雷公藤多苷納米粒的制備及其對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用

王志榮,李 嫚,張振強(qiáng),閆 敏,武香香,曾華輝

(河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院,河南 鄭州 450046)

雷公藤在中醫(yī)上廣泛用于治療RA,在《中華本草》中描述稱“祛風(fēng)除濕,消腫止痛,活血通絡(luò),清熱解毒”[6]。半萜類、二萜類化學(xué)成分是雷公藤所含的主要成分,這些藥效對(duì)肝臟、腎臟、心臟、生殖系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等都存在很大的毒副作用,這使得雷公藤及其制劑在治療RA過程中有一定限制[7]。雷公藤多苷(tripterygium glycosides,TG)是從雷公藤根部提取的有效成分,中國最早研究和使用的抗炎和免疫調(diào)節(jié)中藥之一,被稱為“中國首創(chuàng)植物新藥”,不僅保留了雷公藤的免疫抑制作用,而且還消除了其許多有毒成分,沒有其他中藥可以替代它在RA治療中的主要作用[8-9]。但研究發(fā)現(xiàn)隨著日用劑量加大、用藥時(shí)間延長,使用雷公藤多苷治療RA毒副作用的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)隨之增加,對(duì)肝、腎會(huì)造成一定程度的損傷[10]。因此,我們需要探索一種有效、安全的藥物載體來提高雷公藤多苷的藥理性能。

目前多從藥物炮制、中藥配伍、劑量改變、劑型修飾和常規(guī)檢測(cè)與預(yù)防等方面進(jìn)行探索,來提高藥物應(yīng)用的安全性。納米制劑被廣泛用于新劑型研發(fā)中,具有明顯的優(yōu)勢(shì),如增強(qiáng)生物相容性和靶向性,增強(qiáng)生物分布和優(yōu)化對(duì)靶器官的治療效果,提高藥物療效和減輕相關(guān)器官的毒副作用[11]。為了降低TG的毒性、在抗RA中更好發(fā)揮其免疫抗炎等作用,本研究通過將其制成雷公藤多苷納米粒,建立膠原誘導(dǎo)型(collagen-induced arthritis,CIA)動(dòng)物模型,研究其對(duì)RA的治療作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂SD大鼠,6～8周齡,體質(zhì)量(180±20)g,購自北京華阜康有限公司,許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0008。購回后在河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)。符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的認(rèn)可。

1.2 藥品與試劑聚乙二醇6k-腙鍵-甲氧聚己內(nèi)酯2k(PCL6k-HYD-MPEG2k)(西安齊岳生物科技有限公司,批號(hào):QM02202103),雷公藤多苷片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司,國家準(zhǔn)字Z31020415),雷公藤多苷(西安昊軒生物科技有限公司,LGTHS20180722,純度99%),雷公藤多苷納米顆粒(實(shí)驗(yàn)室制備)。ELISA試劑盒TNF-α、IL-6和IL-1β(欣博盛生物科技股份有限公司,批號(hào):R220617-102b、R220617-003b、R220617-007b),牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑(美國Chondrex公司,批號(hào):210532、210574)。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒,尿素氮(BUN)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒和肌酐(CRE)試劑盒(南京建成生物工程所,批號(hào)分別為:20220518、20220629、20220519、20220521)。

1.3 主要儀器酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):1510-02820C)、粒徑分析儀(Brookhaven Instruments,型號(hào):250144),電子天平(梅特勒-托儀多儀器上海有限公司,型號(hào):AL204)、透射電子顯微鏡[型號(hào):JEM-1230(HC)]。

2 方法

2.1 TG-NPs的制備方法和質(zhì)量控制稱取雷公藤多苷6 mg、PCL6k-HYD-MPEG2k 30 mg分別加入適量丙酮溶解后混合。然后放置于燒瓶中,40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至底部出現(xiàn)均勻薄膜。轉(zhuǎn)移至真空干燥箱20 ℃條件下放置12 h,除去丙酮。加入3 mL蒸餾水,800 r·min-1磁力攪拌2 h促進(jìn)薄膜水合,250 W下超聲處理5 min,促進(jìn)納米粒分散,然后過0.22 μm微孔濾膜,即得雷公藤多苷納米粒(TG-NPs)。用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài),動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)納米粒的粒徑,高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定納米粒中的藥物含量,測(cè)定包封率和納米粒性質(zhì)的穩(wěn)定性,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CIA模型的建立及分組給藥在冰浴條件下將完全弗氏佐劑與牛Ⅱ型膠原1 ∶1充分乳化。在大鼠的腳趾、尾部、背部3個(gè)部位經(jīng)皮注射混合乳劑,每只0.3 mL[12]。14 d后重復(fù)上述步驟。二次免疫后7 d,免疫組大鼠的腳趾腫脹、關(guān)節(jié)炎癥指標(biāo)均明顯升高,提示CIA模型建立成功。再隨機(jī)將其分為3組,即CIA模型組(Model)、雷公藤多苷組(TG)及雷公藤多苷納米粒組(TG-NPs)。TG組每天灌胃6.25 mg·kg-1的雷公藤多苷片[13],TG-NPs組尾靜脈注射6.25 mg·kg-1的雷公藤多苷納米粒,給藥周期為2天1次,給藥的第1天記為d 0,正常組、模型組給予等量的生理鹽水,持續(xù)20 d。

遲恒隨陵礦街道辦事處設(shè)的“陵礦振興會(huì)”幾位工程師去井采區(qū)實(shí)地感受，魏昌龍晚上要他去他家吃飯。魏住在礦里以前建的干部樓，房里的家具擺設(shè)不擠。

2.3 一般情況監(jiān)測(cè)從第2次免疫后的第7天開始,每2 d對(duì)各組大鼠的進(jìn)食、精神與活動(dòng)等進(jìn)行監(jiān)測(cè)和記錄,并檢測(cè)各給藥組對(duì)CIA大鼠體質(zhì)量的影響。

2.4 大鼠足趾腫脹度與關(guān)節(jié)炎指數(shù)的測(cè)定免疫后第7天開始,每隔1天用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠雙腳的腫脹情況,進(jìn)行評(píng)分并計(jì)算大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI),AI由所有關(guān)節(jié)炎指數(shù)之和構(gòu)成,最高分值為16分。0分:足趾正常,無關(guān)節(jié)紅腫;1分:足小趾關(guān)節(jié)紅腫;2分:趾關(guān)節(jié)、足趾的關(guān)節(jié)紅腫;3分:踝關(guān)節(jié)嚴(yán)重紅腫,或踝以下足爪紅腫;4分:踝關(guān)節(jié)和所有足趾腫脹,關(guān)節(jié)嚴(yán)重變形。

2.5 臟器指數(shù)的測(cè)定將大鼠處死后,取出其心臟、肝、腎、脾和睪丸等組織,用電子天平稱重各臟器的質(zhì)量。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/大鼠體質(zhì)量(g)×100%。

2.6 大鼠臟器組織的病理形態(tài)學(xué)觀察組織在多聚甲醛中固定24 h,用常規(guī)方法制備石蠟切片(厚度為3 μm)后,用蘇木精-伊紅(HE)染色,在顯微鏡下觀察組織的形態(tài)學(xué)變化。

2.7 大鼠膝關(guān)節(jié)與踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學(xué)觀察用藥20 d后,進(jìn)行麻醉,腹主動(dòng)脈采血,將血標(biāo)本靜置后以3 000 r·min-1離心10 min,取上層血清保存。之后取大鼠左后肢的膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié),用4%多聚甲醛溶液固定,切片并行HE與TUNEL染色,觀察病理變化。

2.8 大鼠血清中ALT、AST、BUN、CRE及TNF-α、IL-1β、IL-6含量的測(cè)定ALT、AST用微板法檢測(cè),BUN用比色法,CRE用肌氨酸氧化酶法。TNF-α、IL-1β、IL-6的水平按照ELISA試劑盒的說明書,每項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)均嚴(yán)格按照各自試劑盒的說明進(jìn)行,均用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 TG-NPs的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)

3.1.1TG-NPs的形態(tài)及平均粒徑 在電鏡下觀察到納米粒分布均勻,呈球形,有典型的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定TG-NPs的粒徑為(111.81±1.54) nm,(n=3)。PDI為0.157±0.009,表面帶負(fù)電荷,Zeta電位為(-20.85±2.74) mV,見Fig 1。

3.1.2TG-NPs包封率測(cè)定 使用高效液相法(HPLC)測(cè)定納米粒中的藥物含量,以TP為標(biāo)準(zhǔn)(加標(biāo)),在1～100 mg·L-1濃度下,TP有良好的線性關(guān)系y=18 744x-1 128.7 (r=0.999 9)。將TG-NPs超濾前總濃度及超濾后上層及下層液體濃度代入公式計(jì)算,得包封率為(73.22±0.58)%,(n=3)。

3.1.3TG-NPs的穩(wěn)定性測(cè)定 為考察TG-NPs的穩(wěn)定性,將TG-NPs分別存放在4 ℃冰箱和25 ℃環(huán)境下。結(jié)果如Fig 2所示,在4 ℃條件下,納米粒的粒徑、PDI及Zeta電位都保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),當(dāng)納米粒保存在25 ℃條件下,粒徑及PDI變化程度較大,表明7 d內(nèi)納米粒可以在4 ℃條件下穩(wěn)定存在,且直至20 d基本上無變化。為模擬體內(nèi)環(huán)境,將TG-NPs分別加入PBS和DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS),并置于恒溫?fù)u床中(100 r·min-1,37 ℃),于特定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)粒徑、PDI及Zeta電位。結(jié)果顯示,在PBS中,粒徑與在去離子水中相比有所增加,但還是保持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),Zeta電位均有較為明顯的下降;在DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)中,納米粒的粒徑及Zeta電位在去離子水中有所下降,PDI較在去離子水中明顯升高。

3.2 TG-NPs對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響免疫后,大鼠會(huì)出現(xiàn)乏力、尿量增多、食欲下降等癥狀。如Fig 3顯示,與正常組相比,其余各組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01);給藥治療后,TG-NPs組大鼠體質(zhì)量相較于模型組明顯提高(P<0.05)。

3.3 TG-NPs對(duì)大鼠足趾腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響與正常組比較,各組大鼠足趾腫脹度與關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯增加(P<0.01);與模型組比較,給藥組大鼠腫脹度與關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低(P<0.05),其中TG-NPs組療效優(yōu)于TG組(P<0.05),如Fig 4。

Fig 1 Morphology, size distribution and potential distribution of nanoparticles under transmission electron microscopy

Fig 2 TG-NPs size, PDI, Zeta in different environments n=3)

Fig 3 Changes of body weight in each group n=6)

3.4 TG-NPs對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響與正常組相比,各組大鼠的脾、腎、睪丸指數(shù)均明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);各組的肝指數(shù)均降低,差異沒有顯著性。見Tab 1。

3.5 TG-NPs對(duì)大鼠心臟、肝、脾、腎和睪丸組織病理形態(tài)學(xué)的影響心臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示:大鼠各組的心肌細(xì)胞形態(tài)正常,排列清晰,無明顯差異。肝臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示:大鼠肝細(xì)胞正常組無腫脹變形,肝索排列整齊;模型組排列較紊亂,部分細(xì)胞稍腫脹呈空泡狀,炎性細(xì)胞浸潤;TG組肝細(xì)胞排列紊亂,胞質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀,炎性細(xì)胞浸潤明顯;TG-NPs組肝細(xì)胞排列較整齊、炎性細(xì)胞浸潤不明顯,形態(tài)接近正常。脾臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示,正常組脾臟小體呈圓形,結(jié)構(gòu)清晰;模型組白髓結(jié)構(gòu)紊亂,有大量凋亡小體;TG組白髓結(jié)構(gòu)稍紊亂,有部分凋亡小體;TG-NPs組較TG組明顯改善,白髓損傷明顯減少。腎臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示:正常組與模型組腎小管細(xì)胞排列緊密,腎臟腎小球結(jié)構(gòu)完整,管腔清晰可見;TG組腎小球萎縮明顯,間質(zhì)內(nèi)纖維組織彌漫性增多。與TG組相比,TG-NPs組腎組織病變明顯減輕。睪丸組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示:正常組大鼠睪丸形態(tài)正常,細(xì)胞層次寬,間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育良好,管腔內(nèi)絲狀精子細(xì)胞排列緊密,模型組大鼠管腔內(nèi)絲狀精子細(xì)胞少于正常對(duì)照組。在TG的毒性作用下,大鼠曲細(xì)精管出現(xiàn)萎縮變形,且管腔內(nèi)精子細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常組。與TG組相比,TG-NPs組大鼠的睪丸組織病變有所減輕。見Fig 5。

Tab 1 Heart, liver, spleen, kidney and testis indexes of rats in each n=6, %)

Fig 4 Changes in swelling degree of left (A) and right (B) foot and scores of arthritis index (C) in each group n=6)

Fig 5 Pathological micrograph of heart tissue of each group of mice stained with HE (×200)

3.6 TG-NPs對(duì)大鼠膝、踝關(guān)節(jié)滑膜HE染色的影響如Fig 6所示,正常組大鼠足趾正常,模型組大鼠足趾與踝關(guān)節(jié)腫脹明顯,并伴有嚴(yán)重變形。TG組相比模型組腫脹較輕,變形不明顯,TG-NPs組腫脹程度明顯改善。從HE染色觀察膝踝關(guān)節(jié)病理學(xué)變化,正常組細(xì)胞排列均勻整齊,細(xì)胞核清晰可見,著色均勻,未見滑膜增厚和血管新生;而模型組細(xì)胞排列雜亂,滑膜重度增生,部分細(xì)胞核壞死,著色不均,可見缺損和血管翳形成;TG相比于模型組,輕度增生,輕度血管新生及部分炎癥細(xì)胞浸潤;TG-NPs組細(xì)胞排列相對(duì)整齊,著色均勻,沒有明顯的增生,血管新生少,炎癥細(xì)胞浸潤少。提示經(jīng)過治療后,TG-NPs組對(duì)大鼠滑膜改善作用最為明顯。

3.7 TG-NPs對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)滑膜TUNEL染色的影響如Fig 7所示,大鼠滑膜TUNEL染色后,陽性凋亡細(xì)胞核為棕黃色。模型組的滑膜細(xì)胞有少量的凋亡,TG組相較于模型組滑膜細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05),TG-NPs組相較于其他組滑膜細(xì)胞凋亡指數(shù)升高明顯(P<0.01)。

3.8 TG-NPs對(duì)大鼠血清中AST、ALT、BUN、CRE和TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響如 Tab 2所示,與正常組相比,除BUN之外,所有模型組均有明顯增加(P<0.05),TG-NPs組大鼠中的ALT、BUN、CRE水平相較于模型組明顯降低(P<0.05),CRE水平相較于TG組下降明顯(P<0.05)。大鼠血清中的炎癥因子,相比于正常組,模型組大鼠中TNF-α、IL-1β含量均明顯增加(P<0.01),TG-NPs組均明顯低于模型組(P<0.05),且效果優(yōu)于TG組。見Tab 3。

Fig 6 Photographs of right hind foot and histopathological analysis of knee and ankle (HE,×200)

Tab 2 Levels of ALT, AST, BUN and CRE in serum of each group n=6)

Tab 3 Influence of serum inflammatory

4 討論

RA是一種慢性全身性免疫疾病,通常表現(xiàn)為滑膜組織中炎癥因子的過度分泌、關(guān)節(jié)軟骨的侵蝕和血管翳的形成。 與其他幾種關(guān)節(jié)炎模型相比,大鼠膠原蛋白誘導(dǎo)的Ⅱ型關(guān)節(jié)炎(CIA)模型在病理學(xué)上與人類RA相似,目前普遍被作為RA的最佳模型[14]。在本研究中,通過皮下注射混合乳劑,在背部和掌墊的多個(gè)部位,建立大鼠CIA模型。 與正常組相比,模擬大鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕,尿量和食物消耗減少,腳趾關(guān)節(jié)腫脹變形,影響正常的活動(dòng),關(guān)節(jié)炎指數(shù)增加,表明CIA模型成功。

滑膜組織中炎癥因子的過度產(chǎn)生是RA免疫病理的一個(gè)重要因素。這些因素包括TNF-α、IL-1β和IL-6。TNF-α已被證明可引起RA患者的各種T細(xì)胞功能障礙,在RA的活動(dòng)期和晚期其分泌量增加,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增加,骨和關(guān)節(jié)破壞惡化[15]。IL-1β調(diào)節(jié)幾種炎癥因子的表達(dá),促使炎癥因子的協(xié)同增加。另一個(gè)重要的促炎因子IL-6作用于中性粒細(xì)胞,誘發(fā)炎癥并可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[16]。成纖維滑膜細(xì)胞(fibroblast-likesynoviocyte,FLS)凋亡不足在RA的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用:當(dāng)RA患者的微環(huán)境發(fā)生改變時(shí),FLS無法凋亡,開始異常增殖,釋放出大量的細(xì)胞因子,刺激滑膜細(xì)胞增殖、嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤、血管翳形成和隨后的骨和關(guān)節(jié)侵蝕[17]。

納米粒是由天然或合成的高分子材料制成。納米載體可以將治療藥物運(yùn)送到靶點(diǎn),改善生物分布、藥代動(dòng)力學(xué)、穩(wěn)定性和可溶性,并減少藥物的毒副作用。本實(shí)驗(yàn)通過制備TG-NPs,得到符合小鼠尾靜脈的理想粒徑[(111.81±1.54) nm],相較TG原藥,納米粒藥物組的生化指標(biāo)AST、ALT、BUN、CRE均明顯下降,且有效減輕了TG對(duì)腎或肝等臟器的有害影響(Fig 5),說明TG以納米粒作為載體后能起到明顯減毒作用,明顯提高TG的用藥安全性。同時(shí),TG-NPs治療組大鼠的足趾腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降,體質(zhì)量增加。TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)明顯降低,其表達(dá)與大鼠的足趾腫脹、AI指數(shù)嚴(yán)重程度成正比,而與體質(zhì)量成負(fù)比。此外,還觀察到納米粒組大鼠凋亡指數(shù)明顯升高,炎性細(xì)胞浸潤減少。表明本實(shí)驗(yàn)制備的雷公藤多苷納米粒可能通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá),促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡,減輕CIA大鼠的炎癥反應(yīng),保護(hù)軟骨和關(guān)節(jié)滑膜,達(dá)到改善RA的目的。

綜上所述,TG-NPs對(duì)CIA有較好的治療作用,單獨(dú)使用TG的毒副作用得到改善。這證明了所建立的納米給藥系統(tǒng)與其他常規(guī)藥物相比,對(duì)RA具有優(yōu)越的效果和較高的藥物安全性,對(duì)今后的研究和開發(fā)具有參考價(jià)值。