基于TLR4/NF-κB信號通路探究紅花黃色素對不同月齡APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

張夢玉,鄭艷杰,葉紅霞,王春輝,胡艷麗

(石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室,新疆 石河子 832000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,其關(guān)鍵的病理變化包括β-淀粉樣蛋白的沉積(β-amyloid precursor protein, Aβ)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofifibrillary tangles, NFTs)[1]。此外,神經(jīng)炎癥也是AD的早期病理表現(xiàn),炎癥反應(yīng)會加重疾病進(jìn)展,而抑制炎癥反應(yīng)可能降低AD的風(fēng)險[2]。

小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia, MG)是參與調(diào)節(jié)慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要膠質(zhì)細(xì)胞之一?；罨腗G在一定程度上具有保護(hù)作用,可降低AD的發(fā)病率。活化的M1型MG可誘導(dǎo)促炎因子和趨化因子的表達(dá),引起炎癥反應(yīng)[3]。M2型MG有助于吞噬細(xì)胞碎片,促進(jìn)組織修復(fù),并通過釋放抑炎因子發(fā)揮抗炎作用[4]。因此,促使MG由M1型向M2型轉(zhuǎn)變被認(rèn)為是神經(jīng)炎性疾病的潛在治療方法。TLR4主要在MG中表達(dá),是與M1型MG激活相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,能夠誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和釋放。研究表明抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活可減輕神經(jīng)炎癥,改善癡呆小鼠的認(rèn)知損傷[5]。

紅花黃色素(safflower yellow, SY)是中藥紅花水溶性提取物的主要活性成分。研究證明,SY通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激來保護(hù)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)[6]。研究發(fā)現(xiàn),SY可以改善多種AD模型動物的學(xué)習(xí)和記憶能力[7-8]。然而,SY對不同疾病時期APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響,以及是否通過TLR4/NF-κB通路調(diào)節(jié)MG表型的轉(zhuǎn)化發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用有待研究。

本研究評估了SY對不同月齡APP/PS1小鼠認(rèn)知障礙的影響及對MG M1M2極化和TLR4/NF-κB信號通路的表達(dá),闡明了SY治療AD的最佳治療期及其作用機(jī)制,為SY治療AD不同疾病階段提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑紅花黃色素(云南通海楊氏天然產(chǎn)物公司,(E=100色價,主要成分紅花黃A和紅花黃B,總色素含量 >90%,批號:YSCMY2020 0710);Arginase-1兔多克隆抗體(Santa);iNOS兔多克隆抗體(CST);小鼠β-actin單克隆抗體(中杉金橋);TREM2兔多克隆抗體(Bioss);TLR4鼠單克隆抗體(Santa);p-NF-κB p65兔多克隆抗體(Affinity);NF-κB p65兔多克隆抗體(Affinity);蛋白酶抑制劑(默克公司);BCA試劑盒(上海碧云天);PVDF膜(Amersham);ECL發(fā)光試劑盒(Affinity);IL-6試劑盒(Mlbio);TGF-β1試劑盒(Mlbio)。

精密稱取15 mg SY溶于5 mL無菌氯化鈉注射液中,配制成藥物濃度為3 g·L-1的SY溶液。

1.2 儀器DMS-2型Morris 水迷宮,DTT-2型小鼠跳臺儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院);低溫高速離心機(jī)(Eppendorf);組織勻漿機(jī)(德國IKA公司);酶標(biāo)儀Thermo 3001(德國ZEISS公司);DYCZ-40D電泳儀,DYY-7C型電泳儀電源(北京六一);UVP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng);萬分之一電子天平(日本A&G有限公司);ZD-9556A 水平脫色搖床(江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1實驗動物 3、6、9月齡APP/PS1(APPswe, PSEN1dE9)轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg)共68只及3、6、9月齡C57BL/6J小鼠(WT)共34只,體質(zhì)量(22～29)g,購自南京君科生物工程有限公司,合格證號:2018000601886。實驗動物飼養(yǎng)于溫度為(23 ± 2)°C并且空氣流通的房間內(nèi)。實驗期間小鼠自由飲水和攝食,嚴(yán)格遵循實驗動物管理相關(guān)規(guī)定。

1.3.2實驗動物分組及給藥 3、6、9月齡APP/PS1小鼠與同月齡的C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組:WT組(n=12,n=12,n=10),Tg組(n=12,n=12,n=10),Tg+SY 30 mg·kg-1組(n=12,n=12,n=10)。SY 30 mg·kg-1組灌胃給予SY 30 mg·kg-1,WT組和Tg組給予生理鹽水,每日1次,連續(xù)給藥3個月至行為學(xué)實驗結(jié)束。

1.3.3Morris水迷宮實驗 平臺置于水面下約1 cm,置于第一象限中心,水溫保持在(22±2)℃。實驗過程中保持水池邊緣的標(biāo)識物不變和環(huán)境安靜,減少噪音對實驗的干擾。定位航向?qū)嶒炛?小鼠每日訓(xùn)練兩次。小鼠從相鄰象限和相對象限的入水點面向池壁入水,記錄小鼠找到平臺的時間為逃避潛伏期。若小鼠未在120 s內(nèi)找到平臺,則需引導(dǎo)小鼠游上平臺,使小鼠產(chǎn)生記憶,并記錄逃避潛伏期為120 s。在空間探索實驗中,撤去平臺使小鼠從第三象限入水,記錄小鼠首次穿越平臺時間及穿越平臺次數(shù)。

1.3.4跳臺實驗 實驗在底部鋪有銅柵的設(shè)備中進(jìn)行。在學(xué)習(xí)階段,小鼠適應(yīng)環(huán)境3 min后打開電源,銅柵通電。將小鼠放置于絕緣平臺上,當(dāng)小鼠跳下平臺會受到電擊,正常情況下小鼠會立即跳上平臺,若小鼠不上平臺則需手動將小鼠放上平臺,產(chǎn)生記憶。訓(xùn)練試驗結(jié)束24 h后,進(jìn)行回憶實驗。記錄每只小鼠首次跳下平臺的時間和3 min內(nèi)跳下平臺的總次數(shù)。

1.3.5ELISA實驗 每組小鼠隨機(jī)選取4只進(jìn)行檢測,稱取一定重量的大腦皮層組織,加入9倍體積的PBS后勻漿。組織勻漿離心后收集上清液。根據(jù)試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑,在450 nm波長測定每孔A值,用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)曲線方程計算待測樣品濃度。

1.3.6Western blot實驗 提取各組小鼠皮層與海馬組織總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度,將蛋白質(zhì)熱變性并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,在室溫下封閉1 h。PVDF膜與以下抗體在4 °C孵育過夜:Arginase-1兔多克隆抗體(1 ∶1 000); iNOS兔多克隆抗體(1 ∶1 000);小鼠β-actin單克隆抗體(1 ∶1 000);TREM2兔多克隆抗體(1 ∶1 000);TLR4鼠單克隆抗體(1 ∶1 000); p-NF-κB p65兔多克隆抗體(1 ∶1 000);NF-κB p65兔多克隆抗體(1 ∶1 000)。次日,PVDF膜與相應(yīng)二抗室溫孵育1 h,將ECL發(fā)光液均勻覆蓋于PVDF膜上,并使用UVP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行可視化,用ImageJ對條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 SY改善不同月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能障礙通過Morris水迷宮實驗以明確SY對3、6、9月齡APP/PS1小鼠的長期學(xué)習(xí)記憶能力的影響。定位航行實驗表明,與3、6、9月齡WT組小鼠相比,同月齡Tg組小鼠逃避潛伏期均明顯延長(P<0.01)。3月齡SY組小鼠逃避潛伏期有略微下降的趨勢,但差異并無顯著性,6月齡與9月齡SY組小鼠的逃避潛伏期則明顯縮短(P<0.01,P<0.05),如Fig 1A-C。

在空間探索實驗中,與同月齡WT組小鼠相比,3、6、9月齡Tg組小鼠首次穿過平臺的時間分別延長了95.7%(P<0.05)、203%(P<0.01)和200%(P<0.01),表明各月齡APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力受損。而3、6、9月齡SY組小鼠首次穿過平臺的時間分別減少了33.6%、45.0%(P<0.01)和33.3%。與同月齡WT組小鼠相比,3、6、9月齡Tg組小鼠的穿越平臺次數(shù)分別減少了50.4%和400%(且與3月齡Tg組相比差異有顯著性,P<0.05)和74.5%。經(jīng)過SY治療后各月齡SY組小鼠穿越平臺均增加,3月齡小鼠增加了19.4%,6月齡小鼠增加了650%(明顯高于3月齡SY組小鼠,P<0.01),9月齡小鼠增加了166.7%(Fig 1D,F)。結(jié)果表明,SY可以改善不同月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能障礙,其中對6月齡APP/PS1小鼠的認(rèn)知障礙改善最好。

2.2 SY提高不同月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的短期學(xué)習(xí)記憶能力跳臺實驗明確SY對3、6、9月齡APP/PS1小鼠的短期學(xué)習(xí)記憶能力的影響。如Fig 2所示,與同月齡WT組小鼠相比,各月齡Tg組小鼠逃避潛伏期分別減少了6.9%,51.7%(P<0.05)和40.1%,錯誤次數(shù)分別增加了73.1%,300%(P<0.01)和260%(P<0.05)。與同月齡Tg組小鼠相比,3月齡SY組小鼠逃避潛伏期僅增加0.043%,錯誤次數(shù)增加54.7%,但差異無顯著性,6、9月齡SY組小鼠逃避潛伏期分別增加105.9%和68.9%(均明顯高于3月齡SY組小鼠,P<0.01,P<0.05);錯誤次數(shù)分別減少了75.8%(P<0.01)和71.4%(P<0.05)。結(jié)果表明,SY可以提高不同月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的短期學(xué)習(xí)記憶能力,其中對6月齡APP/PS1小鼠的改善作用最好。

2.3 SY調(diào)節(jié)了不同月齡小鼠大腦皮層中IL-6和TGF-β1表達(dá)水平與同月齡WT組小鼠相比,3月齡Tg組小鼠皮層中IL-6的含量呈現(xiàn)升高趨勢,6、9月齡Tg組小鼠IL-6的含量明顯升高(P<0.05),經(jīng)給藥治療后6、9月齡SY組小鼠皮層中IL-6的含量明顯降低(P<0.05)。與各月齡WT組小鼠相比,3月齡Tg組小鼠TGF-β1的含量僅有下降的趨勢,6、9月齡Tg組小鼠TGF-β1的含量明顯下降(P<0.05),經(jīng)SY治療后,3、9月齡SY組小鼠皮層中TGF-β1的含量有上升的趨勢,6月齡SY組小鼠TGF-β1的含量明顯上升(P<0.05)(Tab 1)。

Tab 1 Content of IL-6 and TGF-β1 in cortical tissue of mice at different months of

Fig 1 Effects of safflower yellow on learning and memory ability of 3,6,9-month-old APP/PS1 transgenic mice in Morris water maze

Fig 2 Escape latency and error frequency of mice at different months of age in step-down

2.4 SY誘導(dǎo)了不同月齡小鼠腦組織中TREM2蛋白表達(dá)如Fig 3所示,與3、9月齡WT組小鼠比較,同月齡 Tg組小鼠皮層組織中TREM2的表達(dá)水平呈現(xiàn)下降的趨勢,在6月齡Tg組小鼠皮層組織中TREM2的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。3、9月齡SY組小鼠TREM2的蛋白表達(dá)水平有升高的趨勢,6月齡SY組小鼠TREM2表達(dá)明顯升高(P<0.05)。同樣,與WT組相比,在海馬組織中各月齡Tg組小鼠TREM2的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。經(jīng)SY治療后,3、9月齡SY組小鼠TREM2的表達(dá)水平出現(xiàn)升高趨勢,6月齡SY組小鼠TREM2的表達(dá)水平則明顯升高(P<0.05)。

2.5 SY對不同月齡小鼠腦組織中iNOS/Arg-1蛋白表達(dá)水平的影響iNOS和Arg-1通常分別被認(rèn)為是M1和M2極化的標(biāo)志性蛋白。如Fig 4所示,與WT組相比,在各月齡Tg組小鼠的皮層組織中,3月齡小鼠iNOS的表達(dá)水平有升高的趨勢,Arg-1的表達(dá)水平有降低的趨勢;6、9月齡Tg組的小鼠iNOS的表達(dá)水平明顯升高,Arg-1的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。在海馬組織中,各月齡Tg組小鼠iNOS的表達(dá)水平明顯升高,Arg-1的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。SY明顯降低了3月齡小鼠海馬及6月齡小鼠腦組織中iNOS的蛋白表達(dá),提高了Arg-1蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。9月齡SY組小鼠iNOS/Arg-1蛋白的表達(dá)水平僅有降低/升高的趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 SY 降低了不同月齡小鼠腦組織中TLR4及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平TLR4信號會激活NF-κB通路并釋放炎癥介質(zhì),導(dǎo)致大腦中的炎癥反應(yīng),并加快AD疾病進(jìn)程。如Fig 5所示,與WT組相比,各月齡Tg組的皮層區(qū)域TLR4的表達(dá)水平有增加的趨勢,海馬中TLR4的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。各月齡SY組小鼠皮層組織中TLR4的表達(dá)水平均呈現(xiàn)下降的趨勢,海馬組織中TLR4蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05,P<0.01)。在皮層組織中,p-NF-κB p65/NF-κB p65的表達(dá)水平在3、9月齡Tg組小鼠中升高,在6月齡Tg組小鼠中明顯升高(P<0.05)。在海馬組織中,各月齡Tg組小鼠p-NF-κB p65/NF-κB p65的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),SY有效降低了6月齡APP/PS1小鼠p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。

Fig 3 Western blot detection of TREM2 protein expression in brain tissue of mice at different months of #P<0.05 vs WT group; *P<0.05 vs Tg group.

Fig 4 SY reduced expression of iNOS protein and induces Arg protein expression in brain tissue of mice at different months of #P<0.05 vs WT group;*P<0.05 vs Tg group.

Fig 5 Western blot detection of TLR4/NF-κB pathway-related protein expression in brain tissue of mice at different months of #P<0.05 vs WT group; *P<0.05, **P<0.01 vs Tg group.

3 討論

AD是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,認(rèn)知功能伴隨著病程的進(jìn)展而逐漸下降。APP/PS1小鼠能夠?qū)D相關(guān)的人類突變基因APPswe和PSEN1de9轉(zhuǎn)移至小鼠體內(nèi),使其表現(xiàn)出與AD患者相似的病理特征,很好地模擬AD疾病進(jìn)展[9]。

研究表明,APP/PS1小鼠在6個月大時出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶缺陷,并隨著年齡的增長逐步加重[10]。在Morris水迷宮實驗中,與不同月齡WT組相比,3、6、9月齡Tg組小鼠逃避潛伏期和首次穿越平臺的時間均延長,而穿越平臺次數(shù)減少,說明3月齡APP/PS1小鼠歷經(jīng)3個月后,學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)損傷,并隨著月齡增加而加重。SY對3月齡小鼠長期學(xué)習(xí)記憶有一定的改善效果,但明顯提高了6、9月齡小鼠的長期學(xué)習(xí)記憶能力。在跳臺實驗中,SY對3月齡小鼠短期學(xué)習(xí)能力的改善并不理想,對6、9月齡小鼠的短期學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用。行為學(xué)實驗表明6月齡可能是SY提高APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的最佳時期,可能是由于3月齡小鼠處于疾病早期,而9月齡小鼠已處于AD重度病理階段。

MG是一種特殊的吞噬細(xì)胞,分布于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng),是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要類型之一[11]。MG對神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)作用與其活化表型密切相關(guān)。目前將激活的MG分為兩種表型:M1型為經(jīng)典活化狀態(tài),介導(dǎo)MG向淀粉樣斑塊遷移和聚集,同時釋放炎性因子,如iNOS、IL-1β、IL-6等,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng);M2型為“交替激活”狀態(tài),通過釋放抗炎因子如Arg-1、IL-4、TGF-β等,促進(jìn)組織修復(fù)[12-13]。MG的M1/M2表型僅代表炎癥反應(yīng)的兩種狀態(tài),并非獨立存在,而是可以相互轉(zhuǎn)化。研究表明,調(diào)節(jié)MG從M1型轉(zhuǎn)化為M2型,有助于減少Aβ的產(chǎn)生,促進(jìn)Aβ的清除,減少炎性因子的釋放,從而改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能障礙[14]。TREM2在MG中高度表達(dá),同時TREM2 在促進(jìn)MG表型轉(zhuǎn)化方面起著至關(guān)重要的作用。研究表明,敲除BV-2細(xì)胞中的TREM2基因會抑制M2型MG的表達(dá),并誘導(dǎo)M1型表達(dá)增加,增加炎癥反應(yīng),而TREM2 的過表達(dá)減輕MG炎癥[15]。因此,調(diào)節(jié)MG表型轉(zhuǎn)變有助于減輕炎癥反應(yīng),延緩AD進(jìn)展。在本研究中,SY明顯下調(diào)了6、9月齡小鼠IL-6表達(dá)水平,明顯增加了6月齡小鼠 TGF-β1的含量。而SY對炎癥因子的調(diào)節(jié)是否與MG的表型轉(zhuǎn)化有關(guān)?因此,重點研究SY在調(diào)節(jié)不同月齡小鼠MG極化中的作用。結(jié)果表明各月齡APP/PS1小鼠海馬中iNOS的表達(dá)水平明顯升高,Arg-1和TREM2的表達(dá)水平明顯下調(diào),表明各月齡APP/PS1小鼠M1型MG表達(dá)增加。SY明顯降低了6月齡小鼠腦組織和3月齡小鼠海馬中iNOS的表達(dá)水平,上調(diào)了Arg-1和TREM2的表達(dá)水平。因此,SY可能通過提高TREM2的表達(dá)水平,促進(jìn)MG表型轉(zhuǎn)化進(jìn)一步調(diào)節(jié)炎癥因子的水平。

NF-κB在炎癥、免疫和細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用,TLR4介導(dǎo)的NF-κB激活是引起促炎介質(zhì)表達(dá)的關(guān)鍵因素。TLR4誘導(dǎo)IκB-α的磷酸化和降解,導(dǎo)致NF-κB與IκB解離,釋放NF-κB p65易位進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)一步與相關(guān)炎癥因子的DNA結(jié)合,刺激各種靶基因的轉(zhuǎn)錄,引起炎癥反應(yīng)[16-17]。研究表明,TLR4抑制劑可以通過抑制MyD88/NF-κB/NLRP3激活,逆轉(zhuǎn)MG表型,減少Aβ沉積,減輕APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的腦損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn),TLR4在各月齡APP/PS1小鼠海馬中的表達(dá)水平明顯升高,這進(jìn)一步導(dǎo)致了各月齡小鼠海馬中p-NF-κB p65/NF-κB p65的表達(dá)水平升高。經(jīng)SY治療后,3、6、9月齡APP/PS1小鼠海馬中TLR4蛋白表達(dá)水平明顯降低,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平僅在6月齡小鼠海馬中明顯下調(diào)。因此,SY對各月齡小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用與其抑制TLR4/NF-κB通路激活,促進(jìn)MG活化表型轉(zhuǎn)化以及減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

綜上所述,SY能提高3、6、9月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,綜合比較發(fā)現(xiàn)SY對6月齡 APP/PS1小鼠的整體改善效果最佳。此外,SY可以調(diào)節(jié)MG由M1型向M2型轉(zhuǎn)化,并通過抑制TLR4-NFκB信號通路的激活和調(diào)節(jié)炎癥因子的水平來減輕慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。