液相色譜-質譜聯用技術分析秦巴硒菇提取物活性成分及其治療慢性粒細胞白血病的網絡藥理學研究

王東萍,葛萬文,邵 晶,孫延慶

(1. 甘肅中醫藥大學中西醫結合學院,甘肅 蘭州 730000;2. 蘭州大學第二醫院, 甘肅 蘭州 730030;3. 甘肅中醫藥大學藥學院,甘肅 蘭州 730000;4. 甘肅省人民醫院, 甘肅 蘭州 730000)

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一種骨髓增殖性造血系統惡性腫瘤,由9號和22號染色體易位所致,易位產生了費城染色體[1]。該易位編碼具有酪氨酸激酶活性的蛋白,酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs) 的出現明顯改善了CML患者的治療和預后,但在治療過程中約有33%的患者出現了耐藥[2]。在治療過程中藥物的副作用、停藥后疾病復發、耐藥的出現導致治療失敗疾病進展等仍是該疾病治療過程中需重點解決的問題。

植物源性天然產物在血液系統惡性腫瘤中具有顯著的藥理作用,近年來受到廣泛關注。食用和藥用蘑菇中因含有凝集素、精氨酸、麥角甾醇、β-葡聚糖等多種活性物質,所以具有促造血,抗炎,抗過敏,抗腫瘤,抗感染等多種生物學活性[3]。秦巴硒菇(Agaricus blazei Murill, AbM)是一種食藥兼用的真菌,秦巴硒菇提取物是從秦巴硒菇中獲得的酸性RNA蛋白質復合物,在前期的研究中發現,該提取物表現出對多發性骨髓瘤[4]、白血病[5]等的抗腫瘤活性,與化療藥物3′-疊氮-3′-脫氧胸腺核苷抗胃癌亦有協同和增敏作用[6]。

隨著生物信息學的快速發展,網絡藥理學和分子對接技術為揭示中醫藥的復雜機制以及藥物、靶點和疾病之間的相互關系提供了一種新的方法,有助于觀察藥物對疾病的治療作用[7]。本研究以液相色譜質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)分析明確秦巴硒菇提取物中的活性成分,應用網絡藥理學與分子對接相結合的方法預測秦巴硒菇提取物治療CML的可能作用機制,并通過體外實驗進行進一步的驗證。

1 材料

1.1 試劑與儀器胎牛血清:購自以色列BI公司;CCK-8試劑盒:購自奧默生物技術有限公司;SDS-PAGE試劑盒:購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司;PVDF膜:購自德國Merck millipore公司;Akt、mTOR、β-actin一抗:購自美國Abcam公司;PI3K、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR一抗:購自美國CST公司。超高效液相色譜質譜聯用儀1290 UHPLC Q Exactive Focus(美國Agilent公司產品),色譜柱ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 2.1×100 mm Col(美國Waters公司產品),Mulltiskan FC型酶標儀(美國ThermoFisher公司產品),Tanon 5200 Multi 全自動化學發光圖像處理系統(上海天能科技有限公司產品)。

1.2 細胞株及其培養K562細胞株由本實驗室保存;K562細胞置于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養基中,在37℃、5% CO2且飽和濕度的無菌培養箱中培養。根據細胞生長狀況,取細胞狀態良好處于對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 秦巴硒菇提取物秦巴硒菇:購自陜西紫陽有限公司,秦巴硒菇提取物的分離純化由中國科學院蘭州化學物理研究所天然藥物重點實驗室完成,具體提取方法已有報道[6]。簡而言之,將500 g干燥除雜的秦巴硒菇粉碎,通過乙醇沉淀、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析對提取物進行純化得到4.86 g提取物,滅菌后貯存于4 ℃備用。

2 方法

2.1 秦巴硒菇提取物主要成分篩選及成分靶點的預測稱取100 mg樣本,加入500 μL提取液(甲醇 ∶水=4 ∶1);渦旋30 s,45 Hz勻漿4 min,冰水浴超聲1 h;-40 ℃靜置1 h后將樣本在4 ℃,12 000 r·min-1離心15 min;小心地取上清經0.22 μmol·L-1微孔濾膜過濾;后上機檢測。通過Swiss Target Prediction數據庫(http://www. swisstargetprediction.ch/) 檢索秦巴硒菇提取物中活性成分相對應的潛在作用靶點,去除重復項,獲得各活性成分的靶點。

2.2 疾病靶點的獲取從GeneCards (https://www.genecards.org/), DisGeNET (https://www.disgenet. org/)數據庫檢索與CML相關的靶點,將不同數據庫的靶點合并去重,得到CML的相關靶點基因。將藥物靶點數據集和疾病靶點數據集取交集,繪制韋恩圖,即為秦巴硒菇提取物治療CML的共同靶點。

2.3 蛋白-蛋白互相作用(PPI)網絡的構建為了進一步分析秦巴硒菇提取物治療白血病的關鍵靶點,將獲得的交集靶點導入STRING (https://cn.string-db.org/)數據庫,以combined score >0.9為篩選條件,獲得各靶點相互作用關系,將數據導入Cytoscape3.9.1軟件構建PPI網絡。

2.4 基因功能與通路富集分析為明確秦巴硒菇提取物治療CML靶點的基因功能及主要信號通路,將獲取的共同靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) 進行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括三個主要組成部分生物過程(biological process, BP),分子功能(molecular function, MF)以及細胞組分(cellular component, CC)。KEGG通路富集分析用于闡明秦巴硒菇提取物治療CML的潛在作用機制。本研究根據P值大小,分別選擇前10位的GO條目及前20位的KEGG通路,利用在線工具繪制氣泡圖。

2.5 分子對接從PDB(https://www.rcsb.org/)數據庫獲得蛋白大分子結構,通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得藥物活性成分的SDF結構,DockThor (https:// dockthor.lncc.br/v2/) 進行分子對接[8],對接結果通過Pymol軟件進一步處理。

2.6 CCK-8法測定K562細胞的IC50取對數生長期細胞,調整細胞密度,以每孔5×103個接種于96孔板中,以本課題組前期研究為依據,設置實驗組藥物濃度為0.5、1、1.5、2、2.5、3 g·L-1,同時設立對照組(常規培養,不加藥物)和空白組(加入培養基,不加細胞)。細胞置于37 ℃,5% CO2飽和濕度恒溫培養箱中分別培養24 h和48 h。每孔各加入10 μL CCK-8試劑共孵育2 h,Mulltiskan FC型酶標儀測定450 nm處吸光度。使用GraphPad Prism 8計算其IC50值。

2.7 Western blot檢測相關蛋白的表達水平K562細胞經不同濃度藥物(0、0.5、1 g·L-1)處理后收集,預冷PBS洗滌,加入細胞裂解液重懸細胞,4 ℃條件下,12 000 r·min-1、30 min離心,收集上清,BCA法測定各組蛋白濃度。經SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜,5% BSA室溫封閉2 h,一抗4 ℃條件下孵育過夜。TBST洗滌后加入二抗,室溫孵育1 h,TBST漂洗。ECL超敏發光劑顯色后經Tanon 5200 Multi全自動化學發光圖像處理系統分析相關蛋白表達。

3 結果

3.1 秦巴硒菇提取物化學成分的篩選秦巴硒菇提取物利用超高效液相色譜質譜聯用儀進行檢測。使用控制軟件(Xcalibur, Thermo Fisher Scientific)控制下基于FullScan-ddMS2功能進行一級、二級質譜數據采集。將數據進行記錄、分析和處理,結果見Fig 1。通過LC-MS檢測發現秦巴硒菇提取物的主要化合物共有126個,運用Swiss Target Prediction網站檢索藥物成分靶點并去重后共獲得相關靶點1 150個。

Fig 1 Ion flow diagram of LC-MS

3.2 靶點基因的獲取以“CML”為關鍵詞,在GeneCards數據庫檢索疾病靶點,依據相關性得分(Relevance score ≥ 1),共檢索到靶點基因數目357個。在DisGeNET數據庫中共檢索到疾病靶點基因503個,兩個數據庫篩除重復靶點后共獲得靶點數718個。將活性成分的治療靶點和疾病靶點取交集,獲得172個共同靶點。見Fig 2。

3.3 PPI網絡的構建將秦巴硒菇提取物靶點基因與CML靶點基因通過繪制韋恩圖,將所得的172個交集基因導入STRING數據庫,獲取靶蛋白互作網絡。運用CytoScape軟件,繪制出PPI網絡圖。見Fig 3。連接相關靶點最多的前3種成分分別是楊芽黃素、異歐前胡素、歐前胡素。使用cytoHubba插件獲得PPI網絡中的核心子網絡。其中,TP53具有最高的度值,能與272個蛋白發生相互作用關系;其次為GAPDH、STAT3、CTNNB1、AKT1等,揭示這些靶點在整個網絡中起關鍵作用,是秦巴硒菇提取物成分治療白血病的關鍵靶點。見Fig 4。

Fig 2 Venn diagram of drug targets and disease targets

Fig 3 PPI network

3.4 GO和KEGG通路富集分析通過DAVID數據庫對交集靶基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析分別顯示潛在靶點顯著富集的前10個條目,其中BP與信號傳導、蛋白質磷酸化、細胞內信號傳導、細胞增殖、細胞凋亡等過程相關。參與的MF包括蛋白質及ATP結合,蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。見Fig 5。KEGG主要涉及癌癥通路、PI3K/Akt、MAPK信號通路、細胞凋亡等信號通路。見Fig 6。

3.5 分子對接利用分子對接技術,將秦巴硒菇提取物中的主要活性成分分別與PI3K/Akt/mTOR 信號通路中的關鍵靶點蛋白進行對接:PI3K(PDB:2v1y)、AKT1(PDB:1h10)、mTOR(PDB:6m4u)。結合能越小提示對接效果越好。結果顯示三種主要成分與PI3K/Akt/mTOR信號通路中的關鍵靶點蛋白都有良好的結合能力,可形成結合能低、活性高、結構穩定的構象。見Tab 1,Fig 7。

Fig 4 Core candidate target genes

Fig 6 KEGG enrichment analysis

Tab 1 Molecular docking binding energies(kcal/mol)

3.6 秦巴硒菇提取物抑制K562細胞增殖CCK-8法檢測結果顯示:秦巴硒菇提取物對K562細胞有抑制增殖的作用,呈時間依賴性和濃度依賴性,作用于K562細胞24 h和48 h的IC50分別為1.86和1.48 g·L-1,差異有統計學意義。見Fig 8。

3.7 K562細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達比較采用Western blot法檢測PI3K,Akt,mTOR蛋白表達量。實驗結果顯示秦巴硒菇提取物對PI3K、Akt、mTOR蛋白表達水平影響不大。進一步檢測蛋白磷酸化水平,結果表明在不同濃度的秦巴硒菇提取物干預作用下,能以劑量依賴性的方式下調p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達。見Fig 9。

4 討論

在本研究中,通過液相色譜質譜分析秦巴硒菇提取物中的化合物,共發現126種化合物。在這項研究中,楊芽黃素是最顯著的生物活性化合物,其次是異歐前胡素、歐前胡素等,提示為秦巴硒菇提取物的核心成分。楊芽黃素是來源于植物的一種黃酮類化合物,具有抗腫瘤逆轉耐藥、抗氧化、抗菌、抗炎等多種生物學作用[9]。異歐前胡素和歐前胡素是呋喃香豆素類化合物,在體外實驗發現異歐前胡素對人肺癌、卵巢癌、皮膚癌、中樞神經系統等多種腫瘤細胞均具有不同程度的抗腫瘤作用[10]。歐前胡素除了有抗炎、抗氧化作用外,對胃癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤有抗腫瘤作用,其可與化療藥物發揮協同效應,逆轉腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性同時降低化療藥的毒副反應[11]。上述活性成分在秦巴硒菇提取物治療CML的過程中起非常重要的作用。

Fig 7 Molecular docking diagrams between Tectochrysin and A PI3K B Akt C mTOR

Fig 8 Effects of different concentrations of drug and at different time periods on K562 cells )

PPI結果顯示秦巴硒菇提取物可能通過TP53、GAPDH、STAT3、CTNNB1、AKT1、VEGFA、JUN、mTOR等靶點治療CML。p53是腫瘤抑制因子,是細胞周期和凋亡的主要調節因子,在白血病及多種腫瘤中因突變而失活,有研究表明p53激活劑可能是治療慢性粒細胞白血病的有效方法[12]。伊馬替尼耐藥的BCR-ABL陽性細胞系中GAPDH過表達,用RNA干擾的方法敲除GAPDH,可增加耐藥細胞對伊馬替尼的敏感性[13]。在CML中,細胞受到刺激后STAT3被活化,在腫瘤細胞生長增殖、對化療藥物產生耐藥和能量代謝失調中起關鍵作用[14]。CTNNB1也被稱為β-catenin,是Wnt/β-catenin信號通路的核心蛋白,在急性髓系白血病和CML中白血病干細胞的自我更新,增殖和分化中起重要作用[15]。在PI3K/Akt/mTOR信號通路中,Akt被認為是PI3K的主要下游效應分子,可使激活的糖原合成酶激酶-3β激酶阻止細胞周期蛋白D1的降解和凋亡相關因子的激活,從而加速細胞周期發育,最終促進細胞增殖。mTOR被認為是PI3K/Akt/mTOR信號通路下游的另一個組成部分,也可以被Akt磷酸化。mTOR不僅可以整合上游信號,還可以調節P70核糖體S6蛋白激酶和4E結合蛋白1的磷酸化,從而直接促進細胞生長[16]。綜上所述,以上蛋白都可作為秦巴硒菇提取物治療CML的靶點蛋白,充分體現了秦巴硒菇提取物多成分多靶點治療疾病的特點。

Fig 9 Effect of drug on expression of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in K562 cells

KEGG通路富集分析結果顯示,PI3K/Akt信號通路富集的基因數目較多,是治療白血病的關鍵通路。研究表明,PI3K/AKT/mTOR信號通路是參與細胞增殖、凋亡和轉移的主要信號通路,該通路在CML疾病的發生發展中起重要作用。在CML中,BCR-ABL蛋白能持續激活PI3K/Akt/mTOR等下游信號通路,最終導致白血病細胞無限制的克隆性增殖。BCR-ABL通過兩種途徑影響PI3K/Akt/mTOR通路:直接通過PI3K的磷酸化;間接地通過下調或導致該信號通路的天然抑制劑磷酸酶及張力蛋白同源物的功能受損[17]。PI3K/ Akt/mTOR信號通路的失調可能導致下游信號分子的激活,PI3K是由兩個亞單位組成的異二聚體,包括調節亞單位和催化亞單位,當細胞受到生長因子刺激時,PI3K被激活并聚集在細胞膜上,將磷脂酰肌醇4,5-二磷酸轉化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸,然后磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸激活下游Akt通過磷酸化下游mTOR促進細胞生長。PI3K/Akt/mTOR通路在CML中的失調已成為藥物研究和開發的熱點,抑制該信號通路在各種類型的癌癥,特別是血液惡性腫瘤中表現出令人鼓舞的結果[16]。MAPK信號通路也與細胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡等多種生物學行為有關。在許多研究中,ERK和JNK的抑制劑有效地促進了白血病細胞的凋亡,表明抑制該信號通路可治療白血病[18]。

分子對接結果顯示,秦巴硒菇提取物的主要活性成分楊芽黃素、異歐前胡素、歐前胡素與核心靶點具有較好的結合能力,說明活性化合物與核心靶點存在相互作用,且可以形成結合能低、活性高、結構穩定的構象。這些靶點基因主要涉及參與調節細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡,免疫調節等方面。綜上所述,說明秦巴硒菇提取物可能通過與核心靶蛋白互作,作用于PI3K/Akt/mTOR等多條信號通路發揮促進白血病細胞凋亡、調節細胞周期等作用。

本課題組已經對PI3K/Akt/mTOR信號通路及凋亡、細胞周期進行了相關研究,后續研究還可選擇MAPK、JAK/STAT3通路,MicroRNAs in cancer中的ABCB1、ABCC1、ABCG2等與白血病耐藥相關的基因進行深入研究。

中藥及提取物在治療白血病方面療效顯著,但由于其存在多成分、靶點不明確、作用機制復雜等問題。本研究采用液相色譜質譜聯用技術分析提取物中的有效成分,再結合網絡藥理學和分子對接的方法,揭示了秦巴硒菇提取物通過多個靶點、多種信號通路在白血病的治療中發揮作用。并通過CCK-8、Western blot實驗驗證上述部分篩選結果,實驗結果表明秦巴硒菇提取物可以抑制白血病K562細胞增殖,并下調p-PI3K、p-Akt、p-mTOR磷酸化蛋白的水平,對CML具有良好的抑制效果。