不同磷脅迫處理轉(zhuǎn)OsPHR2 小麥的轉(zhuǎn)錄組學分析

李 艷 方宇輝 王永霞 彭超軍 華 夏 齊學禮 胡 琳 許為鋼

河南省作物分子育種研究院 / 河南省麥類種質(zhì)資源創(chuàng)新與改良重點實驗室 / 神農(nóng)種業(yè)實驗室, 河南鄭州 450002

磷是植物細胞的重要組成成分, 主要存在于DNA、RNA、磷脂、腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP 及AMP)的結(jié)構(gòu)中[1-3]。磷在植物體內(nèi)參與糖酵解、脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、氧化還原反應等多個代謝過程[4-5]。磷肥施入土壤, 作物當季磷肥利用率較低, 大部分容易被含有金屬元素的土壤礦物及有機物質(zhì)吸附固定, 從而降低了土壤中磷肥的有效性。土壤有效磷偏低是全球普遍存在的問題, 施用磷肥對農(nóng)作物生產(chǎn)起到極其重要的作用, 但大量磷肥施入土壤后作物當季利用率僅為10%～20%[6], 土壤中的磷素和施入土壤的磷80%被固定, 變?yōu)殡y于被植物吸收的難溶態(tài)和有機態(tài)[7], 同時對環(huán)境亦產(chǎn)生負面影響, 如水生系統(tǒng)的富營養(yǎng)化和生物多樣性的喪失[8-9]。磷脅迫信號在植物中有特異的調(diào)控途徑[10]。植物在長期的進化過程中形成了各種適應磷脅迫的機制[11-13], 包括根構(gòu)型的改變、生理代謝適應等。另外通過上調(diào)表達高親和磷轉(zhuǎn)運子, 改變植物體內(nèi)磷參與的代謝活動[14-15], 以此提高對可溶性磷的吸收利用效率以及對固定態(tài)磷的吸收能力。不同作物和同一作物不同基因型對磷的吸收和利用效率上存在著明顯的遺傳差異[16-18]。小麥是世界和我國主要的糧食作物之一, 為世界約40%人口的主糧, 發(fā)掘利用磷高效吸收利用基因, 研究磷高效基因在小麥中的作用機制, 對高產(chǎn)養(yǎng)分高效小麥新品種培育和小麥生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

植物挖掘自身潛力、充分活化和利用潛在磷,是自身進行磷饑餓拯救的重要機制, 這些機制本質(zhì)是磷饑餓誘導的一系列基因的協(xié)同表達[7]。磷饑餓條件下, 植物通過調(diào)控一系列缺磷誘導表達基因來增加磷的吸收利用效率[19]。通過對擬南芥不同磷處理濃度不同時間點的特異基因的表達分析, 結(jié)果表明分別有612 個和254 個磷響應基因被協(xié)同誘導和抑制, 這些基因參與各種代謝途徑, 如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、離子運輸?shù)萚20]。小麥磷饑餓誘導的蛋白質(zhì)被定位于質(zhì)外體, 磷脅迫下小麥根尖糖酵解酶含量顯著增加[21], 總干重降低、根冠比增加[22]。利用基因芯片分析Atphr1和Atphr1/Atphl1突變體, 結(jié)果表明絕大部分的缺磷響應基因受到AtPHR1和AtPHL1的調(diào)控, 這些基因涉及到磷的吸收轉(zhuǎn)運、磷脂代謝、信號轉(zhuǎn)導等[23]。AtPHR1在植物中具有功能的保守性,它在水稻中的同源基因OsPHR2是水稻調(diào)控缺磷脅迫響應的中心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。AtPHR1/OsPHR2過表達能有效提高植株的磷吸收水平, 同時激活下游一系列PSI基因的表達。低磷脅迫下,OsPHR2過表達可改變植株根構(gòu)型, 增強磷吸收能力[24]。OsPHR2在水稻中的作用機制研究已較深入, 但關(guān)于其在小麥中的研究報道甚少。前期研究已將OsPHR2導入普通小麥, 獲得了磷吸收利用效率顯著提高的轉(zhuǎn)基因小麥純系, 并對轉(zhuǎn)OsPHR2小麥進行了根表型、磷吸收特性和產(chǎn)量性狀分析, 結(jié)果表明長至一葉一心的幼苗在營養(yǎng)液中缺磷處理10 d 轉(zhuǎn)基因小麥的最大根長、根系總長度、根冠比和根系體積均顯著高于受體對照; 田間低磷處理下, 苗期、拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期和成熟期轉(zhuǎn)基因小麥植株地上部磷積累量亦均顯著高于對照, 2 個轉(zhuǎn)OsPHR2小麥株系產(chǎn)量平均較受體對照增產(chǎn) 6.29%[25]。但目前關(guān)于OsPHR2提高小麥磷吸收利用效率的分子機制還不清楚。本研究以轉(zhuǎn)OsPHR2小麥純系為材料, 利用RNA-seq 對低磷脅迫處理不同時間點的差異表達基因進行分析, 揭示OsPHR2提高小麥磷吸收利用效率的分子機制, 為小麥磷高效遺傳改良研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理方法

磷吸收利用效率顯著提高的轉(zhuǎn)OsPHR2小麥純合株系OsT5-28[25]和受體鄭麥0856 均由河南省作物分子育種研究院小麥分子育種團隊提供。

利用水培試驗, 水培至四葉一心時進行低磷脅迫處理(低磷營養(yǎng)液中磷的濃度為正常處理營養(yǎng)液濃度的1/30, 其他成分不變), 設置3 次生物學重復,分別在低磷脅迫(0、6、24 和72 h) 4 個時間點, 對轉(zhuǎn)OsPHR2小麥株系OsT5-28 和對照鄭麥0856 的根部和葉片取樣, 置于–70℃冰箱保存。

1.2 文庫構(gòu)建與質(zhì)檢

采用TRIzol 法提取小麥根部和葉片的RNA, 并進行 RNA 純度和完整性等檢測。利用試劑盒(Illumina 的NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit)構(gòu)建文庫。通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA 尾的mRNA, 以片段化的mRNA 為模版, 隨機寡核苷酸為引物, 在M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA 第一條鏈, 在DNA polymerase I 體系下, 以dNTPs 為原料合成cDNA 第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA 經(jīng)過末端修復、加A 尾并連接測序接頭, 用AMPure XP beads 篩選200 bp 左右的cDNA 進行PCR 擴增,純化PCR 產(chǎn)物, 最終獲得文庫。

文庫構(gòu)建完成后, 先使用Qubit2.0 Fluorometer進行初步定量, 稀釋文庫至1.5 ng μL–1, 隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer 對文庫的insert size 進行檢測, insert size 符合預期后, 利用qRT-PCR 對文庫有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度高于2 nmol L–1),以確保文庫質(zhì)量。庫檢合格后進行Illumina 測序, 并產(chǎn)生150 bp 配對末端讀數(shù), 測序儀通過捕獲熒光信號, 最終獲得待測片段的序列信息。

1.3 統(tǒng)計分析

首先對原始數(shù)據(jù)進行過濾, 確保數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性。使用HISAT2 v2.0.5 構(gòu)建參考基因組的索引, 并將配對末端過濾后的數(shù)據(jù)與參考基因組比對。采用StringTie 進行新基因預測。

利用 featureCounts 計算映射到每個基因的讀數(shù)。根據(jù)基因的長度計算每個基因的FPKM, 并計算映射到該基因的讀數(shù)。利用DESeq2 R 軟件(1.16.1)進行兩個比較組合之間的差異表達分析(每組3 次生物學重復)。使用Benjamini 和Hochberg 方法調(diào)整P值, 通過DESeq2 發(fā)現(xiàn)調(diào)整的P值<0.01 的基因被分配為差異表達的基因, 校正后的P值以及|log2(Fold Change)|>1 作為顯著差異表達的閾值。利用clusterProfiler R 軟件實現(xiàn)差異表達基因的GO 富集和KEGG 分析。

1.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

利用RNA-Seq 技術(shù), 對轉(zhuǎn)基因株系OsT5-28 和對照鄭麥0856 進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。低磷脅迫處理0、6、24 和72 h 轉(zhuǎn)基因系OsT5-28 葉片樣品分別命名為L_0 h_T、L_6 h_T、L_24 h_T 和L_72 h_T, 其根系樣品分別命名為R_0 h_T、R_6 h_T、R_24 h_T和R_72 h_T; 低磷脅迫處理0、6、24 和72 h, 對照鄭麥0856 葉片樣品分別命名為L_0 h_C、L_6 h_C、L_24 h_C 和L_72 h_C, 其根系樣品分別命名為R_0 h_C、R_6 h_C、R_24 h_C 和R_72 h_C。

利用雙末端測序法, 使用Illumina 高通量測序平臺(HiSeq2000)對所有合格RNA 樣品進行測序和特異性文庫構(gòu)建。去除帶接頭的reads、含N (無法確定堿基信息) reads、低質(zhì)量reads 后, 各樣品的Clean reads 在6.79～10.53 G 之間, 平均Clean reads為8.38 G, 均在6 G 以上。各樣品的Error rate 在0.02%～0.03%之間, GC 含量在50.84%～57.03%之間,Q20 和Q30 值均在90%以上。通過對所有樣本的基因表達值進行主成分分析, 結(jié)果顯示組間樣本較分散, 組內(nèi)除了L_0 h_C1 和R_0 h_C3 較分散之外, 其余樣本3 個重復之間均較好地聚在一起(圖1)。說明所有樣品質(zhì)量均滿足轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析要求, 可進行可靠性分析。

圖1 不同磷處理小麥RNA-Seq 數(shù)據(jù)的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of RNA-Seq data from wheat under different phosphorus treatments

1.5 qRT-PCR 分析

隨機挑取根部5 個DEG 和葉片5 個DEG, 分別在3 個處理0、6 和24 h 的表達模式進行qRT-PCR驗證。以Actin作為內(nèi)參, 基因特異引物見表1。利用MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase (莫納生物科技有限公司)對構(gòu)建文庫的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 利用MonAmp ChemoHS qPCR Mix (莫納生物科技有限公司)進行qRT-PCR 分析。反應體系為20 μmol L–1, 反應條件為95℃ 10 min; 95℃ 10 s,63℃ 30 s, 38 個循環(huán), 95℃ 15 s, 60℃ 1 min。采用2–ΔΔCt法計算基因的相對表達量。利用Pearson’s correlation coefficient (PCC)計算2 組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)。

表1 qRT-PCR 引物信息Table 1 Information of qRT-PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 差異基因表達分析

2.1.1 根部差異基因表達分析 不同處理時間之間相比, 低磷脅迫處理0 h, 轉(zhuǎn)基因系OsT5-28 和對照鄭麥0856 的根部差異表達基因(differentially expression gene, DEG)數(shù)量最多, 共有6891 個DEG, 其中2147 個上調(diào)表達和4744 個下調(diào)表達, 上調(diào)表達基因占31.16%。低磷脅迫后, DEG 數(shù)量隨處理時間的延長呈先降低后增加的趨勢。低磷脅迫處理6、24 和72 h 的DEG 數(shù)量分別比0 h 下降了63.79%、91.64%和 86.68%, 6、24 和 72 h 上調(diào)基因占比分別為64.73%、67.01%和50.00%。脅迫處理6 h 的DEG數(shù)量大于24 h 和72 h, 脅迫6 h 的DEG 共有2495 個,其中1615 個上調(diào)表達和880 個下調(diào)表達, 上調(diào)表達基因占比大于0 h (圖2-A)。韋恩圖分析顯示, 磷脅迫處理0、6、24 和72 h 轉(zhuǎn)基因系OsT5-28 及對照鄭麥0856 根部共有22 個共同表達的差異基因(圖2-B)。

圖2 轉(zhuǎn)基因小麥與對照不同比較組合根部差異表達基因分析Fig.2 DEGs in roots between transgenic wheat and control in different comparative combinations

分析受體對照根部低磷脅迫6 h 與0 h 比較的DEG, 結(jié)果顯示受體對照低磷脅迫6 h 后有13,370個DEG, 其中5864 個上調(diào)表達和7506 個下調(diào)表達,上調(diào)表達基因占43.86% (圖3)。

圖3 受體對照低磷脅迫6 h 與0 h 的根部差異表達基因分析Fig.3 DEGs in roots between 6 hours and 0 hour under low phosphorus in control

2.1.2 葉片差異基因表達分析 不同處理時間之間相比, 低磷脅迫處理72 h, 轉(zhuǎn)基因系OsT5-28 和對照鄭麥0856 的DEG 數(shù)量最多, 共有2071 個DEG, 其中1519 個上調(diào)表達和552 個下調(diào)表達, 上調(diào)表達基因占73.35%。低磷脅迫處理0、6 和24 h 的DEG 數(shù)量分別比72 h 低76.20%、77.21%和83.44%, 0、6 和24 h 上調(diào)基因占比分別為33.06%、38.77%和16.62%。脅迫處理0 h 的DEG 數(shù)量大于6 h 和24 h, 0 h 的DEG 共有493 個, 其中163 個上調(diào)表達和330 個下調(diào)表達, 上調(diào)表達基因占比小于72 h (圖4-A)。韋恩圖分析顯示, 磷脅迫處理0、6、24 和72 h 轉(zhuǎn)基因系OsT5-28 及對照鄭麥0856 葉片有9 個共同表達的差異基因(圖4-B)。

圖4 轉(zhuǎn)基因小麥與對照不同比較組合葉片差異表達基因分析Fig.4 DEGs in leaves between transgenic wheat and control in different comparative combinations

分析受體對照葉片低磷脅迫72 h 與0 h 比較的DEG, 結(jié)果顯示對照低磷脅迫72 h 后有2501 個DEG,其中392 個上調(diào)表達和2109 個下調(diào)表達, 上調(diào)表達基因占15.67% (圖5)。

圖5 受體對照低磷脅迫72 h 與0 h 的葉片差異表達基因分析Fig.5 DEGs in leaves between 72 hours and 0 hour under low phosphorus in control

綜合以上結(jié)果, 轉(zhuǎn)基因株系與對照根部DEG 數(shù)量在低磷脅迫處理0 h 最多, 葉片DEG 數(shù)量在低磷脅迫處理72 h 最多。葉片對磷素的響應比根部滯后。

2.2 部分DEG 表達模式的qRT-PCR 驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性, 挑取根部5 個DEG 和葉片5 個DEG, 分別在0、6 和24 h 的表達模式進行qRT-PCR 驗證。結(jié)果顯示, 這10 個DEG 在3 個處理的qRT-PCR 表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果均基本一致(圖6), 相關(guān)系數(shù)平均為r=0.9069, 具有很好的相關(guān)性, 表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果準確、可靠。

圖6 不同磷處理根部和葉片部分DEG 表達模式驗證Fig.6 qRT-PCR verification of selected DEGs in root and leaf under different phosphorus treatments

2.3 根部DEG 功能富集分析

2.3.1 GO 分析 通過對不同處理下轉(zhuǎn)基因株系與對照根部DEG 進行GO 富集分析。將注釋成功的基因按照GO 分為3 類, 即: 生物學過程(biological process), 細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function) (圖7)。

圖7 轉(zhuǎn)基因小麥與對照不同比較組合根部差異基因的GO 富集分析Fig.7 GO enrichment of root DEGs between transgenic wheat and control in different comparative combinations

低磷脅迫0 h, DEG 主要富集在單細胞碳水化合物代謝、有機酸生物合成、三羧酸生物合成、對化學物質(zhì)響應等50 個生物學過程; DEG 主要富集在胞外區(qū)、細胞外部封裝結(jié)構(gòu)、細胞壁、質(zhì)外體等4 個細胞組分; DEG 主要富集在細胞骨架蛋白結(jié)合、作用于CH-OH 的氧化還原酶活性、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合、養(yǎng)分儲存器活性等32 個分子功能。低磷脅迫0、6 和72 h, DEG 均富集在了養(yǎng)分儲存器活性這一分子功能上。低磷脅迫0 h 轉(zhuǎn)基因小麥與對照根部DEG 富集的生物學過程和分子功能均明顯多于脅迫6、24 和72 h。

低磷脅迫6 h, DEG 主要富集在銨轉(zhuǎn)運、無機陰離子轉(zhuǎn)運、對生物刺激響應和蔗糖代謝等4 個生物學過程; DEG 主要富集在有關(guān)養(yǎng)分貯存器活性、多糖結(jié)合、葡糖轉(zhuǎn)移酶活性、ATP 酶活性等16 個分子功能。低磷脅迫24 h, DEG 主要富集在細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、穩(wěn)態(tài)過程和生物質(zhì)量調(diào)節(jié)等4 個生物學過程; DEG 主要富集在二硫化物氧化還原酶活性、電子載體活性、作用于供體硫基的氧化還原酶活性等4 個分子功能。低磷脅迫6 h 和24 h沒有DEG 富集在細胞組分。低磷脅迫72 h, 沒有DEG 富集在生物學過程, DEG 主要富集在胞外區(qū)、細胞外部封裝結(jié)構(gòu)、細胞壁、質(zhì)外體等4 個細胞組分; DEG 主要富集在養(yǎng)分儲存器活性1 個分子功能。

通過對受體對照低磷脅迫6 h 與0 h 根部DEG進行GO 富集分析結(jié)果顯示(圖8), DEG 主要富集在防御反應、金屬離子轉(zhuǎn)運等5 個生物學過程, 胞外區(qū)、質(zhì)外體和膜的錨固部件3 個細胞組分, 以及養(yǎng)分貯存器活性、水解酶活性和吡哆醛磷酸結(jié)合等21個分子功能。

圖8 受體對照低磷脅迫6 h 與0 h 根部差異基因的GO 富集分析Fig.8 GO enrichment of root DEGs between 6 hours and 0 hour under low phosphorus in control

2.3.2 KEGG 分析 KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)(表2),低磷脅迫0 h, 轉(zhuǎn)基因小麥和對照根部DEG 主要富集在苯丙素生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導、甘油磷脂代謝、α-亞麻酸代謝4 個過程。低磷脅迫處理6 h,DEG 主要富集在苯丙素生物合成和谷胱甘肽代謝。OsPHR2參與調(diào)控轉(zhuǎn)基因小麥根部苯丙素的生物合成, 從而促進轉(zhuǎn)基因小麥對磷素的吸收轉(zhuǎn)運。另外,低磷脅迫處理6 h DEG 還富集在谷胱甘肽代謝途徑,且上調(diào)的 DEG 數(shù)量大于下調(diào), 說明低磷脅迫后OsPHR2參與了谷胱甘肽代謝途徑, 該途徑響應低磷脅迫。低磷脅迫24 h 和72 h 沒有DEG 富集代謝途徑。通過對受體對照低磷脅迫6 h 與0 h 根部DEG進行KEGG 富集分析結(jié)果顯示(圖9), DEG 主要富集在苯丙素生物合成和植物病原體互作2 個過程, 且下調(diào)DEG 多于上調(diào)。

表2 不同比較組合根部差異基因的KEGG 富集分析Table 2 KEGG enrichment of root DEGs in different comparative combinations

圖9 受體對照低磷脅迫處理6 h 與0 h 根部差異基因的KEGG 富集分析Fig.9 KEGG enrichment of root DEGs between 6 hours and 0 hour under low phosphorus in control

2.4 葉片DEG 功能富集分析

2.4.1 GO 分析 通過對不同處理下轉(zhuǎn)基因株系與對照葉片DEG 進行GO 富集分析。將注釋成功的基因按照GO 分為3 類, 即: 生物學過程、分子功能和細胞組分(圖10)。

圖10 轉(zhuǎn)基因小麥與對照不同比較組合葉片差異基因的GO 富集分析Fig.10 GO enrichment of leaf DEGs between transgenic wheat and control in different comparative combinations

低磷脅迫72 h, 轉(zhuǎn)基因小麥和對照葉片DEG 數(shù)量最多, 且上調(diào)的DEG 數(shù)量顯著大于下調(diào), DEG 主要富集在碳水化合物合成和代謝、有機酸、脂質(zhì)和小分子生物合成等51 個生物學過程; DEG 主要富集在膜錨固構(gòu)件、質(zhì)外體、外部封裝結(jié)構(gòu)等5 個細胞組分; DEG 主要富集在與糖基轉(zhuǎn)移酶活性、纖維素合酶活性、絲氨酸型肽酶活性等有關(guān)的11 個分子功能。

低磷脅迫0 h, DEG 主要富集在細胞碳水化合物合成、葡聚糖生物合成和代謝、磷光體信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)等15 個生物學過程, 且下調(diào)DEG 數(shù)目遠遠多于上調(diào); DEG 主要富集在細胞壁、胞外區(qū)、質(zhì)外體等4個細胞組分; DEG 主要富集在纖維素合酶、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶、養(yǎng)分儲存器活性等13 個分子功能, 富集細胞組分和分子功能的DEG 均為下調(diào)。低磷脅迫6 h,DEG 主要富集在鐵離子跨膜轉(zhuǎn)運、氮代謝等6 個生物學過程; DEG 主要富集在與多糖結(jié)合、離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、模式結(jié)合等有關(guān)的3 個分子功能, 沒有DEG 富集在細胞組分。低磷脅迫24 h, DEG 主要富集在蛋白質(zhì)折疊1 個生物學過程; DEG 主要富集在細胞外區(qū)、剪接體復合體2 個細胞組分; DEG 主要富集在與未折疊蛋白結(jié)合、特異性DNA 結(jié)合、氧化還原酶活性等有關(guān)的6 個分子功能, 該處理DEG 均為下調(diào)。

通過對受體對照低磷脅迫72 h 與0 h 葉片DEG進行GO 富集分析, 結(jié)果顯示DEG 主要富集在胺生物合成代謝過程、多糖代謝過程、激素代謝過程等17 個生物學過程, 胞外區(qū)、質(zhì)外體、細胞壁和外部封裝結(jié)構(gòu)4 個細胞組分, 以及磷脂結(jié)合、磷酸二酯水解酶活性和絲氨酸型肽酶活性等30 個分子功能,大部分DEG 為下調(diào)(圖11)。

圖11 受體對照低磷脅迫72 h 與0 h 葉片差異基因的GO 富集分析Fig.11 GO enrichment of leaf DEGs between 72 hours and 0 hour under low phosphorus in control

2.4.2 KEGG 分析 KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)(表3),低磷脅迫72 h 差異基因富集在苯丙素生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成等5 個代謝途徑, DEG全部為上調(diào)。低磷脅迫6 h 和24 h 的DEG 未富集到相關(guān)途徑。低磷脅迫處理0 h (R_0 h_T vs.R_0 h_C), DEG 主要富集在光合作用-天線蛋白1 個途徑,DEG 為下調(diào)。KEGG 富集分析結(jié)果表明, 低磷脅迫72 h,OsPHR2通過上調(diào)葉片苯丙素生物合成等代謝途徑基因響應低磷脅迫, 提高轉(zhuǎn)基因小麥的耐低磷特性。

表3 不同比較組葉片差異基因的KEGG 富集分析Table 3 KEGG enrichment of leaf DEGs in different comparative combinations

通過對受體對照低磷脅迫72 h 與0 h 葉片DEG進行KEGG 富集分析結(jié)果顯示(圖12), DEG 主要富集在植物病原體互作1 個過程, 且下調(diào)DEG 多于上調(diào)。

圖12 受體對照低磷脅迫處理72 h 與0 h 葉片差異基因的KEGG 富集分析Fig.12 KEGG enrichment of leaf DEGs between 72 hours and 0 hour under low phosphorus in control

2.5 關(guān)鍵差異表達基因分析

為進一步解析轉(zhuǎn)OsPHR2小麥耐低磷脅迫的分子機制, 對低磷脅迫后轉(zhuǎn)基因株系OsT5-28 和對照的根部和葉片關(guān)鍵DEG 進行了深入分析。植物過氧化物酶是一類含血紅素輔基的酶, 逆境條件下過氧化物酶(POD)是酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶, 可以清除植物細胞中的活性氧(ROS)。谷胱甘肽在植物體內(nèi)存在自我氧化還原平衡調(diào)劑機制, 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在清除生物和非生物脅迫產(chǎn)生的氧化損傷中起重要的作用。P-環(huán)核苷三磷酸水解酶能夠影響植物根中ROS含量, 對維持植物根中ROS 穩(wěn)態(tài)具有重要作用[26]。因此這些基因的上調(diào)表達可以提高植物的抗逆性。當植株受到氮磷養(yǎng)分缺乏等逆境脅迫時, 活性氧的種類增多以提高植物抗逆性[27-28]。在本研究中, 與對照相比, 轉(zhuǎn)基因系OsT5-28 根部血紅素過氧化物酶基因(TraesCS6A02G052800)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因(TraesCS6A02G059600)、P-環(huán)核苷三磷酸水解酶基因(TraesCS6B02G464400)、非血紅素雙加氧酶N端結(jié)構(gòu)域蛋白基因(TraesCS7A02G141100)等在低磷脅迫前后均上調(diào)表達, 其中非血紅素雙加氧酶N 端結(jié)構(gòu)域蛋白基因(TraesCS7A02G141100)在低磷脅迫6 h 表達量最高, 其余3 個基因在低磷脅迫72 h表達量最高。正常處理下OsPHR2提高了轉(zhuǎn)基因小麥根部抗逆相關(guān)基因的表達, 低磷脅迫下這些基因的表達量更加增強, 進而提高了轉(zhuǎn)基因小麥的耐低磷特性。

苯丙素類化合物與植物生長調(diào)節(jié)和抵御病害侵襲有關(guān), 在植物生長發(fā)育和環(huán)境互作中起重要作用。有研究表明, 苯丙素類生物合成和谷胱甘肽代謝途徑在低氮促進的小麥種子根生長調(diào)控中起關(guān)鍵作用[29]。本研究結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)基因系OsT5-28 和對照根部在低磷脅迫0 h 和脅迫6 h 均有DEG 富集在苯丙素生物合成代謝途徑。低磷脅迫0 h 和6 h 分別有12 個和9 個基因顯著上調(diào)表達, 有3 個共同基因上調(diào), 其中2 個血紅素過氧化物酶基因(TraesCS4D02G342500和TraesCS7D02G464600)在低磷脅迫6 h 表達量最高。受體對照低磷脅迫6 h 與0 h 根部DEG 主要富集在苯丙素生物合成和植物病原體互作, 其中有5 個苯丙素生物合成途徑的DEG (TraesCS1D02G310100、TraesCS6B02G258600、TraesCS5B02G405300、TraesCS6D02G351500、TraesCS7A02G424100)在低磷脅迫6 h 顯著下調(diào), 而在轉(zhuǎn)OsPHR2小麥低磷脅迫6 h 后相比受體對照顯著上調(diào)。轉(zhuǎn)基因系OsT5-28 和對照葉片在低磷脅迫72 h 有DEG 富集在苯丙素生物合成和苯丙氨酸代謝途徑, 分別有11 個和5 個基因顯著上調(diào)表達。以上結(jié)果表明, 低磷脅迫后OsPHR2調(diào)控轉(zhuǎn)基因小麥根部和葉片苯丙類代謝途徑相關(guān)基因表達, 進而增強其耐低磷特性。

磷酸丙糖轉(zhuǎn)運體是葉綠體內(nèi)膜上的重要結(jié)構(gòu),擔負著內(nèi)膜的主要運輸功能, 負責將磷酸丙糖從葉綠體運出到細胞質(zhì), 同時將無機磷酸等量運入葉綠體[30-31]。本研究中, 轉(zhuǎn)基因系OsT5-28 葉片的磷酸丙糖轉(zhuǎn)運體家族基因(novel.11254)和葉綠體轉(zhuǎn)移酶基因(TraesCS5D02G120200)在低磷脅迫前后均上調(diào)表達, 其中磷酸丙糖轉(zhuǎn)運體基因在轉(zhuǎn)基因系葉片低磷脅迫6 h 表達量最高, 葉綠體轉(zhuǎn)移酶基因在脅迫72 h 表達量最高。低磷脅迫下,OsPHR2過表達提高了轉(zhuǎn)基因小麥中磷酸丙糖轉(zhuǎn)運體家族基因的表達,從而促進了細胞質(zhì)中碳水化合物的合成和無機磷的利用, 增強了對磷素的吸收。

3 討論

3.1 根部和葉片相關(guān)基因?qū)Φ土椎捻憫嬖诓町?/h3>

AtPHR1是高等植物中唯一已知的磷信號調(diào)控體系的核心轉(zhuǎn)錄因子, 它調(diào)控一系列基因在低磷脅迫下特異表達, 從而啟動下游部分應對磷饑餓的適應性反應, 這些反應主要是植物在低磷脅迫下增加對磷的吸收和利用[32-33]。水稻低磷脅迫轉(zhuǎn)錄因子OsPHR2是AtPHR1的同源基因, 參與下游磷饑餓響應基因的表達調(diào)控, 其自身的表達與磷水平無關(guān)[24]。前期研究結(jié)果表明從拔節(jié)到灌漿期OsPHR2在轉(zhuǎn)基因小麥株系OsT5-28 根中表達量最高, 其次為葉片,而苗期OsPHR2主要在葉片中表達[25]。本研究中, 轉(zhuǎn)基因小麥與對照根部DEG 在低磷脅迫0 h 最多, 表明正常條件下OsPHR2在小麥中過量表達模擬了部分磷饑餓信號, 調(diào)控了一系列磷饑餓響應基因的表達, 低磷脅迫后對照植株對低磷響應, 從而導致DEG 數(shù)量下降。轉(zhuǎn)基因小麥與對照葉片DEG 數(shù)量在低磷脅迫72 h 最多, 說明葉片對低磷的響應較根系滯后。低磷脅迫72 h 葉片DEG 數(shù)量顯著大于根部, 這可能與低磷脅迫下苗期OsPHR2在轉(zhuǎn)基因小麥葉片中表達量高于根部有關(guān)。

3.2 活性氧清除酶參與低磷脅迫響應

當植物生長發(fā)育過程中處于逆境脅迫時, 植物體內(nèi)ROS 水平會迅速升高, 從而使DNA 受損程度增加。植物中過氧化物酶、超氧化物歧化酶等ROS清除酶和谷胱甘肽等抗氧化劑一起協(xié)同維持植物細胞具有高效ROS 清除機制。ROS 能誘導植株防御基因的表達從而應對自身創(chuàng)傷[34]。擬南芥水楊酸基于(NahG)沉默后可減弱植株對ROS 的誘導產(chǎn)生, 從而增強植株對鹽脅迫的耐受性[35]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是植物抗氧化酶清除系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶, 在植物應對逆境脅迫時發(fā)揮重要作用[36-37]。還原型谷胱甘肽(GSH)可以將體內(nèi)ROS 還原成H2O, 從而實現(xiàn)對ROS 的清楚[38]。本研究結(jié)果顯示, 低磷脅迫6 h 轉(zhuǎn)OsPHR2小麥株系OsT5-28 和對照根部DEG 主要富集在谷胱甘肽代謝途徑, 該途徑有8 個基因顯著上調(diào)表達,其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因在低磷脅迫72 h 表達量最高。結(jié)果表明低磷脅迫下OsPHR2過表達誘導了谷胱甘肽代謝途徑相關(guān)基因的表達, 這些基因的上調(diào)表達增強了轉(zhuǎn)基因小麥的耐低磷特性。

3.3 OsPHR2 過表達對小麥糖代謝相關(guān)基因的影響

低磷脅迫條件下, 植物形成了一系列耐低磷脅迫的適應機制, 包括淀粉合成、糖類代謝及根系有機物分泌合成等生理生化反應的改變, 同時相關(guān)基因表達也發(fā)生一系列變化, 以提高植物對磷素的吸收利用[39-43]。碳水化合物是植物進行各種生命活動的重要能源物質(zhì), 植物光合作用的主要產(chǎn)物是碳水化合物, 蔗糖、葡萄糖、果糖和淀粉等均為非結(jié)構(gòu)性碳水化合物[44]。低磷脅迫條件下, 糖和淀粉在根和葉部積累[45], 根尖糖酵解酶含量顯著增加[21]。本研究結(jié)果顯示, 低磷脅迫前后, 轉(zhuǎn)基因系OsT5-28和對照DEG 均主要富集在糖代謝過程。低磷脅迫0 h, 在轉(zhuǎn)基因系根部氨基糖代謝途徑中有7 個基因顯著上調(diào)表達, 低磷脅迫6 h, 有6 個基因顯著上調(diào),均為糖酵解酶基因。受體對照低磷脅迫6 h 根部有2 個纖維素合成酶基因(TraesCS2A02G210300、TraesCS2A02G210400)顯著下調(diào)表達, 轉(zhuǎn)OsPHR2小麥低磷脅迫6 h 后相比受體對照這2 個基因顯著上調(diào)表達。低磷脅迫72 h, 在轉(zhuǎn)基因小麥葉片細胞碳水化合物代謝過程有32 個基因顯著上調(diào)表達, 包括纖維素合成酶基因、葡聚糖酶結(jié)構(gòu)域基因和糖水解酶基因等。受體對照低磷脅迫72 h 葉片有7 個碳水化合物生物合成過程基因(TraesCS3D02G289600、TraesCSU02G142500、TraesCS2A02G102600、TraesCS2B02G119700、TraesCS2D02G102100、TraesCS6B02G104600、TraesCS6A02G077800)顯著下調(diào)表達, 轉(zhuǎn)OsPHR2小麥低磷脅迫72 h 后相比受體對照這7 個基因顯著上調(diào)表達。低磷脅迫下, 轉(zhuǎn)基因小麥根部和葉片糖代謝相關(guān)基因的顯著上調(diào)表達, 提高了糖類在根和葉片的積累, 從而增強了轉(zhuǎn)基因小麥的耐低磷特性。OsPHR2過表達誘導了小麥糖代謝途徑相關(guān)基因的表達。

4 結(jié)論

不同磷處理下轉(zhuǎn)基因小麥與對照轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示, 葉片對磷素的響應比根部稍滯后。低磷脅迫前,OsPHR2過表達可以提高轉(zhuǎn)基因小麥根部碳水化合物代謝和有機酸合成等相關(guān)基因表達。低磷脅迫后,OsPHR2可以通過調(diào)控根部生物刺激響應、蔗糖代謝、氧化還原酶活性和谷胱甘肽代謝等基因,以及葉片碳水化合物代謝、有機酸合成、轉(zhuǎn)移酶活性和纖維素合酶活性等相關(guān)基因表達, 從而提高轉(zhuǎn)基因小麥耐低磷特性。研究結(jié)果可為小麥磷高效利用遺傳育種研究提供理論參考。