓊脂粉)和SD-TLHA 培養(yǎng)基(0.67% YNB, 2%葡萄糖, 0.06% SD-Trp/-Leu/-His/-Ade, 1.5%瓊脂粉)培養(yǎng), 根據(jù)生長情況篩選出最適合的載體(本試驗最適合的載體為pBT3-STE)。

表2 載體篩選Table 2 The selection of vector

YNB (無氨基酵母氮源培養(yǎng)基, Y8040)購買于北京索萊寶科技有限公司, SD-Trp/-Leu (色氨酸和亮氨酸氨基酸缺失混合物, 630417)和 SD-Trp/-Leu/-His/-Ade (色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤氨基酸缺失混合物, 630428)購買于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pBT3-STE-StPHO1.2 至酵母感受態(tài)細胞NMY51, 篩選陽性克隆后制備含有pBT3-STE-StPHO1.2 的酵母感受態(tài)細胞[25], 取10 μL 膜系統(tǒng)文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細胞, 涂布于SD-TLHA培養(yǎng)基, 2～3 d 后, 挑取單克隆菌落轉(zhuǎn)移至SD-TLHA培養(yǎng)基(含X-α-Gal)再培養(yǎng)3 d, 選取顯藍色的菌落,PCR 鑒定并送于西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測序。

利用NCBI 網(wǎng)站序列比對分析測序結(jié)果, 構(gòu)建該序列與 pPR3N 的重組質(zhì)粒, 并與 pBT3-STEStPHO1.2 共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細胞NYM51。菌液涂布于SD-TL 和SD-TLHA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d, 挑取單克隆菌落移至SD-TLHA 培養(yǎng)基(含X-α-Gal), 觀察顯色情況。

1.4.3 BiFC 驗證蛋白互作 構(gòu)建互作蛋白的CY 載體, 與NY-StPHO1.2 分別轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞 GV3101, 參照陸孫杰的方法[19]進行BiFC 驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建過表達StPHO1.2 的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系

提取轉(zhuǎn)化植株和野生型植株(Desiree)的基因組DNA, 利用抗性標(biāo)記基因(Kan+)的特異性引物進行PCR 擴增(圖1)。結(jié)果顯示, 從pBI121 空載質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化StPHO1.2的植株基因組DNA 均擴增得到600 bp 左右的條帶, 但Desiree 基因組DNA 并未擴增出條帶, 表明pBI121-StPHO1.2 成功轉(zhuǎn)入了Desiree。

圖1 抗性基因PCR 鑒定陽性轉(zhuǎn)基因株系Fig.1 Identification of positive transgenic lines of resistance gene by PCR

提取轉(zhuǎn)化植株和Desiree 的RNA 并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA, 利用定量引物和ubi3內(nèi)參基因分析StPHO1.2的基因表達量變化。結(jié)果顯示, 相比于Desiree, 轉(zhuǎn)化植株中StPHO1.2的基因表達量升高了10 倍以上, 表明StPHO1.2成功在Desiree 中過表達(僅展示StPHO1.2基因表達量最高的陽性轉(zhuǎn)基因植株) (圖2)。將過表達StPHO1.2的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系命名為StPHO1.2-Desiree。

圖2 定量PCR 鑒定陽性轉(zhuǎn)基因株系Fig.2 Identification of positive transgenic lines by qPCR

2.2 StPHO1.2 對馬鈴薯耐熱性的影響

無磷(0 mmol L–1Pi)條件下(圖3-A), 高溫(35 ℃)和常溫(22℃±1 ℃)下的StPHO1.2-Desiree 和Desiree的長勢無顯著差異。缺磷(0.1 mmol L–1Pi)條件下(圖3-B)和富含磷(1.0 mmol L–1Pi)條件下(圖3-C), 高溫和常溫下的 StPHO1.2-Desiree 的長勢均優(yōu)于Desiree。此外, 相比于無磷和缺磷條件, 磷元素充足時, StPHO1.2-Desiree 和Desiree 具有更為良好的生長。因此, 過表達StPHO1.2能夠增強馬鈴薯耐熱性,且磷元素越充足, 轉(zhuǎn)基因植株生長的越好。

圖3 StPHO1.2-Desiree 和Desiree 的表型分析Fig.3 Phenotypic analysis of StPHO1.2-Desiree and Desiree

2.3 StPHO1.2 的互作蛋白篩選

2.3.1StPHO1.2的亞細胞定位及酵母雙雜交篩選互作蛋白 將OD600為1.0 的含有重組質(zhì)粒p1300-RFP-StPHO1.2 的農(nóng)桿菌菌液注射進本氏煙草葉片中, 保濕培養(yǎng)2 d 后, 在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察熒光。結(jié)果顯示, 陰性對照組的煙草熒光信號雜亂無規(guī)則, 試驗組煙草細胞膜上可見熒光信號, 表明StPHO1.2在細胞膜上表達(圖4)。

圖4 StPHO1.2 的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of StPHO1.2

由圖5 可知, 共轉(zhuǎn)pNubG-Fe65 和pTSU2-APP(陽性對照)的 NMY51 酵母菌株能在 SD-TL 和SD-TLHA 培養(yǎng)基上良好生長。NMY51 (陰性對照)在SD-TL 和SD-TLHA 培養(yǎng)基上均無法生長。共轉(zhuǎn)pPR3N 與重組質(zhì)粒pBT3-STE-StPHO1.2 (自激活檢測)的NMY51 能在SD-TL 培養(yǎng)基上生長, 但無法在SD-TLHA 培養(yǎng)基上生長。共轉(zhuǎn) pOST1-NubI 和pBT3-STE-StPHO1.2 (功能檢測)的NMY51 在SD-TL和SD-TLHA 培養(yǎng)基上均能正常生長。表明重組質(zhì)粒pBT3-STE-StPHO1.2 功能良好, 且無自激活現(xiàn)象,因此, 選擇pBT3-STE-StPHO1.2 進行酵母篩庫試驗。

圖5 酵母雙雜質(zhì)粒的篩選Fig.5 Screening of vector for yeast double-hybrid experiment

轉(zhuǎn)化pBT3-STE-StPHO1.2至NMY51, 挑取陽性克隆并制備含有重組質(zhì)粒pBT3-STE-StPHO1.2 的酵母感受態(tài), 然后轉(zhuǎn)化膜系統(tǒng)文庫質(zhì)粒至該感受態(tài)中,挑取在SD-TLHA 培養(yǎng)基上生長的單克隆菌落, 移至新鮮的SD-TLHA 培養(yǎng)基(含X-α-Gal)上生長, 結(jié)果如圖所示(圖6)。顯藍色的代表該蛋白與StPHO1.2具有強相互作用。經(jīng)過PCR、測序、序列比對分析發(fā)現(xiàn), 鈣離子轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白(StCAX1, PGSC0003 DMT400030772)和光系統(tǒng) II 蛋白亞基(StPsbR,PGSC0003DMT400057257)與StPHO1.2 互作。

圖6 酵母雙雜交篩選StPHO1.2 的互作蛋白Fig.6 Screening of interacting proteins of StPHO1.2 by yeast double-hybrid

構(gòu)建重組質(zhì)粒 pPR3N-StCAX1 和 pPR3NStPsbR, 分別與pBT3-STE-StPHO1.2 共轉(zhuǎn)NMY51酵母感受態(tài)。通過PCR 鑒定共轉(zhuǎn)成功的陽性酵母菌,挑取該菌斑溶于20 μL 無菌生理鹽水, 點樣3 μL 于SD-TLHA (含X-α-Gal)培養(yǎng)基上生長。結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)化后的NMY51 酵母菌能在SD-TLHA 培養(yǎng)基上生長,且能與 X-α-Gal 反應(yīng)顯現(xiàn)藍色, 表明 StCAX1 和StPsbR 均與StPHO1.2 互作(圖7)。

圖7 StPHO1.2 與互作蛋白的“一對一”驗證Fig.7 “One-to-one” verification of StPHO1.2 and interacting proteins

2.3.2 BiFC 驗證蛋白互作 構(gòu)建重組質(zhì)粒CY-StCAX1 和CY-StPsbR, 分別與NY-StPHO1.2 在本氏煙草葉片中進行BiFC 驗證(圖8)。陰性對照(NY+CY、CY-StCAX1+NY、CY-StPsbR+NY 和CY+NY-StPHO1.2)無互作, 故熒光信號雜亂且不規(guī)則;StCAX1 和StPHO1.2、StPsbR 和StPHO1.2 均互作,因此, CY-StCAX1+NY-StPHO1.2 和CY-StPsbR+NYStPHO1.2 共注射煙草葉片后, 在顯微鏡下能夠觀察到熒光信號。結(jié)果顯示, 細胞膜和細胞質(zhì)中都有熒光信號出現(xiàn), 表明StCAX1 和StPsbR 均與StPHO1.2互作。

圖8 StPHO1.2 與互作蛋白的BiFC 驗證Fig.8 BiFC identification of StPHO1.2 and interacting proteins

3 討論

植物在磷元素缺乏環(huán)境下, 其多個理化指標(biāo)會發(fā)生變化, 從而影響到生長發(fā)育。磷元素是光合作用中不可缺少的底物或調(diào)節(jié)物, 缺磷則會嚴重影響植物的光合作用[26], 導(dǎo)致光合速率下降, 從而減少生長量、根系結(jié)構(gòu)等[27]。水稻在磷元素缺乏時, 碳水化合物更多地運輸至根部, 從而增加根冠比[28],加劇膜脂過氧化程度加劇[29]。大豆在缺磷條件下,通過光合作用固定的碳更多的轉(zhuǎn)化成為了淀粉, 運輸至莖和根部的可溶性糖含量則急劇減少[30], 同時抗逆性明顯受到影響, 比如細胞膜透性增加, MDA含量升高, 保護酶活性下降等[31]。

擬南芥 PHO1 亞家族包含 11 個成員(PHO1,PHO1;H1-H10), 缺失PHO1基因的擬南芥表現(xiàn)出典型缺磷表型[32], 但通過過表達PHO1或PHO1;H1能夠修復(fù), 使擬南芥生長正常[33]。PHO1;H3 具有磷轉(zhuǎn)運的功能[34]; PHO1;H10 與生物和非生物脅迫有關(guān)[35-36]。在馬鈴薯中,StPHT1;7的過表達會降低馬鈴薯耐旱性[37], PHO1 亞家族成員不僅與磷轉(zhuǎn)運有關(guān), 也涉及馬鈴薯的抗逆過程[19,38]。本研究中, 無磷條件下, StPHO1.2-Desiree 和Desiree 的生長都受到了明顯限制; 缺磷條件下, StPHO1.2-Desiree 能夠正常生長, 但 Desiree 生長受限; 富含磷條件下,StPHO1.2-Desiree 和Desiree 均能正常生長, 既表明磷元素對馬鈴薯生長的重要性, 也表明過表達StPHO1.2能夠影響馬鈴薯對磷元素的吸收和轉(zhuǎn)運,促進馬鈴薯生長, 增強馬鈴薯耐熱性, 這些結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

在高溫脅迫下, 植物體內(nèi)會通過一系列理化反應(yīng)保護自身免受高溫侵害, 比如增加細胞膜流動性,增強抗氧化酶活性和光合速率, 產(chǎn)生脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 以及產(chǎn)生熱休克蛋白等應(yīng)激蛋白[39]。本研究發(fā)現(xiàn), StPsbR 是光合系統(tǒng)II 蛋白亞基, 與植物光合作用相關(guān); StCAX1 與鈣離子的轉(zhuǎn)運有關(guān), 鈣離子作為第二信使, 其濃度會在高溫脅迫等逆境環(huán)境下升高, 對植物的生長發(fā)育具有十分重要的作用[40]。因此, StPHO1.2 與StCAX1 和StPsbR互作, 表明StPHO1.2 可能會影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或光合作用, 從而對馬鈴薯耐熱性、生長發(fā)育產(chǎn)生影響, 這和磷元素的生理功能是一致的[2]。除StCAX1 和StPsbR外, 本研究還發(fā)現(xiàn)StPHO1.2 與抗氧化反應(yīng)有關(guān)的Glu 蛋白(谷氧還蛋白, PGSC0003DMT400020793)互作(未展示圖片), 表明StPHO1.2 還可能通過提高馬鈴薯的抗氧化能力, 從而增強抵御高溫脅迫的能力,但該互作仍需進一步驗證。

綜上所述, 富含磷條件下, StPHO1.2 可能通過影響馬鈴薯光合作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗氧化能力等, 增強馬鈴薯耐熱性, 促進馬鈴薯生長。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一系列重組質(zhì)粒, 首先利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯轉(zhuǎn)化技術(shù), 在野生型馬鈴薯(Desiree)中過表達StPHO1.2, 鑒定獲得轉(zhuǎn)基因株系(StPHO1.2-Desiree)。其次, 分別在高溫(35 ℃)和常溫(22℃±1 ℃)環(huán)境下, 比較StPHO1.2-Desiree 和Desiree 在無磷(0 mmol L–1Pi)、缺磷(0.1 mmol L–1Pi)和富含磷(1.0 mmol L–1Pi)條件下的生長情況, 結(jié)果表明, 在富磷條件下, 過表達StPHO1.2能夠增強馬鈴薯耐熱性,對馬鈴薯生長也具有一定的促進作用。對StPHO1.2的亞細胞定位結(jié)果顯示, StPHO1.2 在細胞膜上表達,因此, 選擇膜系統(tǒng)文庫質(zhì)粒篩選StPHO1.2 的互作蛋白; 對酵母雙雜交載體篩選后發(fā)現(xiàn), pBT3-STE 最符合本研究需求。最后, 通過酵母雙雜交試驗, 證明StPHO1.2 與鈣離子轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白(StCAX1)和光系統(tǒng)II 蛋白亞基(StPsbR)均有相互作用, 并通過BiFC技術(shù)進一步驗證了該互作。以上結(jié)果為深入理解磷轉(zhuǎn)運蛋白的功能及響應(yīng)高溫脅迫的分子機制機理提供了參考, 對培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強的馬鈴薯新品種具有促進作用。