丹酚酸B抑制HuH-7細胞的Hippo/YAP通路機制研究

余新梅, 李利利, 張 傲, 鄧 潔, 楊 雁

(安徽醫科大學 1.基礎醫學院、2.第一臨床醫學院、3.第二臨床醫學院,安徽 合肥 230032)

肝癌是最常見的原發性惡性腫瘤之一,是一種高度異質性疾病。近年來,肝癌的死亡率和發病率都呈上升趨勢[1]。在肝癌的治療藥物中,中藥由于其毒副作用小、安全經濟等優點受到了越來越多的關注。丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)是丹參中含量最豐富、生物活性最強的活性成分。它是一種酚類化合物,含有多種酚羥基,因此具有很強的抗氧化活性[2]。Sal B的抗氧化和抗纖維化特性已在先前的研究中得到證實[3]。并且Sal B已被證實能抑制肝癌細胞(HepG2)的遷移和侵襲,促進肝癌細胞(Bel-7404 和SK-Hep-1)的自噬并誘導其凋亡[4-5]。為了進一步明確Sal B的抗肝癌作用,本研究選擇了HuH-7 細胞探究Sal B是否通過Hippo/YAP信號通路抑制HuH-7 細胞。

Hippo/YAP信號通路是20年前在黑腹果蠅組織生長篩選中首次發現的。它是抑制果蠅組織生長的關鍵信號通路[6]。作為Hippo/YAP信號通路的核心,轉錄共激活因子Yes相關蛋白(transcriptional co-activators Yes-associated protein,YAP)和帶有PDZ結合基序的轉錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ)是Hippo/YAP信號通路的關鍵效應因子[7]。一旦Hippo/YAP信號通路被激活,其上游分子絲/蘇氨酸蛋白激酶(mammalian sterile 20-like kinase 1/2,MST1/2)就會被激活而磷酸化,從而磷酸化其下游分子大腫瘤抑制因子1/2(large tumor suppressor 1/2,LATS1/2)。最后導致YAP和TAZ被磷酸化并滯留在細胞質中,從而抑制組織和細胞的生長和增殖。相反,Hippo/YAP信號通路一旦關閉,YAP和TAZ就被去磷酸化并轉移到細胞核中,與TEAD結合激活細胞增殖、生存和遷移的轉錄程序[8]。結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)作為YAP/TAZ/TEAD的關鍵靶基因,在肝癌組織中過表達[9]。近年來,Hippo/YAP信號通路已成為抑制肝細胞增殖、存活和肝癌形成的重要途徑之一[10]。

1 材料與方法

1.1 細胞株HuH-7細胞由中國科學院細胞庫提供。

1.2 試劑TGF-β1粉末(貨號:100-21)購自美國PeproTech公司。Sal B (純度≥ 98%,貨號:PS0054-0020)購自成都普思生物科技公司。MST1/2抑制劑XMU-MP-1(貨號:T4212)購自TargetMol Chemical 公司。p-TAZ(#59971)、TAZ(#72804)、MST1(#3682)、CTGF(#86641)、Smad2(#5339)、p-Smad2C(Ser465/467)(#18338)和PAI-1(#49536)等抗體購自美國CST公司。p-MST1(#AF2367)、YAP(#AF6328)、p-YAP(Ser127)(#AF3328)、c-Myc(#AF6054)和GAPDH(#AF7021)等抗體購自江蘇親和生物科技有限公司。p-Smad2L(Ser250/255)抗體由日本關西醫科大學Koichi Matsuzaki教授贈送。

1.3 儀器Axio Observer 3型倒置熒光顯微鏡(ZEISS);ImageXpress MicroConfocal高內涵細胞成像分析系統平臺(Moleculaf Devices);DYY-10電泳儀(北京六一儀器廠);BX-53型正置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)

1.4 細胞培養和藥物處理以含10%胎牛血清的DMEM培養HuH-7細胞,置于37 ℃、5%CO2的培養箱中。在細胞培養瓶中將HuH-7細胞培養至可傳代的密度時,使用胰酶消化,將細胞懸液接種在培養皿或孔板中。實驗分組如下:對照組、TGF-β1組、TGF-β1+Sal B組、5 μmol·L-1XMU-MP-1組、5 μmol·L-1XMU-MP-1+Sal B組、10 μmol·L-1XMU-MP-1組、10 μmol·L-1XMU-MP-1+Sal B組。根據實驗分組分別加入TGF-β1 (9 pmol·L-1)、Sal B (50 μmol·L-1)、5 μmol·L-1XMU-MP-1和10 μmol·L-1XMU-MP-1處理24 h。隨后,根據不同的檢測指標分別對細胞進行相應的處理。Sal B和XMU-MP-1儲備液的配置:將適量的Sal B和XMU-MP-1粉末溶解在DMSO溶液中,制成50 000 μmol·L-1Sal B和10 000 μmol·L-1XMU-MP-1溶液,分裝后放入-80 ℃冰箱中保存。TGF-β1溶液的配置:將10 μg TGF-β1粉末溶于100 μL檸檬酸鹽緩沖液,并用900 μL PBS緩沖液稀釋,制成10 mg·L-1TGF-β1溶液,分裝后放入-80 ℃冰箱中保存。

1.5 CCK-8法檢測細胞活力將HuH-7細胞以每孔100 μL細胞懸液接種在96孔板中,每孔細胞數約為5×103個,每組設立3個復孔。培養結束后,每孔分別加入10 μL CCK-8溶液,繼續置于37 ℃,5%CO2的培養箱中孵育3 h。用酶標儀在吸光度為450 nm處檢測HuH-7細胞的吸光度,并記錄各組的吸光度值。

1.6 EdU實驗檢測細胞增殖將HuH-7細胞以每孔500 μL細胞懸液接種在24孔板中,每孔細胞數約為2.5×105個。用BeyoClick cells EdU細胞增殖試劑盒檢測HuH-7細胞的增殖情況。將EdU溶液以適當比例用DMEM稀釋,加入棄掉一半培養液的24孔板中。孵育2 h后,用4%多聚甲醛固定細胞30 min,用含0.3% TritonX-100的PBS溶液通透細胞15 min,用click reaction solution避光孵育細胞30 min,用Hoechst33342對HuH-7細胞核進行染色,同樣在避光條件下孵育10 min。孵育結束后用PBS溶液徹底洗滌細胞,用高內涵細胞圖像分析系統采集圖像。用ImageJ軟件對EdU染色檢測結果進行分析。

1.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移將HuH-7細胞以每孔2 mL細胞懸液接種于6孔板中,每孔細胞數約為1.2×106個。用無菌槍頭在細胞貼壁部分劃出一塊空白區域,用PBS洗掉脫落的細胞,置于倒置顯微鏡下拍照記錄0 h的細胞劃痕寬度。培養24 h后,用PBS洗掉漂浮的細胞,置于倒置顯微鏡下拍照記錄24 h的細胞劃痕愈合情況。根據劃痕寬度計算劃痕愈合率,劃痕愈合率=(W0 h-W24 h)/W0 h×100%。W0 h、W24 h分別表示0、24 h的細胞劃痕寬度。

1.8 免疫熒光染色實驗檢測YAP和TAZ的表達將HuH-7細胞接種于置有細胞爬片的12孔板中,每孔接種1 mL細胞懸液,每孔細胞數約為5×104個。培養結束后,用4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min,用0.3% Triton X-100溶液通透細胞15 min,用quickblock 封閉液封閉細胞60 min,然后與一抗(YAP和TAZ抗體)在4 ℃下孵育過夜。第2天,加入二抗(Cy3標記),在室溫下避光孵育1 h,然后與DAPI溶液在室溫條件下避光孵育10 min。最后用PBS溶液充分洗凈,取出細胞爬片,將細胞生長面置于滴加抗熒光猝滅劑的載玻片上,并于熒光顯微鏡下采集圖像。采用Image J軟件對免疫熒光染色結果進行分析。

1.9 Western blot檢測Hippo通路相關因子的表達將HuH-7細胞以每孔2 mL細胞懸液接種于6孔板中,每孔細胞數約為2×106個。培養結束后,每孔加入100 μL裂解液(RIPA ∶蛋白酶抑制劑 ∶磷酸酶抑制劑 ∶EDTA=100 ∶1 ∶1 ∶1),置于冰上裂解30 min,離心取上清液。用BCA試劑盒測定蛋白樣品濃度后進行SDS-PAGE電泳,然后用印跡技術將整個細胞蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂乳液室溫下封閉PVDF膜1 h,一抗孵育PVDF膜,置于4 ℃冰箱中孵育過夜。使用以下一抗:YAP(1 ∶5 000),p-YAP(1 ∶5 000),TAZ(1 ∶1 000),p-TAZ(1 ∶1 000),p-MST1(1 ∶1 000),MST1(1 ∶1 000),CTGF(1 ∶1 000),GAPDH(1 ∶5 000)。將PVDF膜與二抗在室溫下孵育1 h(稀釋比例1 ∶5000)。用增強型化學發光ECL試劑覆蓋PVDF膜后用ChemiDocTMMP成像系統采集圖片。采用ImageJ軟件對免疫印跡結果進行分析。

2 結果

2.1 Sal B對HuH-7細胞增殖能力的影響CCK-8實驗結果表明,與對照組相比,TGF-β1和XMU-MP-1均能刺激HuH-7細胞的增殖。與5 μmol·L-1XMU-MP-1相比,10 μmol·L-1XMU-MP-1對HuH-7細胞的作用更為明顯。而Sal B的干預則可以逆轉TGF-β1和XMU-MP-1的促增殖作用(Fig 1B),差異具有統計學意義(P<0.05)。同時, EdU實驗結果也顯示,經TGF-β1和XMU-MP-1處理后,EdU熒光標記的增殖的細胞核數量明顯增加。但是,Sal B則抑制了這一趨勢(Fig 2),差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 Sal B對HuH-7細胞遷移能力的影響細胞劃痕實驗結果表明,與對照組相比,TGF-β1能夠明顯地刺激HuH-7細胞的遷移,Sal B則抑制了TGF-β1的促遷移作用,差異具有統計學意義(P<0.05)。但是XMU-MP-1對HuH-7細胞的遷移功能幾乎沒有影響,并且10 μmol·L-1XMU-MP-1對HuH-7細胞遷移功能的影響與5 μmol·L-1XMU-MP-1相比,這兩種濃度對HuH-7細胞遷移功能的影響差異不大(Fig 3)。

2.3 Sal B對YAP和TAZ熒光表達的影響免疫熒光染色結果顯示,與對照組相比,TGF-β1和XMU-MP-1顯著促進YAP和TAZ的熒光表達,差異具有統計學意義(P<0.05)。并且與5 μmol·L-1XMU-MP-1相比,10 μmol·L-1XMU-MP-1對YAP和TAZ熒光表達的促進作用更為明顯。但是,TGF-β1和XMU-MP-1對YAP和TAZ熒光表達的促進作用均被Sal B逆轉(Fig 4A-B)。

2.4 Sal B對Hippo/YAP信號通路相關蛋白的影響Western blot結果顯示,與對照組相比,TGF-β1顯著增加了YAP、TAZ和CTGF的蛋白表達水平,而降低了p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白表達。而Sal B則抑制了TGF-β1的誘導作用,增加了p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白表達,降低了YAP、TAZ和CTGF的蛋白表達(Fig 5-7)。

Fig 1 Effect of Sal B on viability of HuH-7 cells n=3)

如Fig 5所示,與對照組相比,XMU-MP-1處理明顯降低了p-MST1和MST1的蛋白表達,成功地驗證了XMU-MP-1的作用,差異具有統計學意義(P<0.05)。同時,與對照組相比,XMU-MP-1作用后,YAP、TAZ和CTGF的蛋白表達增加,而p-YAP和p-TAZ的蛋白表達降低。并且與5 μmol·L-1XMU-MP-1相比,10 μmol·L-1XMU-MP-1對上述蛋白的作用更為明顯(Fig 5-7)。

3 討論

以上實驗結果表明,Sal B能有效地抑制TGF-β1刺激的HuH-7細胞的增殖和遷移。此外,本研究還證實了Sal B對HuH-7細胞的抑制作用可能與Hippo/YAP信號通路有關。

Fig 2 Effect of Sal B on proliferation of

Fig 3 Effect of Sal B on migration of HuH-7 cells n=3)

HuH-7細胞系最早是在一名攜帶丙型肝炎病毒的日本男子身上發現的。從那時起,HuH-7細胞為丙型肝炎病毒的詳細分子研究提供了一條新的途徑[11]。已有研究證明[4],Sal B可以通過調節Hippo/YAP信號通路抑制肝癌HepG2細胞。但一種藥物可能對不同的細胞系有不同的影響。例如,抗病毒藥物奧司他韋可以促進HepG2細胞的凋亡,但不能促進HuH-7細胞的凋亡[12]。Takuma等[13]對幾種肝癌細胞系(包括HuH-7和HepG2細胞)進行體外細胞增殖實驗,發現了HuH-7細胞對雷戈拉非尼最敏感。此外,我們還發現,在鐵代謝、藥物篩選和肝毒性研究方面,HuH-7細胞可能比HepG2細胞具有更大的優勢[11,14]?？赡苁荓in等[15]對幾種肝癌細胞進行了肝毒性測試,發現HuH-7細胞與人類原代肝癌細胞具有最高的相似性。因此,本研究選擇了HuH-7細胞,為Sal B抗肝癌作用的研究提供更全面的證據。并且本研究也發現了Sal B對TGF-β1和MST1/2抑制劑刺激的HuH-7細胞的遷移能力的影響與HepG2細胞相比,確實存在一些差別。在先前的研究中[4],MST1/2抑制劑可以很明顯的促進HepG2細胞的遷移,并且受到不同濃度的MST1/2抑制劑的影響,Sal B則可以抑制MST1/2抑制劑的促增殖作用。但是經過我們多次的實驗論證,MST1/2抑制劑對HuH-7細胞遷移能力的影響很微弱,就算加大MST1/2抑制劑的濃度,也無法起到很明顯的作用。我們猜測HuH-7細胞遷移能力對MST1/2抑制劑的不敏感可能與HuH-7細胞的高分化特性有關。

Fig 4 Effect of Sal B on YAP and TAZ expressions in HuH-7 cells n=3)

Fig 5 Effect of Sal B on expressions of p-MST1 and MST1 proteins in HuH-7 cells n=3)

Fig 6 Effect of Sal B on expressions of p-YAP, YAP, p-TAZ, and TAZ proteins in HuH-7 cells n=3)

TGF-β1與肝纖維化、肝癌等肝病的發生發展密切相關。近年來,它在肝癌組織和癌旁基質中的上調表達引起了研究人員的興趣[16]。因此,本實驗選擇TGF-β1誘導HuH-7細胞建立體外肝癌模型。MST1/2是Hippo信號通路的上游分子。當細胞受到外界信號的刺激時,MST1/2被激活從而激活Hippo信號通路。LATS1/2受激活的MST1/2的影響而被磷酸化,從而促進YAP和TAZ的磷酸化和降解。相反,當MST1/2缺失或被抑制時,YAP和TAZ進入細胞核并與TEAD結合,激活增殖和抗凋亡基因,如CTGF基因,以加速肝癌的增殖和發展[17]。因此,本實驗采用5 μmol·L-1和10 μmol·L-1MST1/2抑制劑來探討在當MST1/2被抑制,Sal B對HuH-7細胞的抑制作用是否通過調節Hippo/YAP信號通路。

YAP/TAZ是Hippo信號通路的下游效應器,在動物發育過程中調節器官生長,促進受損器官的再生。然而,YAP/TAZ的過度激活可能導致小鼠癌癥的發生[18]。本研究發現,在HuH-7細胞中,TGF-β1和XMU-MP-1明顯降低了p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白表達水平,而增加了YAP、TAZ和CTGF的蛋白表達水平,其中10μmol·L-1XMU-MP-1的作用更為明顯。而Sal B可抑制TGF-β1和XMU-MP-1的刺激作用,降低YAP、TAZ和CTGF的蛋白水平,增加p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白水平。免疫熒光染色同樣顯示,Sal B可抑制YAP和TAZ的表達。這些結果都表明,Hippo信號通路的上游分子MST1被XMU-MP-1抑制,失活的MST1促進YAP和TAZ去磷酸化后入核,進而介導靶基因CTGF的表達,促進肝癌的發生。而Sal B可減弱XMU-MP-1的作用,提示Sal B可能通過增強MST1/2的活性,激活YAP/TAZ的磷酸化,從而減少YAP/TAZ入核。

Fig 7 Effect of Sal B on expressions of CTGF protein in HuH-7 cells n=3)

Fig 8 Diagram of regulatory mechanism of Sal B and XMU-MP-1 in Hippo/YAP pathway in HuH-7 cells

在以上討論的基礎上,我們進一步提出了Sal B除了上調MST1/2的活性外,是否還有其他途徑來減輕MST1/2抑制劑的影響,如抑制MST1/2的蛋白酶體活性或減少MST1/2的泛素化降解。這些問題需要我們在不久的將來進一步探索。

綜上所述,本研究證實了Sal B能夠抑制TGF-β1誘導的HuH-7細胞的增殖和遷移。我們推測Sal B的抗肝癌作用可能與激活Hippo/YAP信號通路有關。然而,關于Sal B激活Hippo/YAP信號通路具體的分子機制還沒有明確的證據,需要進一步研究。本研究為Sal B的抗肝癌作用提供了一些數據,為其抗肝癌機制提供了新的見解。