異硫氰酸芐酯通過激活p53和AMPK-FOXO1a信號(hào)通路誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡

塔瑪莎·庫(kù)爾曼江,王小靜,李欣奕,王 昊,解國(guó)軒,陳雲(yún)杰,溫 婷,程夕露,努爾阿米乃·麥麥提,李金玉

(新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830054)

宮頸癌是全球女性癌癥相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要原因之一。2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例60.4萬,發(fā)病率15.6/100 000;死亡病例34.2萬,死亡率8.8/100 000[1]。盡管通過人乳頭瘤病毒 (human papilloma virus,HPV) 疫苗接種和篩查可高度預(yù)防宮頸癌。對(duì)已經(jīng)感染HPV的中晚期宮頸癌患者,仍迫切需要尋找新的高效、低毒抗宮頸癌藥物。

通過飲食蔬菜和水果是有效預(yù)防癌癥的手段。異硫氰酸酯(isothiocyanates,ITCs)是廣泛存在擬南芥、油菜、旱金蓮、水芹、卷心菜、甘藍(lán)、蘿卜等十字花科蔬菜中的一種天然抗癌活性分子,是由前體硫苷在體內(nèi)黑芥子酶作用下水解而來[2]。到目前為止,已經(jīng)報(bào)道了幾十種天然的或半合成的異硫氰酸鹽,以萊菔硫烷(sulforaphane,SFN)、苯乙基異硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)和異硫氰酸芐酯(benzyl isothiocyanate,BITC)報(bào)道較多。BITC在結(jié)構(gòu)上帶有一個(gè)芳香環(huán)側(cè)鏈和一個(gè)高度親電的碳原子中心,水解時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),因此造成脫氧核糖核酸氧化損傷[3]。研究證實(shí),BITC是一種有效的化學(xué)保護(hù)劑,它可以防止嚙齒類動(dòng)物的化學(xué)致癌作用,同時(shí)也具有抗癌作用。在不同的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),BITC能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、抑制細(xì)胞遷移和侵襲、抑制血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。其中,乳腺癌、胰腺癌、肺癌是報(bào)道較多的腫瘤[4-5]。此外,研究證明,BITC對(duì)正常組織無毒性,是一種安全的有潛力的抗癌活性物質(zhì)[6]。然而,BITC對(duì)宮頸癌的作用及其機(jī)制未有詳盡報(bào)道。本研究初步評(píng)估了BITC對(duì)小鼠宮頸癌細(xì)胞U14的細(xì)胞毒性,通過RNA-seq分析、qRT-PCR及Western blot方法探討了BITC抑制U14細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,為開發(fā)和利用BITC用于宮頸癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物BITC(98%,C7H2F3NS)購(gòu)于上海源葉公司,使用前溶于DMSO中,配置成200 mmol·L-1的母液,過濾除菌后,4 ℃冰箱儲(chǔ)存,使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)液對(duì)其進(jìn)行稀釋。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將U14細(xì)胞(新疆醫(yī)科大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室)接種在含DMEM培養(yǎng)皿(含10% FBS和1%雙抗)中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 試劑MTT(3(- 4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;順鉑(Cisplatin)購(gòu)自上海源葉生物有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗(青霉素10 kU·mL-1和鏈霉素10 g·L-1混合液),胎牛血清(FBS)購(gòu)自BI公司;BCA蛋白定量試劑盒,ECL顯色劑,β-actin、Bcl-2、CytC、Bax、p21、MDM2、Cyclin D3、CDK2、Cyclin E、AMPK、Foxo1α二抗山羊抗兔IgG購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;caspase 3/7/9、cleaved caspase-3/7/9購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.4 儀器DYCZ-24DN型電泳槽(北京六一),DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜槽(北京六一),DYY-10C型電泳儀(北京六一),Illumina 測(cè)序平臺(tái)(上海美吉生物公司),Cytoflex流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)

1.5 方法

1.5.1MTT法檢測(cè)U14細(xì)胞增殖活性 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照2×103/孔接種于96孔板中培養(yǎng),每孔100 μL,37 ℃過夜培養(yǎng)24 h后,棄上清,用BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)和0.1% DMSO(相當(dāng)于60 μmol·L-1BITC工作液中DMSO的濃度)分別處理U14細(xì)胞24、48、72 h,以不加配合物為空白對(duì)照,Cisplatin為陽性對(duì)照。每個(gè)組別設(shè)置6個(gè)平行孔。將上清吸出,在避光的環(huán)境下,每孔內(nèi)添加無血清培養(yǎng)基配置的MTT 100 μL,細(xì)胞培養(yǎng)4 h后,吸出上清,再加入200 μL DMSO,振蕩孵育10 min,使其充分溶解結(jié)晶紫。酶標(biāo)儀490 nm處讀取每孔吸光度值,按照如下公式計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活性:

細(xì)胞的相對(duì)活性=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值×100%

1.5.2Hoechst staining 33258染色法檢測(cè)細(xì)胞核形變化 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U14細(xì)胞按照1×105/孔接種于24孔板中于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,加入不同終濃度的BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h后,每孔添加預(yù)冷的4%多聚甲醛500 μL,4 ℃冰箱固定10 min,固定后,每組細(xì)胞用PBS洗滌,滴加用PBS溶液稀釋的Hoechst 33258染色溶液以1 ∶100,孵育5 min,用PBS洗滌3次(5 min/次),然后直接使用熒光顯微鏡觀察染色。

1.5.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U14細(xì)胞按照8×105/皿接種到60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,用不同終濃度的BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)處理12 h后,1 200 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞,收集的細(xì)胞沉淀用30 μL PBS重懸后,每個(gè)樣品分別加入膜聯(lián)蛋白V-FITC染液5 μL和PI染液5 μL,冰上避光孵育30 min;對(duì)于細(xì)胞周期,細(xì)胞沉淀先用70%乙醇固定過夜,去除乙醇后,用30 μL PBS重懸細(xì)胞,然后每個(gè)樣品加入PI染液5 μL冰上避光染色30 min,充分混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布。

1.5.4轉(zhuǎn)錄組樣品和數(shù)據(jù)處理 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照5×106/皿接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h后,用不同終濃度的BITC(0、20 μmol·L-1)分別處理U14細(xì)胞6 h 和18 h 后取樣。每個(gè)處理做3個(gè)生物學(xué)平行組。以不加BITC作為空白對(duì)照,培養(yǎng)6 h的3個(gè)空白對(duì)照組分別標(biāo)記為K6-1、K6-2、K6-3。BITC處理6 h的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別標(biāo)記為B6-1、B6-2、B6-3,培養(yǎng)18 h的空白對(duì)照組分別標(biāo)記為K18-1、K18-2、K18-3。 BITC處理18 h的實(shí)驗(yàn)組分別標(biāo)記為B18-1、B18-2、B18-3。共計(jì)12個(gè)樣品用錫箔紙包裹后立即置于液氮中速凍。

采用TRIzol試劑盒提取樣品RNA,利用瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度,質(zhì)量合格后,進(jìn)一步富集純化mRNA,片段化逆轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA。然后依次末端修復(fù),拼接,PCR擴(kuò)增構(gòu)建cDNA文庫(kù)。使用Illumina Novaseq 6000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得原始數(shù)據(jù)(raw data),采用Fastp分析軟件對(duì)raw data進(jìn)行過濾,去除接頭和低質(zhì)量的reads后得到Clean data。使用Hisat軟件,將Clean data和參考基因組進(jìn)行比對(duì),獲得后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(mapped reads)。

1.5.5表達(dá)量分析及差異基因篩選 利用RSEM軟件對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析,使用轉(zhuǎn)錄組條目(TPM)為表達(dá)量指標(biāo),進(jìn)行樣本間基因差異的表達(dá)分析。使用DESeq2軟件并以P<0.05、Fold Change(FC)≥2和FC≤0.5為篩選條件獲得比較組間差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。

1.5.6GO功能和KEGG富集分析 利用Blast2GO軟件將DEGs在GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得GO功能注釋,利用Goatools軟件對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析;將DEGs在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得KEGG通路注釋信息。采用Fisher精確檢驗(yàn),以P<0.05時(shí)表示GO功能和KEGG通路出現(xiàn)了顯著富集。

1.5.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析 BITC(0、20 μmol·L-1處理細(xì)胞6 h后采用TRIzol試劑盒提取樣品總RNA,利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物 (Tab 1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按SuperReal熒光定量預(yù)混試劑盒說明書,以β-actin為內(nèi)參基因,采用相對(duì)比較2-ΔΔCt法對(duì)部分差異基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè),應(yīng)用GraphPad Prism 9軟件作圖分析。

Tab 1 Ire1a,Aft4,β- actin and other gene primers design

1.5.8Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照5×106/皿接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后,加入不同濃度的BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)處理12 h,離心收集細(xì)胞,加入RIPA裂解液冰上裂解20 min,離心保留上清,使用BCA法對(duì)細(xì)胞上清中的總蛋白含量進(jìn)行定量。總蛋白采用12% SDS-PAGE電泳分離后,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(PVDF)膜。使用5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h后,TBST洗滌3次,15 min/次,加入一抗(β-actin、Bcl-2、Bax、CytC、caspase-3/7/9、cleaved caspase-3/7/9)37 ℃ 孵育2 h,TBST洗滌3次,然后加入二抗(HRP 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG )37 ℃ 孵育1 h,TBST 洗滌3次,按1 ∶1比例加入發(fā)光A液和B液,暗室顯色,用凝膠成像儀觀察顯影蛋白條帶。

1.5.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用Graphpad prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)均顯示為mean±SD,n=3。采用單因素方差分析。與Control相比,P<0.05具有差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 BITC對(duì)U14細(xì)胞活力的影響用不同濃度的BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)處理細(xì)胞 24、48、72 h后,BITC顯著抑制了U14細(xì)胞的增殖作用 (P<0.001) (Fig 1A),72 h的抑制率分別為62.63%、92.56%、95.42% (Fig 1B),3個(gè)時(shí)間段的IC50值分別是22.54 μmol·L-1、15.39 μmol·L-1、12.43 μmol·L-1。與Control組相比,隨著BITC處理濃度的增加,細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓,貼壁能力減弱,細(xì)胞數(shù)量顯著下降(Fig 1C)。

2.2 BITC誘導(dǎo)了U14細(xì)胞核DNA凝聚不同濃度的BITC (0、20、40、60 μmol·L-1)作用HeLa細(xì)胞24 h后,采用Hoechst 33258染色,倒置熒光顯微鏡觀察,如Fig 2所示,Control組可見細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞染色均勻,但BITC組染色質(zhì)濃縮,藍(lán)白熒光強(qiáng),且隨著濃度增加,細(xì)胞熒光比例增加,核碎片現(xiàn)象加重,表明BITC 作用于細(xì)胞DNA,可能誘導(dǎo)U14細(xì)胞凋亡。

2.3 BITC誘導(dǎo)U14細(xì)胞阻滯如Fig 3所示,BITC 處理U14細(xì)胞12 h后,顯著增加了G0/G1期細(xì)胞比例(P<0.05),降低了S期細(xì)胞分布(P<0.01)。同時(shí),也觀察到G2/M期細(xì)胞隨著濃度增加先上升后降低。揭示BITC主要誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。

2.4 BITC誘導(dǎo)U14細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療癌癥的手段之一。細(xì)胞凋亡途徑主要有外源性死亡受體途徑、內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、內(nèi)源性線粒體途徑[7]。為了進(jìn)一步確認(rèn)BITC是否誘導(dǎo)了U14 細(xì)胞凋亡,不同濃度的BITC(0、20、40、60 μmol·L-1)作用U14細(xì)胞12 h 后,通過Annexin V-PI雙染,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析顯示,與Control相比,隨著 BITC濃度的增加,BITC劑量依賴性地誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡(P<0.05,P<0.01),細(xì)胞凋亡率從最初的7.81%上升到86.4%(Fig 4A)。Western blot進(jìn)一步分析顯示(Fig 4B),與Control相比,促凋亡蛋白Bax、CytC、cleaved caspase-3/9表達(dá)顯著增加(P<0.05和P<0.01),抑制凋亡蛋白Bcl-2、caspase-3/7/9、cleaved caspase-7蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)。這些結(jié)果表明,BITC可通過線粒體途徑誘導(dǎo)U14細(xì)胞凋亡。

Fig 1 Effect of BITC on proliferation of U14

Fig 2 The morphological changes of U14 cells after BITC treatment detected by Hochest 33258 stainingThe arrows indicate the chromosomal condensation.

Fig 3 Cell cycle distrubution in U14 cells upon BITC *P<0.05,**P<0.01 vs Control group.

Fig 4 Effect of BITC on apoptosis of U14

2.5 差異基因篩選采用RSEM軟件和DESeq2軟件進(jìn)行差異篩選分析,如圖Fig 5所示,經(jīng)BITC 6 h處理后,以空白組作為對(duì)照,在BITC處理組細(xì)胞中共獲得2 447個(gè)DEGs,其中下調(diào)基因1 308個(gè),上調(diào)基因1 139個(gè)。經(jīng)BITC 18 h 處理后,共獲得1 824個(gè)DEGs,其中下調(diào)DEGs有883個(gè),上調(diào)DEGs有941個(gè)。由于BITC作用6 h的差異基因較多,以下通路富集分析主要呈現(xiàn)6 h轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

Fig 5 Number of DEGs in U14 cells after treatment of BITC for 6 h or 18 h in comparison to control

2.6 GO功能注釋和分類分析對(duì)DEGs進(jìn)行功能分類,主要包括三個(gè)類別:生物過程(biological process,BP)、 細(xì)胞組分(cellular composition,CC)和分子功能(molecular function,MF)。經(jīng) BITC處理U14細(xì)胞6 h后,統(tǒng)計(jì)富集DEGs數(shù)量排名前20的功能分類(Fig 6)。DEGs富集于BP的主要有:細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)(1 475個(gè)基因)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)(1 253個(gè)基因);富集于CC的有:細(xì)胞成分(cell part)(1 766個(gè)基因),細(xì)胞器(organelle)(1 233個(gè)基因),細(xì)胞器成分(organelle part)(1 027個(gè)基因);富集于MF的主要有:結(jié)合(binding)(1 569個(gè)基因)。

Fig 6 TOP 20 GO function annotation and classification

2.7 KEGG通路富集分析對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG通路富集統(tǒng)計(jì),柱狀圖(Fig 7)展現(xiàn)前20個(gè)顯著的富集途徑。如Fig 7顯示,BITC作用U14 6 h后,DEGs主要富集在細(xì)胞周期(Cell cycle)、MicroRNAs in cancer、 FOXO信號(hào)通路、Fanconi anemia patlravay 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、p53信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡等途徑(P<0.05)。

Fig 7 TOP 20 KEGG enrichment of DEGs in U14

2.8 細(xì)胞通路分析及驗(yàn)證

2.8.1BITC通過p53信號(hào)通路誘導(dǎo)U14細(xì)胞周期阻滯 p53參與各種生物反應(yīng)的激活,主要包括調(diào)控細(xì)胞周期停滯、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡。KEGG pathway分析表明,在BITC處理U14 6 h 后,參與p53信號(hào)通路的差異基因有18個(gè)(Fig 8),其中有9個(gè)基因表達(dá)上調(diào),如鼠雙微體(murine double minute 2,Mdm2)基因,細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,P21)基因;下調(diào)基因9個(gè),如細(xì)胞周期基因CyclinD3、CyclinE,細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2基因(cyclin-dependent kinase2,CDK2)。

根據(jù)流式細(xì)胞周期與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果,為了驗(yàn)證 BITC是否通過調(diào)控p53細(xì)胞通路將U14細(xì)胞阻滯在G0/G1期,我們采用qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證上述基因及相關(guān)蛋白,如Fig 9A、9B所示,P21基因,MDM2基因及蛋白均表達(dá)上調(diào),G0/G1期相關(guān)調(diào)控基因CyclinD3基因,CyclinE基因,Cdk2基因及蛋白均下調(diào)。p53基因雖在轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化(與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致),但在蛋白水平顯著上升,這可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。綜上所述,BITC可通過調(diào)控p53信號(hào)通路將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

2.8.2BITC也可通過內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)U14細(xì)胞凋亡 對(duì)BITC作用U14細(xì)胞6 h富集在細(xì)胞凋亡途徑中的DEGs分析發(fā)現(xiàn)(Fig 10),盡管沒有看到caspase的變化,但下游信號(hào)的切割作用底物,如促進(jìn)細(xì)胞皺縮和膜泡發(fā)生的Actin基因表達(dá)上調(diào),而與有絲分裂相關(guān)的微管蛋白α-tubulin以及與DNA周期,復(fù)制,分化,凋亡相關(guān)的核纖層蛋白Lamin基因下調(diào),表明BITC引發(fā)了凋亡。此外,轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活肌醇酶1a (inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease-1,Ire1a)基因,轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4,Atf4)基因,C/EBP轉(zhuǎn)錄因子(C/EBP homologous protein,CHOP)基因表達(dá)上調(diào)。我們又進(jìn)一步通過qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證了BITC是否通過另一內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如Fig 11所示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激Ire1a基因、Atf 4基因、CHOP基因及蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05),表明BITC也可通過內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑( endoplasmic reticulum stress,ERS)誘導(dǎo)U14細(xì)胞凋亡。

Fig 8 p53 signaling pathway diagram of BITC on U14 cells

Fig 9 Effect of BITC on expression of p53 and cell cycle related molecules

2.8.3腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)-叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞家族S(forkhead box O,FOXO)通路在BITC誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用 AMPK是細(xì)胞發(fā)育重要的調(diào)控因子。FOXO作為AMPK調(diào)控的下游轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)控靶基因參與細(xì)胞死亡、存活以及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,這些途徑對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、周期阻滯、分化等功能至關(guān)重要[8]。KEGG pathway分析表明,在BITC處理6 h 后,U14細(xì)胞參與FOXO通路的差異基因有31個(gè)(Fig 12),其中有20個(gè)基因表達(dá)上調(diào),如AMPK基因,生長(zhǎng)阻滯與DNA損傷基因(growth arrest and DNA damage inducible alpha,Gaadd45a),生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白45 g(growth arrest and DNA damage inducible protein 45g,Gadd45g)基因。11個(gè)基因表達(dá)下調(diào),如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad3、p38,細(xì)胞周期蛋白B (Cyclin B)基因、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase2,CDK2)基因。

我們進(jìn)一步通過Western blot法檢測(cè)了FOXO通路相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)AMPK,FOXO1a蛋白表達(dá)上調(diào)(Fig 13),推測(cè)AMPK-FOXO通路可能參與BITC誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。

3 討論

ITCs是十字花科主要的次生代謝產(chǎn)物,定位于細(xì)胞質(zhì)中,是由前體硫苷在體內(nèi)黑芥子酶作用下水解而來,在植物受損時(shí)釋放,可阻止多環(huán)芳香烴、偶氮染料、亞硝胺等多種致癌物在嚙齒類動(dòng)物中誘發(fā)的腫瘤生成。BITC不僅已證實(shí)是具有化學(xué)預(yù)防癌癥活性的ITC,且是一種在多種細(xì)胞模型中能夠降低細(xì)胞活性并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的藥物[9]。然而,盡管該化合物的抗癌活性已在許多癌癥中驗(yàn)證,但在宮頸癌中的作用及機(jī)制尚未闡明。

Fig 10 Apoptosis pathway of U14 cells induced by BITC

Fig 11 Effect of BITC on expression of endoplasmic reticulum stress related molecules

Fig 12 FOXO1a pathway of BITC on U14 cells

Fig 13 Western blot analysis of expression

**P<0.01vsControl group

本研究發(fā)現(xiàn),BITC呈濃度和時(shí)間依賴性地抑制了小鼠宮頸癌U14細(xì)胞的增殖,其72 h作用的半致死劑量IC50已達(dá)到12.43 μmol·L-1。倒置顯微鏡觀察,隨著BITC藥物濃度的增加,U14細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,細(xì)胞數(shù)量急劇下降,表明BITC體外對(duì)U14具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

癌癥一大特征是癌細(xì)胞失控性增殖,其分子機(jī)制往往是細(xì)胞周期的紊亂引起癌細(xì)胞過度增殖[10]。當(dāng)DNA發(fā)生損傷后,細(xì)胞周期會(huì)停滯在兩個(gè)關(guān)鍵的檢查點(diǎn)(G1/S和G2/M期),抑癌基因p53主要在G1期檢查點(diǎn)起作用。p53可以作為轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)下游蛋白(p21、GADD45、Bax)產(chǎn)生,從而調(diào)控細(xì)胞周期或細(xì)胞凋亡[11],這取決于DNA損傷的程度以及細(xì)胞類型[12]。Xie等[13]發(fā)現(xiàn),BITC能夠增加乳腺癌細(xì)胞中的p53磷酸化,而另一研究中相反,p53已被證明是人結(jié)腸細(xì)胞CCD-18Co中BITC抑制細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)因子[14]。本研究中,采用PI單染流式分析發(fā)現(xiàn)BITC主要將U14細(xì)胞阻滯在G0/G1期;轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及qRT-PCR和Western blot分析共同揭示p53信號(hào)通路參與細(xì)胞周期調(diào)控。

誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是許多抗癌藥物抑制癌細(xì)胞的主要機(jī)制[15]。細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞形態(tài)皺縮,細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生凝聚,晚凋時(shí)細(xì)胞核還會(huì)發(fā)生碎片化,并形成凋亡小體。Hochest 33258染色結(jié)果表明,BITC可誘導(dǎo)U14細(xì)胞核DNA凝聚,與BITC對(duì)卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞相同的是[16],它們都能觀察到細(xì)胞核可見的顆粒狀熒光,初步推測(cè)其為凋亡小體。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,分析發(fā)現(xiàn)BITC劑量依賴性地增加了細(xì)胞凋亡率,表明BITC誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。這與轉(zhuǎn)錄組KEGG分析的結(jié)果相一致。

外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性途徑(包含線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑)是細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要途徑,這兩條途徑匯聚最終激活下游凋亡蛋白酶caspase從而引發(fā)凋亡。線粒體途徑主要受控于Bcl-2家族蛋白,通過促凋亡蛋白(Bax、Bak等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL等)的相互作用,從而對(duì)線粒體膜的通透性產(chǎn)生影響,繼而觸發(fā)凋亡釋放因子的釋放,由此激活上游凋亡起始子caspase-9,造成下游效應(yīng)分子caspase-3、7被激活,通過切割相應(yīng)的底物(lamin、actin、α-tublin、PARP等),最后引發(fā)細(xì)胞凋亡[17]。Western blot結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),BITC使促凋亡蛋白 Bax上調(diào),而下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的水平,引起了線粒體促凋亡信號(hào)CytC的釋放,將caspase-9激活之后,繼而激活了下游效應(yīng)分子caspase-3。研究發(fā)現(xiàn)caspase-3和-7在細(xì)胞凋亡中具有重疊但不同的作用,二者具有細(xì)胞類型和刺激依賴性[15]。本研究中,BITC沒有激活caspase-7,表明caspase-3是BITC主要的線粒體凋亡依賴途徑。這一研究結(jié)果與另一異硫氰酸酯SFN在抗宮頸癌的作用機(jī)制類似[18]。此外,本研究中未檢測(cè)到經(jīng)典凋亡通路下游切割底物cleave-PARP的表達(dá),這可能與轉(zhuǎn)錄后翻譯、調(diào)控有關(guān)。

細(xì)胞在應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯(cuò)誤折疊蛋白和鈣離子平衡紊亂時(shí),會(huì)通過Ire1、PERK、ATF6通路啟動(dòng)另一內(nèi)源性凋亡途徑[19]。許多中草藥及其有效成分通過ERS通路發(fā)揮抗宮頸癌作用[20-22]。本研究中,對(duì)細(xì)胞凋亡通路富集的DEGs分析發(fā)現(xiàn):內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑Ire1α、ATF4、CHOP基因表達(dá)升高。進(jìn)一步通過qRT-PCR和western blot驗(yàn)證這些分子的表達(dá),與預(yù)期結(jié)果相一致,提示ERS在BITC誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡中扮演者重要的角色。有趣的是SFN預(yù)處理經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞,下調(diào)了GRP78、CHOP、Bax 和capase-3、Bcl-2水平,減少了ERS依賴性細(xì)胞凋亡[23]。BITC是否也在非癌細(xì)胞具有相同的保護(hù)作用,值得進(jìn)一步研究。

AMPK是細(xì)胞全身能量穩(wěn)態(tài)的中樞能量傳感器和調(diào)節(jié)器[24],一旦激活,AMPK可以促進(jìn)分解代謝產(chǎn)生ATP,從而幫助細(xì)胞逃避死亡并導(dǎo)致耐藥性和轉(zhuǎn)移。然而,AMPK也與p53和LKB1等腫瘤抑制基因呈正相關(guān)[25],最新的研究證明AMPK的藥理激活能夠抑制各種癌細(xì)胞生長(zhǎng)[26-27],但AMPK在癌癥中的雙重作用機(jī)制仍未闡明。FOXO1蛋白家族是一大類轉(zhuǎn)錄因子,參與或協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控,在哺乳動(dòng)物中主要有四個(gè)亞型,其中FOXO1a轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子,在抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮作用[28]。有研究表明,二甲雙胍通過激活A(yù)MPK-FOXO1a信號(hào)通路抑制雌激素依賴性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)[29]。用AICAR(5-氨基咪唑-4-甲酰胺1-β-D-呋喃核糖苷)和氨甲蝶呤聯(lián)合處理乳腺癌MCF-7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)二者通過激活A(yù)MPK和FOXO1a而阻滯MCF-7細(xì)胞周期并逆轉(zhuǎn)其Warburg代謝[30]。本研究中,KEGG分析發(fā)現(xiàn)FOXO1a通路是DEGs主要富集的通路,進(jìn)一步通過Western blot 法檢測(cè)到AMPK及FOXO1a蛋白表達(dá)顯著增高,表明BITC可能通過調(diào)控AMPK-FOXO1a通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或阻滯細(xì)胞周期,下一步尚需通過細(xì)胞模型和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上,體外和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明,BITC誘導(dǎo)了U14細(xì)胞周期阻滯,通過線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這與p53信號(hào)通路、AMPK-FOXO1a通路密切相關(guān)。這些研究為BITC預(yù)防或治療宮頸癌提供了新的靶點(diǎn)。