基于PI3K/AKT/GSK-3β信號通路探討EA改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠認知功能障礙的內(nèi)在機制

仲麗麗,路 鑫,于 穎,趙秦妍,張 靜,劉彤慧,倪雪妍,車艷玲,吳 丹,劉 宏

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學 附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院,黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年時期的一種比較常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,其臨床表現(xiàn)以記憶障礙和行為改變等為主。同時,AD也是老年期最常見的慢性疾病之一,其患病率與年齡有密切關(guān)系,年齡平均每增加6.1歲,患病率則升高1倍。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計全球65歲以上老年人群中AD的患病率是4%～7%,在85歲以上的老年人群中,AD的患病率可高達20%～30%[1]。《2021年世界阿爾茨海默病報告》中指出,預計2030年全球?qū)⒂?800萬人患有失智癥,據(jù)2021年大規(guī)模的調(diào)查 AD已成為我國第五大死亡原因[2]。AD 發(fā)病率高、危害大,發(fā)病機制尚不明確,迄今尚無特效的治療藥物,因此亟需研發(fā)治療AD 的新型藥物。

鞣花酸(ellagic acid,EA)是一種存在于多種水果和堅果(如草莓、石榴、核桃)中的天然酚內(nèi)酯化合物,具有酚類化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),分子結(jié)構(gòu)式中含有4個酚羥基,具有較強的提供氫原子或與孤對電子配對的能力,這使鞣花酸擁有較強的清除自由基和抗氧化的能力[3-4]。此外,它還具有多種生物活性,如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抑制細胞凋亡等。近年越來越多的文獻報道,EA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。然而,EA對AD發(fā)生、進展的影響和機制國內(nèi)外相關(guān)文獻報道較少。本實驗組前期研究證實:給予APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠灌胃EA后,有效抑制氧化應激誘導的海馬組織中Aβ堆積和tau蛋白磷酸化,保護神經(jīng)元損傷。改善小鼠學習記憶能力[5]。

1 材料

1.1 動物6月齡SPF級APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠32只,另外選取8只同月齡SPF級C57BL/6J野生型小鼠(Wild type)作為對照,體重為(22±2) g,由北京華阜康生物科技有限公司提供,動物生產(chǎn)許可證為SCXK(京)2020-0004。小鼠飲水自由,進食標準飼料由北京華阜康生物科技有限公司提供,實驗過程中動物飼養(yǎng)、處死、取材等過程均遵守實驗動物倫理學操作規(guī)范,均在SPF級條件下進行。

1.2 藥物二甲基亞砜(DMSO)(批號:EZ2921C395,BioFROXX);EA(貨號:E102710,上海阿拉丁生化科技有限公司) ;LY294002(批號:MB6045,大連美侖生物科技有限公司);PI3K Antibody(批號:abs119725)、AKT Antibody、GSK-3β Antibody(批號:abs119623)(Absin Bioscience );SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒50T(批號:20190904,Solarbio);羊抗小鼠(或羊抗兔)lgG-HRP(批號:SE131,Solarbio);ECL化學發(fā)光底物試劑盒(特超敏)(貨號:DCM09090100,biosharp)。

1.3 主要試劑(1)10%DMSO溶液配制:取適量DMSO原液用生理鹽水進行10倍(DMSO ∶生理鹽水=1 ∶9)稀釋,4 ℃保存冰箱存放備用。(2)EA配制:EA購買時為粉末狀,取100 mg EA放置50 mL的燒杯中,加入2 mL 10%的DMSO和18 mL的生理鹽水溶液中充分攪拌至EA完全溶解,配置成5 g·L-1的EA溶液,4 ℃冰箱存放備用。(3)LY294002配制:取5 mg的LY294002粉末,加入0.5 mL的DMSO和4.5 mL的生理鹽水的混合液,攪拌溶解后配置成LY294002母液,取1.5 mL的母液加入生理鹽水配置成0.15 g·L-1的溶液備用,4 ℃冰箱存放備用。

1.4 儀器Morris水迷宮系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),透射電子顯微鏡HT-7700[日立(中國)有限公司],DYY-6D型電泳儀電源/24DN制膠器(北京六一生物科技有限公司),TY-80B脫色搖床(金壇市榮華儀器制造有限公司),PFS-300塑料薄膜封口機(山東濟寧銀都包裝機械有限公司),WB顯影儀(美國Thermo Scientific公司)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

2.1.1實驗動物分組 將32只SPF級6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為4組,即:APP/PS1組、APP/PS1+EA組、APP/PS1+LY294002組、APP/PS1+EA+LY294002組,每組8只,另外將選取的8只SPF級C57BL/6J野生型小鼠(Wild type)作為空白對照組,即WT組。

2.1.2實驗動物給藥 APP/PS1+EA組予以50 mg·kg-1·d-1灌胃EA;APP/PS1+LY294002組予以1.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射LY294002;APP/PS1+EA+LY294002組予以50 mg·kg-1·d-1灌胃EA,同時按1.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射LY294002;WT組和APP/PS1組于相同時間點灌胃等體積10%DMSO。每日給藥1次,連續(xù)給藥60 d。

財政部副部長程麗華代表財政部向黑龍江北大荒農(nóng)墾集團總公司成立表示祝賀。她表示，經(jīng)國務(wù)院同意，授權(quán)財政部代表國務(wù)院對黑龍江北大荒農(nóng)墾集團總公司履行出資人職責，標志著黑龍江墾區(qū)體制機制的重大轉(zhuǎn)變，翻開了黑龍江農(nóng)墾發(fā)展嶄新的一頁。希望北大荒農(nóng)墾集團總公司勇?lián)厝?，繼續(xù)為實施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略作出應有的貢獻；再接再厲，繼續(xù)將農(nóng)墾改革不斷引向深入；不辱使命，全力打造具有全球競爭力的世界一流企業(yè)；采取有力措施，切實加強國有資產(chǎn)監(jiān)管。財政部將認真落實黨中央、國務(wù)院決策部署，與黑龍江省委省政府和國家有關(guān)部委一道，進一步推動黑龍江農(nóng)墾的改革發(fā)展。

2.2 Morris水迷宮灌胃給藥 60 d 后進行Morris水迷宮實驗,5組實驗動物需要進行4 d定位巡航實驗和1 d空間探索實驗,以評價各組干預方式對實驗動物學習和記憶能力的影響。

2.2.1定位巡航實驗 實驗開始之前在水池中加水,水溫控制在(22±2) ℃范圍內(nèi),放入50 g奶粉精,用攪拌棒攪拌至水呈不透明乳白色。液面劃分為 4 個象限,逃逸平臺放于第二象限的固定位置,且隱藏在液平面 1.5 cm以下。選擇距離水池圓心等距離的點作為入水點投放小鼠,隨后將小鼠面向池壁依次從Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限放入,記錄小鼠在60 s內(nèi)是否能夠找到水池中隱藏的平臺,若小鼠能夠在60 s內(nèi)找到平臺并在平臺停留5 s即視為成功,系統(tǒng)采集自動停止。若小鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺,將其引到平臺上停留10 s。第二天小鼠投放順序:Ⅱ、Ⅳ、Ⅰ,接下來每天放入順序依次類推。實驗結(jié)束后將小鼠放置籠具中,擦干。每天在3個入水點依次放入,連續(xù)4天。記錄小鼠第一次找到平臺所用的時間,即為逃避潛伏期。小鼠的游泳過程受到視頻跟蹤系統(tǒng)檢測和分析。

2.2.2空間探索實驗 定位巡航實驗結(jié)束24后,撤掉第三象限內(nèi)的平臺,將小鼠面向池壁依次從Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限放入,記錄小鼠60 s內(nèi)在原平臺所在象限內(nèi)的停留時間和穿越平臺次數(shù),觀察小鼠的空間學習和記憶的能力。

2.3 免疫組化檢測取出固定在4%多聚甲醛溶液中的小鼠海馬組織,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。在切片機上切成5 μm的薄片,將制備好的石蠟切片烤片 65 ℃,12 h。常規(guī)脫蠟、水化,檸檬酸鈉抗原修復,過氧化氫孵育,參照免疫組化通用二步法檢測試劑盒說明書進行相關(guān)操作,1 ∶100稀釋一抗 PI3K、AKT、GSK-3β,然后按照DAB試劑盒配制DAB染色劑進行顯色,蘇木精復染,鹽酸酒精分化,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片。用 Image J軟件進行蛋白定量分析。

2.4 透射電鏡將小鼠海馬部分的腦組織切成1 mm3的小塊,放在2.5%戊二醛中固定2 h。經(jīng)1%餓酸固定2 h后,依次梯度乙醇溶液洗脫、包埋、切成50 nm的薄片,3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,然后在透射電鏡下觀察并拍照。

2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)將凍存的海馬組織取出研磨勻漿,抽取上清液進行BCA蛋白濃度測定。根據(jù)BCA蛋白測定說明書,調(diào)整蛋白濃度為0.5 g·L-1。制備 5% 濃縮膠+10% 分離膠,將樣品與標準品蛋白按 10 μL/孔進行上樣,電泳、封閉 、孵 育 對 應 一 抗(PI3K,1 ∶2 000;AKT,1 ∶2000;GSK-3β,1 ∶2 000),4 ℃過夜。次日待復溫 30 min 后 TBST 洗膜,二抗(1 ∶20 000)室溫搖床孵育1 h,經(jīng)TBST洗膜后放入凝膠成像系統(tǒng)中進行曝光。使用 Image J 軟件分析目標條帶和內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目標蛋白相對表達水平。

3 結(jié)果

3.1 EA對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶能力的影響第1～4天,與WT組相比較,其他4組的逃避潛伏期均較長(P<0.05),穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.01);與APP/PS1組比較,APP/PS1+EA組、APP/PS1+EA+LY294002組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01),而APP/PS1+LY294002組小鼠的逃避潛伏期在第4天實驗中較APP/PS1組明顯延長(P<0.01);APP/PS1+EA組小鼠穿越平臺次數(shù)增多(P<0.05),APP/PS1+LY294002組和APP/PS1+EA+LY294002組的小鼠在原平臺所在象限內(nèi)穿越平臺次數(shù)無顯著差異(P>0.05)。與APP/PS1+LY294002組比較,APP/PS1+EA+LY294002組小鼠的逃避潛伏期縮短(P<0.05),穿越平臺次數(shù)無明顯差異(P>0.05)。

3.2 EA對各組小鼠海馬組織中PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達的影響為了探索EA對信號通路相關(guān)蛋白表達的影響,運用免疫組化方法,對各組小鼠海馬組織切片中的PI3K、AKT、GSK-3β表達量水平進行檢測,計算細胞平均光密度(integrated optical density,IOD)。與WT組比較,APP/PS1組、APP/PS1+LY294002組和APP/PS1+EA+LY294002組中的PI3K、AKT蛋白表達量顯著降低(P<0.01),GSK-3β表達量顯著升高(P<0.01);APP/PS1+EA組的PI3K表達量降低(P<0.05),AKT表達量顯著降低(P<0.01),GSK-3β表達量升高(P<0.05)。與APP/PS1組比較,APP/PS1+EA組的PI3K、AKT表達量顯著升高(P<0.01),GSK-3β表達量顯著降低(P<0.01);APP/PS1+LY294002組PI3K、AKT的表達量降低(P<0.05),GSK-3β蛋白表達量升高(P<0.05);而 APP/PS1+EA+LY294002組PI3K、AKT表達量升高(P<0.05),GSK-3β表達量顯著降低(P<0.01)。與APP/PS1+LY294002組比較,APP/PS1+EA+LY294002組PI3K、AKT表達量升高(P<0.05),GSK-3β表達量降低(P<0.05)。見Fig 1～4。

Tab 1 Effect of EA on learning ability of

3.3 EA對各組小鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化的影響WT組海馬神經(jīng)元細胞數(shù)目較多,線粒體結(jié)構(gòu)清晰,膜完整,線粒體嵴致密,無腫脹,細胞核居中,核仁明顯,微管、微絲排列整齊;APP/PS1組海馬神經(jīng)元細胞數(shù)目較少,線粒體結(jié)構(gòu)破壞,大部分線粒體出現(xiàn)腫脹,線粒體的內(nèi)膜和外膜不完整,部分線粒體嵴消失,微管、微絲纏結(jié),排列紊亂;APP/PS1+EA組神經(jīng)元細胞數(shù)較APP/PS1組增多,線粒體結(jié)構(gòu)較清晰,可見清楚的線粒體嵴,線粒體輕度水腫。微管、微絲排列較整齊有序;APP/PS1+LY294002組與APP/PS1組相似,神經(jīng)元細胞數(shù)量較少,線粒體嚴重破壞,腫脹明顯,線粒體嵴融合或消失,微管、微絲排列紊亂;APP/PS1+EA+LY294002組神經(jīng)元數(shù)目增多不明顯,線粒體結(jié)構(gòu)不完整,內(nèi)膜和外模破壞,仍有部分線粒體出現(xiàn)腫脹。見Fig 5。

Fig 1 Expression of PI3K,AKT,GSK-3βprotein in hippocampus of eachgroup of mice (100×)

Fig 2 Expression of PI3Kprotein in hippocampus of each group of mice(100×)

Fig 3 Expression of AKT protein in hippocampus of each group of mice (100×)

Fig 4 Expression of GSK-3βprotein in hippocampus of each group of mice (100×)

3.4 EA對PI3K/AKT/GSK-3β信號通路中PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達的影響與WT組比較,APP/PS1組、APP/PS1+LY294002組和APP/PS1+EA+LY294002組中的PI3K蛋白表達量顯著降低(P<0.01),AKT蛋白表達量降低(P<0.05),GSK-3β表達量顯著顯著升高(P<0.01);APP/PS1+EA組的PI3K、AKT表達量降低(P<0.05),GSK-3β表達量升高(P<0.05)。與APP/PS1組比較,APP/PS1+EA組PI3K表達量顯著降低(P<0.01),AKT表達量顯著升高(P<0.01),GSK-3β表達量顯著降低(P<0.01);APP/PS1+LY294002組PI3K、AKT表達量降低(P<0.05),GSK-3β表達量升高(P<0.05);APP/PS1+EA+LY294002組PI3K、AKT表達量升高(P<0.05),GSK-3β表達量降低(P<0.05)。與APP/PS1+LY294002組比較,APP/PS1+EA+LY294002組PI3K、AKT表達量升高(P<0.05),GSK-3β表達量降低(P<0.05),見Fig 6。

4 討論

AD是一種起病隱匿、進展緩慢的神經(jīng)退行性疾病。臨床表現(xiàn)為進行性認知障礙,足以影響日常生活,對個人和社會具有很嚴重的影響[11]。中國是世界上患AD人數(shù)最多的國家[12],而AD的病因與發(fā)病機制比較復雜,因此,尋找安全有效的藥物預防和治療AD是一項刻不容緩的責任。EA作為一種膳食多酚,既可以獨立存在,也可以作為復雜結(jié)構(gòu)的一部分存在,如鞣花單寧類,吸收后釋放EA和其他代謝物[13]。Han等[14]研究發(fā)現(xiàn),鞣花酸有很高的清除自由基和抑制膜脂過氧化能力,在人體骨肉瘤細胞內(nèi)誘導細胞凋亡,顯著減少細胞增殖。

研究表明,PI3K/AKT/GSK-3β信號通路在嚙齒動物的行為表現(xiàn)及學習和記憶功能中起著關(guān)鍵作用[15]。該通路與細胞的生存、代謝及凋亡密切相關(guān),此信號通路轉(zhuǎn)導紊亂會誘發(fā)如癡呆、腫瘤、糖尿病等多種疾病[16]。研究顯示 Aβ引起的神經(jīng)毒性作用與 PI3K/AKT/GSK-3β信號通路息息相關(guān)[17- 18]。PI3K作為第二信使將細胞外的信號傳遞給下游的蛋白激酶 AKT,之后被活化的 AKT,則能夠發(fā)揮進一步磷酸化的作用,激活或抑制其下游靶蛋白B淋巴細胞瘤-2基因相關(guān)啟動子(BAD)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase 9)、核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(NF-kB)、糖原合成酶激酶-3(GSK3)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FKHR)、周期蛋白依賴激酶抑制因子1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,p21,Cip1)等,進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡和遷移。AD 患者的大腦皮層、紋狀體、海馬,都能夠表達GSK-3β。被活化的 AKT 可使磷酸化的GSK-3βN-末端的絲氨酸(GSK3β第 9 位點上絲氨酸或 GSK3α第 21 位點上絲氨酸) 失活,起著阻滯其對下游蛋白的磷酸化而抗凋亡的作用。AKT 是一種及其重要的抗調(diào)亡調(diào)節(jié)因子,在介導多種生物學效應的情況下發(fā)揮重要的作用,激活的 AKT 通過磷酸化 GSK-3β,從而抑制 GSK-3β的活性。同時,有研究表明,GSK-3β的活化可引起 tau 蛋白磷酸化水平的異常增高,tau 蛋白的異常磷酸化通過神經(jīng)毒性作用介導神經(jīng)退行性疾病 AD 的發(fā)生,在 AD 發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用[19-21]。GSK-3β是調(diào)控重組與合成蛋白(Nrf2)的活性的蛋白激酶。GSK-3β能促進Nrf2返回胞漿,從而降低Nrf2參與介導抗氧化活性,從而加重機體內(nèi)氧化應激損傷。近年來,GSK-3β被認為溶酶體的負向調(diào)節(jié)劑,導致細胞內(nèi)神經(jīng)毒素Aβ蛋白的清除率降低。因此,GSK-3β活性的高低是治療神經(jīng)變性和行為功能障礙疾病的“新靶點”。當機體在不斷受到外界刺激時,會加重GSK-3β對Nrf2的負性調(diào)節(jié)作用,無法與抗氧化反應元件(ARE)的啟動子結(jié)合,激活抗氧化反應的發(fā)生[22-23]。信號通路機制模式圖見Fig 7。Qi等[24]發(fā)現(xiàn)在 Aβ誘導的 AD 小鼠中牛蒡苷元通過 PI3K/AKT/GSK-3β信號通路降低 tau 蛋白的高度磷酸化,從而降低其對學習和記憶能力的傷害。Kong等[25]發(fā)現(xiàn),尼可地爾通過激活 AKT 來增加 AKT的磷酸化水平并上調(diào)結(jié)合原件蛋白活性,應用 PI3K 抑制劑 LY294002 阻止這種保護作用。

Fig 5 Ultrastructural changes in hippocampus of each group of mice(18 000×)

Fig 6 PI3K,AKTand GSK-3β protein detectionin hippocampus of each groupof mice

Fig 7 Mode diagram of signaling pathway mechanism

本研究利用Morris水迷宮實驗探討EA是否對AD小鼠的認知功能障礙有所改善。Morris水迷宮實驗是許多疾病模型中有關(guān)記憶能力的標準測試。動物是否能準確執(zhí)行任務(wù)依賴于特定的回路和大腦結(jié)構(gòu),是否能準確回憶位置和導航環(huán)境的能力同樣依賴于多種認知機制[26]。實驗結(jié)果顯示,WT組小鼠的逃避潛伏期隨訓練天數(shù)增長不斷縮短,說明小鼠經(jīng)過適應性訓練后,開始熟悉周圍環(huán)境,這符合正常小鼠對實驗的要求。APP/PS1+EA組的逃避潛伏期時間較APP/PS1組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01);APP/PS1+EA+LY294002組的逃避潛伏期較APP/PS1+LY294002組的逃避潛伏期縮短(P<0.05)。在空間探索試驗中,APP/PS1+EA組較APP/PS1組小鼠穿越平臺次數(shù)增多(P<0.05);APP/PS1+LY294002組和APP/PS1+EA+LY294002組的小鼠穿越平臺次數(shù)無明顯差異(P>0.05);與APP/PS1+LY294002組比較,APP/PS1+EA+LY294002組的小鼠穿越平臺次數(shù)無明顯差異(P>0.05)。說明EA可以縮短APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的逃避潛伏期,延長在目標象限的停留時間,增加穿越平臺次數(shù),改善小鼠的學習和記憶能力。而PI3K抑制劑LY294002對EA對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的改善作用產(chǎn)生對抗作用,并且這種對抗作用要遠小于EA的改善作用。

WT組海馬神經(jīng)元細胞數(shù)目較多,線粒體結(jié)構(gòu)清晰,膜完整,無腫脹,微絲、微管排列整齊;APP/PS1組海馬神經(jīng)元細胞數(shù)目較少,線粒體結(jié)構(gòu)破壞,大部分線粒體出現(xiàn)腫脹,微管、微絲纏結(jié),排列紊亂;其余3組海馬神經(jīng)元均有不同程度的損傷,APP/PS1+EA組損傷較APP/PS1組明顯減輕。APP/PS1+LY294002組表現(xiàn)與APP/PS1組表現(xiàn)相似。說明EA對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠改善作用進行驗證,證實了EA可以減輕APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)元損傷,提高小鼠的學習和記憶能力。

通過免疫組化和WB檢測PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達情況,實驗結(jié)果表明APP/PS1+EA組較APP/PS1組的PI3K、AKT表達水平升高(P<0.05),GSK-3β的表達水平較APP/PS1組降低(P<0.05);APP/PS1+LY294002組PI3K、AKT表達量較APP/PS1組降低(P<0.05),但是GSK-3β的表達量較APP/PS1組的表達量升高(P<0.05);APP/PS1+EA+LY294002組PI3K、AKT表達水平較APP/PS1+LY294002組升高(P<0.05),GSK-3β的表達水平降低(P<0.05)。說明EA可以上調(diào)PI3K/AKT/GSK-3β信號通路中的關(guān)鍵蛋白PI3K、AKT的表達,下調(diào)GSK-3β的蛋白表達。PI3K抑制劑LY294002對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的GSK-3β活性有負性的調(diào)節(jié)作用,其可能是通過激活PI3K/AKT/GSK-3β信號通路,活化后的AKT對GSK-3β進行磷酸化,磷酸化的GSK-3β抑制GSK-3β的活性,從而減輕AD的病例改變。實驗結(jié)果表明PI3K抑制劑LY294002對抗EA對AD的改善作用,但EA對AD的改善作用要遠大于抑制劑LY294002的對抗作用。該實驗結(jié)果與王耕銀[27]研究PI3K/AKT/GSK-3β通路在萊菔硫烷(Sulforaphane,SFN)調(diào)控糖尿病大鼠認知功能減退中的作用中應用PI3K抑制劑LY294002抵消了SFN的神經(jīng)保護作用一致。

綜上所述,本次研究采用EA觀察應用PI3K/AKT/GSK-3β信號通路抑制劑LY294002對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進行干預性研究,60天后通過Morris水迷宮APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學習和記憶能力得到改善,提示EA具有改善神經(jīng)元損傷的作用。透射電鏡結(jié)果檢測小鼠海馬神經(jīng)元損傷,發(fā)現(xiàn)EA干預后的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元數(shù)目增加。免疫組化、WB結(jié)果顯示信號通路相關(guān)蛋白表達水平發(fā)生變化,提示EA改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元損傷是通過激活PI3K/AKT/GSK-3β信號通路,上調(diào)信號通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT的表達,下調(diào)GSK-3β蛋白的表達,GSK-3β活性降低后,會減輕GSK-3β對Nrf2的負性調(diào)節(jié)作用,Nrf2與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白 1(Kelch-1ike ECH-associated protein l,Keap1)解離,離開細胞質(zhì)后與ARE的啟動子結(jié)合,激活抗氧化反應的發(fā)生來實現(xiàn)的。