清腎顆粒對大鼠NRK-52E細胞轉分化模型miR-23b和PINK1/Parkin通路的影響

金 華,張葉青,呼 琴,張 磊,陳 諾,韓燕全,王億平

(1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院腎病科,安徽 合肥 230031;2.合肥綜合性國家科學中心大健康研究院新安醫學與中醫藥現代化研究所,安徽 合肥 230012;3.安徽中醫藥大學研究生院,安徽 合肥 230012;4.安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥學部,安徽 合肥 230031)

腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是各種類型慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)發展過程中重要的病理生理改變,以腎間質大量成纖維細胞及肌成纖維細胞增生、細胞外基質堆積、腎小管結構破壞為特征。腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)已被確認為是RIF的主要因素。

MicroRNA(miRNA)是一種短鏈非編碼RNA,在機體的細胞增殖和組織分化中起著關鍵作用。miRNA已成為纖維化疾病的重要調節劑,其中miR-23b在減輕腎小管EMT和氧化應激損傷方面具有重要作用,有可能成為干預腎臟纖維化研究的新靶點。PINK1/Parkin通路是介導線粒體自噬(mitophagy)的關鍵信號通路[1],對RIF信號調控有著密切的關系。miR-23b和PINK1/Parkin通路之間是否存在靶向調控關系,以及在腎小管EMT和RIF中的作用機制目前尚未得到闡明。中醫藥在延緩CKD疾病進展方面具有一定的作用,清腎顆粒是安徽中醫藥大學第一附屬醫院的臨床經驗方,前期研究已證實[2-3],CKD患者及RIF模型大鼠機體的氧化應激和炎癥反應顯著增強,清腎顆粒能夠抑制CKD患者和RIF大鼠的氧化應激和炎癥反應,延緩腎小管EMT和RIF的進展。本文采用轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)誘導正常大鼠腎小管上皮細(normal renal tubularduct epithelial cells in rats,NRK-52E)轉分化模型,觀察miR-23b-5p對PINK1/Parkin通路的靶向調節機制,并闡明清腎顆粒含藥血清對NRK-52E細胞轉分化的干預機理,為其抗RIF提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑清腎顆粒由安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心生產,皖藥制字BZ20080011,批號20210215,規格10g/袋(約含生藥34g),由茵陳、丹參、生大黃、白花蛇舌草、白術、薏苡仁、澤瀉、黃連、車前草組成。重組人TGF-β1細胞因子(美國PeproTech);CCK8檢測試劑盒(BIOSS,批號BJ05203090);DMEM(cytiva,批號AG29690389);Trizol(Lifetechnogies,批號380706);Prime ScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser(反轉錄試劑盒)(TaKaRa,批號AL50947A);引物合成(SangonBiotech);RIPA細胞裂解液(強)(Beyotime,批號09271919023);Tris(Solarbio,批號809C0730);Tween-20(Solarbio,批號1121S017);PVDF膜(Millipore,批號R7SA9081E);預染蛋白Marker(Thermo,批號00784045);Western一抗二抗去除液(Beyotime,批號051418180626);ECL超敏發光試劑盒(Thermo,批號VC298015);山羊抗小鼠IgG(Zsbio,批號140193);山羊抗兔IgG(Zsbio,批號202700514);GAPDH(Zsbio,批號210040421);P62(proteintech,批號00079494);Pink1(Bioss);Parkin(Santa Cruz,批號K1120);Beclin-1(abcam,批號GR3204186-1);LC3B(CST,批號13);α-SMA(bioss,批號AG03286338)。

1.2 儀器離心機(上海和欣科教設備有限公司);培養箱(Thermo);超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司);普通PCR儀(杭州晶格科學儀器有限公司);低速迷你離心機(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);高速臺冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司);微量移液器(德國Eppendorf);熒光定量PCR儀(ThermoScientific);微孔板迷你離心機(杭州奧盛儀器有限公司);電泳儀、電泳槽、轉膜儀(上海天能科技有限公司);自動曝光儀(上海培清科技有限公司);Acquity超高效液相系統(Waters公司);色譜柱Luna Omega 1.6 μm C18(100×2.1 mm)。

1.3 方法

1.3.1實驗動物與細胞

1.3.1.1 實驗動物 選用SPF級雄性SD大鼠20只,2月齡,體質量(200±20) g,適應性飼養1周,均購自安徽醫科大學實驗動物中心,許可證號:SCXK(蘇)2022-0005。

1.3.1.2 細胞 NRK-52E和HEK-293T細胞,購自賽百慷(上海)生物技術股份有限公司。

1.3.2清腎顆粒的指紋圖譜分析 采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)法對清腎顆粒進行全指紋圖譜分析[5]。使用C18色譜柱,流動相A為乙睛,流動相B為0.05%磷酸水,梯度洗脫,流速0.25 mL·min-1,進樣量1 μl,柱溫30 ℃。每批次清腎顆粒取0.3 g,用75%乙醇溶解于10 mL中,超聲震蕩30 min,0.22 μm濾膜過濾檢測濾液。稱取適量對照品制備對照品溶液。

1.3.3大鼠含藥血清制備 將大鼠隨機分為藥物組和空白組,每組10只。藥物組大鼠給予清腎顆粒20 g·kg-1·d-1灌胃,連續給藥10 d后處死動物,腹主動脈無菌采血,制備含藥血清,置-20 ℃保存備用?？瞻捉M動物給予等量生理鹽水灌胃,并如上法制備大鼠空白血清。

1.3.4細胞的培養 將NRK-52E細胞置于DMEM/F12培養液中(DMEM與F12的比例為1 ∶1,培養液中含有青、鏈霉素各100 kU·L-1,10%FBS),在無菌培養箱中進行培養;將細胞形態良好的NRK-52E傳代在6孔板中,待細胞生長到融合度約50%時,將培養液更換為無血清的培養基繼續培養24 h。

1.3.5CCK-8法檢測NRK-52E細胞活力 細胞貼壁后加入適量的TGF-β1,根據TGF-β1刺激濃度分為6組(TGF-β1濃度分別為0 、5 、7.5 、10 、12.5 、15 μg·L-1),放入培養箱中繼續培養。分別在培養到0 h、24 h、48 h和72 h時取出。細胞增殖毒性檢測法(CCK-8法)檢測細胞活性:在96孔板中每孔加入10 μL CCK-8進行檢測,37 ℃孵育4 h,用酶聯免疫檢測儀測定在450 nm處的吸光度(A)值并計算細胞活性。另取NRK-52E細胞,方法同上,待細胞貼壁后用TGF-β1(10 μg·L-1)刺激,放入培養箱中培養24 h后,根據加入清腎顆粒含藥血清的濃度不同分為5組(分別更換為正常含藥血清、5%含藥血清、10%含藥血清、20%含藥血清、30%含藥血清的培養基)。邊緣孔加PBS緩沖液,分別在培養0 h、24 h、48 h和72 h時取出,在96孔板中每孔加入10 μL CCK-8進行檢測細胞活性。根據上述實驗篩選出清腎顆粒含藥血清的最佳濃度和時間分別為20%和24 h,TGF-β1刺激的最佳濃度和時間為10 μg·L-1和24 h(詳見研究結果),再進行后續試驗。

1.3.6細胞轉染實驗 用Lipofectamine 2000試劑對細胞進行轉染,相關microRNA轉染分組:miR-23b-5p模擬物組、模擬物空載對照組、miR-23b-5p抑制劑組、抑制劑空載對照組。

1.3.7清腎顆粒含藥血清干預實驗及回復實驗 將清腎顆粒含藥血清作用于NRK-52E細胞(TGF-β1刺激),并轉染miR-23b-5p mimic,分組為:①正常組:NRK-52E+無血清DMEM培養基;②TGF-β1組(模型組):DMEM培養基+10 μg·L-1TGF-β1;③清腎顆粒組:DMEM培養基+10 μg·L-1TGF-β1+20%清腎顆粒含藥血清;④miR-23b-mimic-NC組:DMEM培養基+10 μg·L-1TGF-β1+miR-23b-mimic-NC;⑤miR-23b-mimic組:DMEM培養基+10 μg·L-1TGF-β1+miR-23b-mimic;⑥miR-23b-mimic+清腎顆粒組:DMEM培養基+10 μg·L-1TGF-β1+miR-23b-mimic+20%清腎顆粒含藥血清。

1.3.8Western blot法檢測NRK-52E細胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表達 收集各組細胞,用RIPA裂解液提取總蛋白并測量蛋白濃度。分離總蛋白,電泳并轉膜。封閉2 h,TBST洗膜,加入一抗孵育,4 ℃過夜。第二天洗膜后,將膜與適當的二抗室溫輕搖孵育1 h后洗膜。使用ECL發光試劑盒來檢測蛋白。使用Image J軟件以目標蛋白與內參照GAPDH的灰度值比值做統計分析。

1.3.9RT-qPCR法檢測NRK-52E細胞中miR-23b、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA表達 使用TRIzol試劑從NRK-52E細胞中提取各組細胞總RNA,按microRNA逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。進行定量PCR引物設計合成(Tab 1)。以cDNA為擴增模板,進行RT-qPCR擴增。以U6為內參,2-ΔΔCt方法分析miR-23b-5p的相對表達水平,引物序列見Tab 1。

1.3.10熒光素酶報告基因實驗檢測miR-23b與PINK1的靶向關系 將PINK1的3′UTR全長克隆到pmirGLO載體中,命名為野生型PINK1(PINK1-WT),同時將PINK1突變體克隆到pmirGLO載體中獲得PINK1-MUT報告載體。隨后將293T細胞以每孔1×105個細胞的密度接種在24孔板中,并通過lipofectamine 2000將報告載體和miR-23b mimics或miRNA陰性對照miR-NC共轉染入293T細胞,48 h后收集各組細胞通過熒光素酶報告試驗系統測定熒光素酶活性。

2 結果

2.1 清腎顆粒的指紋圖譜分析UPLC指紋圖譜法鑒定出清腎顆粒中11個活性成分:綠原酸(Chlorogenic acid)、鹽酸小檗堿(Berberine hydrochlorid)、大車前苷(Plantamajoside)、濱蒿內酯6,7-二甲氧基香豆素(6,7-dimethoxycoumarin)、表小檗堿(Epiberberine)、黃連堿(Coptisine)、丹酚酸B(Salvianolic acid B)、巴馬汀(Palmatine)、益母草堿(Leonurine)、大黃酸(Rheic acid)、丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)。(Fig 1)

2.2 CCK-8法檢測各組細胞活力

2.2.1TGF-β1誘導NRK-52E細胞轉分化的時間及濃度篩選 不同濃度TGF-β1刺激NRK-52細胞24h,A值與NRK-52E組比較,差異均具有統計學意義(P<0.05),TGF-β1濃度為10 μg·L-1時,與TGF-β1濃度為7.5 μg·L-1及5 μg·L-1相比差異明顯(P<0.05),與TGF-β1濃度為12.5 μg·L-1及15 μg·L-1相比,差異無統計學意義(P>0.05),故選擇TGF-β1刺激NRK-52細胞的最佳濃度為10 μg·L-1,時間為24h(Tab 2、Fig 2A)。

2.2.2清腎顆粒含藥血清作用濃度和時間的篩選 不同濃度清腎顆粒含藥血清作用時間為24 h時,與正常血清組相比,清腎顆粒含藥血清各組均明顯減少(P<0.05)。隨著濃度升高,20%含藥血清組A值下降最顯著,其與5%、10%含藥血清組相比,差異均有統計學意義(P<0.05),與30%含藥血清組差異不明顯,無統計學意義(P>0.05)。故選擇清腎顆粒含藥血清作用NRK-52細胞的最佳濃度為20%,時間為24h(Tab 3、Fig 2B)。

Tab 1 Primers involved in RT-qPCR

Fig 1 UPLC fingerprint of Qingshen granules

Tab 2 Comparison of OD values of cells in each group at different time

2.3 NRK-52E細胞中miR-23b-5p對PINK1 mRNA相對表達量的影響分別將miR-23b-5p mimic、inhibitor轉染到NRK-52E細胞后發現,miR-23b-5p模擬物組的miR-23b-5p、PINK1 mRNA的相對表達量明顯高于模擬物空載對照組(P<0.05);miR-23b-5p抑制劑組的miR-23b-5p、PINK1 mRNA的相對表達量明顯低于抑制劑空載對照組(P<0.05)。以上結果表明,miR-23b-5p過表達后,PINK1 mRNA表達量也明顯增加;而miR-23b-5p表達沉默后,PINK1 mRNA表達量也明顯減少(Tab 4、Fig 3)。

Tab 3 Comparison of OD values of cells in each group at different time

Fig 2 Growth curve of NRK-52E cells stimulated by different concentrations of TGF-β1 (A) and Qingshen granule-containing serum (B)

Tab 4 Effect of miR-23b-5p on PINK1 mRNA

Fig 3 Effect of miR-23b-5p on PINK1 mRNA in 293T cells

2.4 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-23b與PINK1的靶向關系Rno-miR-23b-5p與Rno-PINK1之間存在互補結合位點(Fig 4A);雙熒光素酶報告系統檢測結果顯示(Fig 4B),NC mimics+Rno-PINK1-wt組、Rno-miR-23b-5p+Rno-PINK1-wt組、NC mimics+Rno-PINK1-mu組、Rno-miR-23b-5p+Rno-PINK1-mu組的熒光素酶相對活性分別為1.000±0.032、0.378±0.046、1.000±0.022、1.043±0.052。與NC mimics+Rno-PINK1-wt組相比,Rno-miR-23b-5p+Rno-PINK1-wt組的相對熒光素酶活性明顯降低(n=3,P<0.01);而當PINK1基因3′UTR的潛在結合位點發生點突變后,與NC mimics+Rno-PINK1-mu組相比,Rno-miR-23b-5p+Rno-PINK1-mu組的相對熒光素酶活性差異沒有顯著變化(n=3,P>0.05)。

Fig 4 Rno-miR-23b-5p and Rno-PINK1 target site binding diagram (A) and dual luciferase reporter gene to detect interaction between the two (B)

2.5 清腎顆粒含藥血清對NRK-52E細胞轉分化的干預作用

2.5.1Western blot法檢測NRK-52E細胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表達 與正常組比較,TGF-β1組細胞Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明顯降低,P62和α-SMA表達明顯升高(P<0.05)。與TGF-β1組比較,清腎顆粒組、miR-23b-mimic組Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明顯升高,P62和α-SMA表達明顯降低(P<0.05)。與miR-23b-mimic-NC組比較,miR-23b-mimic組Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明顯升高,P62和α-SMA表達明顯降低(P<0.05)。與miR-23b-mimic組比較,miR-23b-mimic+清腎顆粒組Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明顯升高,P62和α-SMA表達明顯降低(P<0.05)(Tab 5,Fig 5)。

2.5.2qRT-PCR法檢測NRK-52E細胞中miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA表達情況 與正常組比較,TGF-β1組miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1 mRNA表達量明顯降低,α-SMA mRNA表達量明顯升高(P<0.05)。與TGF-β1組比較,清腎顆粒組、miR-23b-mimic組miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1表達量均明顯升高,α-SMA表達均水平明顯降低(P<0.05)。與miR-23b-mimic-NC組比較,miR-23b-mimic組miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1表達量明顯升高,α-SMA表達量明顯降低(P<0.05)。與miR-23b-mimic比較,miR-23b-mimic+清腎顆粒組miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1表達量明顯升高,α-SMA表達量明顯降低(P<0.05)(Tab 6,Fig 6)。

3 討論

腎小管EMT是引起RIF的關鍵事件,表現為腎小管上皮細胞失去上皮表面標記物,轉而獲得間質細胞表型、間質細胞標志物(如α-SMA)表達增多,最終轉變為肌成纖維細胞,發展成腎臟纖維化。線粒體自噬(mitophagy)作為一種特殊的自噬,是細胞持續清理衰老和損傷的線粒體,確保線粒體循環利用的重要途徑。線粒體自噬在纖維化疾病的發展中起關鍵作用,其通過減少線粒體釋放活性氧、促凋亡物質,緩解炎癥和氧化應激損傷,減少細胞凋亡,發揮抗纖維化的作用[4]。由于腎臟是一個高耗能器官,而腎小管是腎組織內能量消耗較多的部位,且腎小管上皮細胞(RTEC)富含線粒體,對缺血缺氧十分敏感,腎小管重吸收及分泌功能均依賴線粒體氧化磷酸化供能。因此線粒體自噬介導的線粒體質量控制是調節腎臟細胞穩態極其關鍵的機制。

PINK1/Parkin通路是介導線粒體自噬的經典信號通路[5]。當線粒體受到應激時,PINK1會在線粒體外膜上富集,隨后PINK1激活泛素(ubiquitin,Ub)和Parkin,生成用于識別受損線粒體的Parkin-Ub復合物,此時P62蛋白(也稱為SQSTM1)在線粒體外膜上積累,并將Parkin-Ub復合物和LC3蛋白連接起來,使自噬體能夠吞噬降解受損的線粒體。同時Beclin1作為自噬起始蛋白,在自噬起始時與PI3k和Atg14形成三聚體,不斷招募自噬相關蛋白介導線粒體自噬。因此,P62、LC3-Ⅱ和Beclin1是參與自噬過程的3種主要蛋白質,在自噬體形成中發揮至關重要的作用,是反映自噬活動的特異性指標。在本研究中我們發現,TGF-β1誘導大鼠NRK-52E細胞轉分化模型中,Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值明顯降低,P62和α-SMA表達明顯升高,提示在腎小管轉分化進程中PINK1/Parkin通路活性及其介導的線粒體自噬活性是降低的。在其他腎臟疾病的研究中也證實了線粒體自噬減少是加重疾病進展的重要因素。在腎缺血再灌注損傷(IRI)模型中,通過抑制PINK1/Parkin通路能夠負性調節線粒體自噬,加重了IRI損傷情況[6]。在糖尿病腎病中通過抑制PINK1介導的線粒體自噬,能夠加重腎纖維化進程[7];而通過介導線粒體自噬活性增強,能夠抑制ROS和NLRP3炎癥小體激活,進而發揮抗腎纖維化作用[8]。因此,恢復線粒體自噬平衡作為治療RIF的藥理學靶點的可能性,為更有效地抗腎臟纖維化、延緩CKD進展提供新思路。

Tab 5 Comparison of Pink1,Parkin,α-SMA,LC3Ⅱ,Beclin-1 and P62 protein expression in NRK-52E

Fig 5 Comparison of protein expression in different

Tab 6 Comparison of miR-23b-5p,Pink1,Parkin,Beclin-1 and α-SMA mRNA expression in NRK-52E cells(Mean±SD,n=6)

Fig 6 Comparison of mRNA expression in different

miRNA作為一種短鏈非編碼小分子RNA,能夠通過在轉錄后水平上完全或部分結合靶蛋白編碼的mRNAs進行降解或翻譯抑制,調節蛋白質表達。近年來研究發現,miRNAs參與RIF的調節過程,成為干預腎臟纖維化治療的新靶點。Liu 等[9]研究發現miR-23b在高糖處理的腎小管上皮細胞(HK-2)和糖尿病腎病小鼠腎組織中水平明顯降低,miR-23b被確定為糖尿病腎病中上皮-間質轉化(EMT)的抑制因子。Wang 等[10]研究也發現高表達的miR-23b通過抑制MAPK信號通路來抑制糖尿病腎病中腎纖維化的發生。本課題組在前期研究中已通過網絡藥理學及尿外泌體Small RNA測序技術,篩選出慢性腎衰竭患者體內97個差異miRNA(包含84個上調miRNA和13個下調miRNA),其中miR-23b-5p在慢性腎衰竭患者體內的表達是明顯下調的(log2 Fold Change=-4.50953,qValue=0.003 782)[11]。

miR-23b和PINK1/Parkin通過參與多種信號通路的調控,抑制腎間質細胞發生氧化應激、炎癥、細胞自噬等反應,進而延緩RIF進展。但miR-23b靶向PINK1/Parkin通路研究對腎纖維化的干預作用目前報道較少。本研究通過TGF-β1誘導大鼠NRK-52E細胞,探討miR-23b對PINK1/Parkin通路的靶向調節機制,研究結果發現,干擾miR-23b-5p表達后,PINK1通路活性也進一步被抑制,NRK-52E細胞轉分化進程進一步增強;而miR-23b-5p過表達后,PINK1通路活性也進一步被激活,NRK-52E細胞轉分化進程減弱,提示miR-23b-5p可通過調控PINK1通路,進而介導NRK-52E細胞轉分化。本研究中雙熒光素酶實驗結果也驗證了此調節機制,我們發現miR-23b-5p能明顯下調Rno-PINK1-WT熒光素酶活性,但未能下調突變PINK1-mut熒光素酶活性,表明miR-23b-5p能與PINK1基因3′UTR結合,miR-23b可以靶向調節PINK1基因的表達。因此,miR-23b-5p對PINK1/Parkin通路具有靶向調控作用。

本課題組團隊立足于“熱能化濕、燥濕為本、化濕攻下、化瘀通絡”等新安醫學理論基礎,并針對慢性腎臟病“濕熱傷腎、濕熱與瘀交結”的病機,開發出具有清熱化濕祛瘀功效的中藥清腎顆粒并成功應用于臨床治療CKD,取得良好臨床療效。多中心、隨機對照臨床試驗證實清腎顆粒能夠有效改善CKD濕熱證患者的臨床癥狀、提高生活質量、延緩腎衰竭進展;有效改善腎性貧血、營養不良、鈣磷代謝紊亂、胃腸功能紊亂等CKD并發癥;且安全性良好[12]。前期研究也發現,清腎顆粒治療慢性腎臟病患者和抗腎纖維化機制中具有多環節、多靶點、多途徑作用特點[3,13-16]。本研究進一步通過UPLC指紋圖譜法鑒定出清腎顆粒中的11個活性成分,且這11個活性成分在抗炎、抗氧化、增強線粒體自噬、抑制細胞轉分化、抗纖維化方面均有不同程度作用,這些活性成分有可能是清腎顆粒防治RIF的有效靶點[17]。

本研究也進一步發現,清腎顆粒含藥血清可以上調NRK-52E轉分化細胞模型中miR-23b-5p表達,增強PINK1/Parkin介導的線粒體自噬活性,進而起到抑制NRK-52E細胞轉分化進程。

綜上所述,TGF-β1介導的NRK-52E轉分化細胞模型中,miR-23b-5p表達和PINK1/Parkin介導的線粒體自噬活性是下降的;miR-23b-5p可以靶向調節PINK1/Parkin通路,通過增強線粒體自噬活性,抑制NRK-52E細胞轉分化;清腎顆粒含藥血清能夠通過上調miR-23b表達,恢復PINK1/Parkin介導的強線粒體自噬,減輕腎小管EMT進程,發揮抗RIF作用,這為中醫藥防治腎臟病提供新的思路和方向。